Summary
Nous présentons un protocole pour isoler des fragments microvasculaires du tissu adipeux dérivé qui représentent des unités de vascularisation prometteuses. Ils peuvent être isolés rapidement, ne nécessitent pas dans le traitement in vitro et, par conséquent, peut être utilisé pour prévascularisation une étape dans différents domaines de l' ingénierie tissulaire.
Abstract
Un réseau microvasculaire fonctionnelle est d'une importance cruciale pour la survie et l'intégration des constructions de tissu d'ingénierie. A cet effet, plusieurs stratégies angiogéniques et prévascularisation ont été mis en place. Cependant, la plupart des approches basées sur les cellules comprennent chronophages étapes in vitro pour la formation d'un réseau microvasculaire. , Ils ne sont donc pas adaptés pour peropératoires procédures en une seule étape. fragments microvasculaires adipeuses dérivées de tissu (ad MVF) représentent des unités de vascularisation prometteuses. Ils peuvent facilement être isolées à partir de tissu adipeux et présentent une morphologie fonctionnelle microvaisseaux. De plus, ils réassembler rapidement dans de nouveaux réseaux microvasculaires après l' implantation in vivo. En outre, ad-MVF ont été montré pour induire lymphangiogenèse. Enfin, ils sont une riche source de cellules souches mésenchymateuses, qui peut en outre contribuer à leur fort potentiel de vascularisation. Dans des études précédentes, nous avons démontré la vascularizati remarquablesur la capacité d'ad-MVF dans l'os d'ingénierie et de substituts cutanés. Dans la présente étude, nous présentons un protocole standardisé pour l'isolement enzymatique ad-MVF de tissu adipeux de souris.
Introduction
L' ingénierie tissulaire se concentre sur la fabrication de produits de remplacement de tissus et d' organes qui maintenir, rétablir ou d' augmenter la fonction des inopérable homologues in vivo 1, 2. Le sort des constructions de l' ingénierie tissulaire dépend essentiellement d' une vascularisation adéquate 3. Réseaux microvasculaires au sein de ces constructions doivent être organisés hiérarchiquement avec artérioles, capillaires et veinules pour permettre la perfusion sanguine efficace après anastomose à la vasculature du bénéficiaire 4. La génération de ces réseaux est parmi les principaux défis dans l'ingénierie tissulaire. A cet effet, un large éventail de stratégies de revascularisation expérimentales a été mis en place au cours des deux dernières décennies , 5, 6.
approches angiogéniques stimulent la croissance interne des microvaisseaux bénéficiaires dans Tiss d'ingénierieues par des moyens de modification de structure d'échafaudage ou physico - chimique, telles que l'incorporation de facteurs de croissance 7. Toutefois, pour les grandes constructions de vascularisation en trois dimensions, des stratégies dépendant de l' angiogenèse sont nettement limités par des taux de croissance lente de développement microvaisseaux 8.
Au contraire, le concept de prévascularisation vise pour la génération des réseaux microvasculaires fonctionnelles au sein des constructions de tissus avant leur implantation 9. Prévascularisation classique implique la co-culture de cellules de formation de vaisseaux, comme les cellules endothéliales, les cellules murales ou des cellules souches 10, à l' intérieur des échafaudages. Après la formation du réseau microvasculaire, les constructions prévascularisées peuvent alors être implantés dans des défauts du tissu. Il convient de noter, cette approche prévascularisation est difficile à appliquer dans un contexte clinique, car elle est basée sur in vitro complexe et prend du temps </ em> procédures, qui sont limitées par les principaux obstacles réglementaires 9. Par conséquent, il y a encore un besoin pour le développement de nouvelles stratégies de prévascularisation qui sont plus appropriés pour une large application clinique.
Une telle stratégie de prévascularisation peut être l'application des dérivées de tissu adipeux fragments microvasculaires (ad-MVF). ad-MVF représentent des unités de vascularisation puissants qui peuvent être récoltées en grandes quantités dans le tissu adipeux des rats 11, 12 et 13 les souris. Ils se composent d'artérioles, capillaires et veinules segments de vaisseaux, qui présentent une morphologie de microvaisseaux physiologique avec une lumière et de stabilisation des cellules périvasculaires 14, 15. Cette caractéristique unique permet l'implantation immédiate des échafauds ad MVF tête de série dans les défauts des tissus sans préculture. Là-bas, l'annonce-MVF réassembler rapidementà des réseaux microvasculaires fonctionnelles. Par ailleurs, ad-MVF représentent une riche source de cellules souches mésenchymateuses 16, ce qui peut contribuer en outre à leur capacité de régénération frappant. Par conséquent, ad-MVF sont de plus en plus utilisé dans différents domaines de l' ingénierie tissulaire 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
L'isolement de l' ad-MVF a été initialement mis en place chez les rats 11, 12. Nous décrivons ici un protocole qui permet l'isolement normalisé ad-MVF de souris à partir de tampons de graisse épididyme. Cela peut fournir de nouvelles informations sur les mécanismes moléculaires sous-jacents fonction ad-MVF en utilisant des modèles de souris transgéniques.
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Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées selon l'Institut national des directives de santé pour l'utilisation des animaux de laboratoire et ont suivi les directives institutionnelles (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Sarrebruck, Allemagne).
1. Préparation des instruments chirurgicaux
- Tenir prêt les ciseaux de dissection, des pinces chirurgicales, des petits ciseaux de préparation, une pince fine et une boîte de Pétri stérile avec un milieu de Eagle modifié par 15 mL Dulbecco (DMEM, 10% de sérum de veau foetal (SVF), 100 U / ml de pénicilline, 0,1 mg / mL de streptomycine ) pour la récolte coussinets adipeux épididyme.
- Exposer les instruments chirurgicaux à une solution désinfectante pendant 5 min. En variante, les stériliser (stérilisation à la vapeur, 121 ° C, 20 min).
2. Les animaux et anesthésie
- Choisissez avec soin la souche des souris comme indiqué pour l'étude et la sujet à l'étude.
NOTE: Dans cette étude, nous avons utilisé des hommes de type sauvage C57BL / 6 comme donneurs pour la récolte de la graisse épididyme. D' un intérêt, ad-MVF peut également être isolé à partir de la protéine fluorescente verte transgéniques (GFP) animaux donneurs -positif (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / j) 22. Cela porte un grand avantage, les fragments sont facilement détectables par coloration immunohistochimique de la GFP après implantation dans les souris de type sauvage GFP-négative 14. - Anesthésier les animaux avec une injection intrapéritonéale de xylazine (15 mg / kg) et de la kétamine (75 mg / kg). Assurez-vous que les animaux sont profondément anesthésiés en effectuant une pincée de pied sans réponse. lubrifiant oculaire n'est pas indiqué que les animaux donneurs sont sacrifiés après la récolte de matières grasses.
REMARQUE: Assurez-vous que l'analgésie et la stérilité chirurgicale sont en accord avec les directives respectives du pays et de l'institution où les expériences sont prévues.
- Transfert de l'animal à une table d'opération. Placez l'animal dans une position couchée sous une loupe binoculaire chirurgicale et confirmer l'anesthésie profonde à l'aide pincement de l'orteil.
- Immobiliser les pattes en les collant à un drap chirurgical et désinfecter l'abdomen avec une solution de désinfection.
- Séparer la peau abdominale libre de la couche musculaire sous-jacent avec les ciseaux de dissection.
- Effectuer une laparotomie médiane avec des ciseaux de dissection et dérouler latéralement les rabats de la paroi abdominale.
- Bilatéralement identifier les testicules, l' épididyme et le coussinet adipeux épididymaire à l' aide des pinces fines (Figure 1). Ne pas nuire aux structures intestinales pour prévenir la contamination fécale des tampons de graisse.
- Récolter les coussinets adipeux de l'épididyme avec les petits ciseaux de préparation et la pince fine sous la loupe binoculaire. Gardez une marge de sécurité de plusieurs mm entre les épididyme et la graisseréduire le risque de récolte épididymaire accidentelle.
NOTE: Cette procédure peut également être effectuée sans stéréomicroscope. Cependant, cela peut également augmenter le risque de blessure accidentelle des épididyme et cordons spermatiques. - Transférer les coussinets adipeux épididymaire dans une boîte de Petri contenant 15 ml de DMEM préchauffé à 37 ° C pendant le transport vers le laboratoire de la cellule.
- Sacrifier l'animal par une incision de l'aorte abdominale ou dislocation cervicale.
4. Isolation ad-MVF
- Préparer trois boîtes de Petri stériles de 15 mL de tubes solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile en polypropylène de 14 ml (PP), un flacon d'Erlenmeyer de 50 ml stérile, des tubes stériles à centrifuger conique de 1,5 ml et de ciseaux fins stérilisés.
- Laver les coussinets adipeux trois fois dans des boîtes de Petri avec 15 ml de PBS sous une hotte à flux laminaire.
- Transférer la graisse dans un tube de 14 ml PP. Déterminer le volume de tissu adipeux récolté (en ml) au moyen de til échelle du tube. Hacher le tissu adipeux mécaniquement avec les ciseaux fins jusqu'à obtention d'une suspension homogène de tissu.
- Transférer le tissu haché avec deux volumes de collagénase NB4G (0,5 U / ml de PBS) dans un flacon Erlenmeyer de 50 ml à l'aide d'une pipette de mesure de 10 ml. Le volume total est trois fois le volume de tissu adipeux mesurée à l'étape 4.3. Effectuer la digestion de tissu dans un incubateur pendant 10 min sous agitation vigoureuse au moyen d'un agitateur automatique (taille de la barre d'agitation magnétique: 25 mm) dans des conditions atmosphériques 37 ° C et humidifié avec 5% de CO 2.
- Observez une petite fraction (10 pi) du tissu digérées au microscope pour déterminer si la digestion peut être arrêté. Vérifier que le digestat contient principalement ad-MVF « libre » à côté de cellules individuelles, ce qui indique l'endroit approprié pour arrêter le processus de digestion enzymatique (figure 2).
REMARQUE: Cette étape nécessite de l'expérience et la procédure est essentielle pour la qualitéde isolé ad-MVF. digestion prolongée graisse entraîne une suspension unicellulaire sans ad MVF. - Neutraliser l'enzyme avec deux volumes de PBS / 20% de FCS. Le volume total est trois fois le volume de la suspension cellulaire des vaisseaux à l'étape 4.4. Transférer la suspension cellulaire navire retour dans de nouveaux tubes en PP.
- Incuber la suspension pendant 5 min à 37 ° C et ad-MVF séparer de la graisse restant par gravité. Ensuite, retirez soigneusement le surnageant principal de la graisse avec une pipette de précision 1 ml. Répétez plusieurs fois ce cycle avec une pipette de précision de 100 pi jusqu'à ce que la suspension semble être sans gras.
- Mettre un filtre de 500 um au sommet d'un tube de centrifugation conique de 50 ml. Transférer la suspension cellulaire navire avec une pipette de mesure de 10 ml dans les tubes de 14 mL PP sur la membrane de filtre pour éliminer les caillots restant gras. Transférer la suspension filtrée dans de nouveaux tubes de 14 ml PP en fonction du nombre d'ad-MVF isolats individuels pour les expériences prévues.
REMARQUE: Pour en Vitrdosages o centrés sur la formation du réseau microvasculaire, il peut être avantageux de purifier davantage la suspension de cellules-récipient pour améliorer la qualité de formation d'image lors d' analyses microscopiques. A cet effet, la suspension peut être filtrée une fois de plus avec un filtre de 20 um pour éliminer les cellules individuelles de l'ad-MVF collectées sur le filtre. - Centrifuger la suspension cellulaire navire (600 xg, 5 min, température ambiante) pour obtenir un culot contenant ad-MVF.
- Après centrifugation, éliminer le surnageant jusqu'à 1 ml reste. Remettre en suspension le culot avec ad-MVF dans ce 1 mL et transférer la suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml conique.
- Centrifuger la suspension ad-MVF dans le tube de microcentrifugeuse (600 xg, 5 min) pour obtenir un culot.
- Retirer le surnageant pour remettre en suspension le culot dans le volume final requis de PBS / 20% de FCS.
NOTE: Le nombre d'ad-MVF par isolat peut être évaluée par comptage microscopique. A cet effet, 1/10 de la dernière cellule-Vessesuspension de l est dilué 1:10 dans du PBS et 100 ul de cette dilution sont transférés dans un puits d'une plaque à 96 puits. Le nombre total de ad-MVF présentant une morphologie de type vaisseau est ensuite compté et extrapolée à l'ensemble isolat. La concentration ad-MVF requis et la purification peuvent être adaptés individuellement aux in vitro ou dans la demande respective vivo de l'ad-MVF. Cela peut comprendre l'incorporation d'ad-MVF dans des gels de collagène pour l'analyse in vitro de la formation de réseau microvasculaire ou l'ensemencement du ad-MVF sur des échafaudages pour l' implantation in vivo dans des défauts du tissu.
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Representative Results
Dans la présente étude, nous avons effectué six procédures d'isolement ad MVF avec le tissu adipeux de 7 à 12 mois vieux mâle de type sauvage C57BL / 6 souris (poids corporel moyen: 35 ± 1 g). La figure 1 illustre la récolte des plaquettes murines de graisse épididymaire avec l' isolation ad-MVF mécanique et enzymatique subséquente. Le temps nécessaire à la récolte de matières grasses était de 30 minutes et pour l'isolement des ad-MVF était de 120 min. Au total, la procédure a pris 150 min.
Nous avons récolté 1,2 ± 0,1 ml de tissu adipeux par animal donneur. Cette quantité de graisse a permis l'isolement de 42 000 ± 2 000 ad MVF par ml. La longueur moyenne de la isolée ad-MVF était de 42 ± 1 pm (Figure 2A). La durée de la digestion enzymatique a été déterminée au moyen d' un contrôle microscopique , comme indiqué sur la figure 2B. ad-MVF présentait une morphologie typique microvaisseaux avec Ves hiérarchiquessegments de sel (figure 2C).
Nous avons en outre caractérisé l'ad-MVF au moyen d'une cytométrie de flux. A cet effet, ad-MVF ont encore été digéré dans une solution de détachement cellulaire pendant 30 min dans les cellules individuelles 15. La cytométrie de flux analyses ont révélé que ad-MVF contient 26 ± 2% CD31-positives des cellules endotheliales, 17 ± 2% α-actine de muscle lisse (SMA) des cellules positives à périvasculaires et 9 ± cellules de 1% positives pour le marqueur de cellule souche mésenchymateuse CD117 (figure 3A-C). Après l' ensemencement sur un substitut de la peau par voie cutanée, qui a été fixé et sectionné immédiatement pour des analyses histologiques, plus ad-MVF étaient principalement localisés sur la surface de l'implant (Figure 3D). Cependant, les segments de vaisseaux capillaires peuvent également être détectés dans ses pores. La coloration immunohistochimique ad-MVF tête de série a également révélé la configuration de microvaisseaux physiologique avec artérioles, veinuleset des fragments de type capillaire (Figure 3E).
Figure 1: ad-MVF Isolation. A) Après laparotomie médiane, les plaquettes de graisse épididyme (astérisques) sont identifiés. Le tissu adipeux est récolté avec de petits ciseaux de préparation et l'animal est sacrifié par incision de l'aorte abdominale (tête de flèche). B) hachoir mécanique des coussinets adipeux avec des ciseaux fins jusqu'à ce que la suspension de tissu apparaît homogène. C) Pour la digestion enzymatique, la collagénase est ajouté à la suspension de tissu. D) La suspension-récipient de cellule est mis en incubation et la couche de graisse du surnageant est éliminé. E) Après centrifugation, on remet en suspension et peut être utilisé le culot contenant ad-MVF pour différentes applications, telles que l'analyse in vitro de Microvascformation d' un réseau ular ou l'ensemencement du ad-MVF sur des échafaudages pour l' implantation in vivo dans des défauts de tissu (F). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Caractéristiques des annonces morphologiques-MVF. A) Distribution des longueurs ad-MVF fraîchement isolé. ± erreur moyenne standard de la moyenne (n = 6). B) l' image microscopique d'un frottis de suspension de récipient de cellule avec une grande (flèche), moyennes (flèches doubles) et de petites pointes de flèches noires () ad-MVF ainsi que des cellules simples (têtes de flèches blanches). Barre d'échelle = 110 um. Plus fort grossissement révèle que la pièce ad-MVF une morphologie microvaisseaux mature avec des segments de microvaisseaux hiérarchique (C,
Figure 3: cytométrie en flux, et anatomopathologique immunohistochimie Caractéristiques des ad-MVF. AC) analyse cytométrique en flux d'ad-MVF illustrant cellules endotheliales CD31-positives fraîchement isolées (A), les fractions α-SMA-positives cellules périvasculaires (B) et de la cellule CD117 positives souches mésenchymateuses (C). Appropriés contrôles isotypiques identiques ont été utilisés pour ajuster les niveaux de seuil. ± erreur moyenne standard de la moyenne (n = 6). D) hématoxyline et éosine-section colorée d'un substitut cutané dermique graines. Quelques segments de vaisseaux capillaires sont situés dans l'implant &# 39; les pores (pointes de flèche). Grandes microvaisseaux avec une morphologie veinules (double flèche) ou artériolaire (flèche) sont localisés à sa surface. Barre d'échelle = 40 pm. Ligne brisée = frontière implant. E) Caractérisation des ad-MVF par détection immunohistochimique du marqueur de cellules endotheliales CD31 ( en rouge) et le marqueur de cellules périvasculaires α-SMA (vert). Les noyaux cellulaires ont été colorés avec un colorant fluorescent se liant à l'ADN (bleu). Artériolaire ad-MVF (flèche) sont caractérisés par une épaisse couche de cellules α-SMA-positives par rapport aux veinules fragments avec une lumière de plus grandes (double flèche). = Capillaire ad pointes de flèche-MVF. Barre d'échelle = 25 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Dans cette étude, nous présentons un protocole bien établi pour l'isolement des ad-MVF. L'obtention ad-MVF du tissu adipeux de souris est une procédure simple avec quelques étapes critiques. Les souris présentent différents dépôts de graisse sous-cutanée et intra-abdominales. Comme précédemment décrit pour les rats, la source de matières grasses la plus appropriée pour l'isolement de l' ad-MVF sont les coussinets adipeux épididymaire en raison de leur taille, de structure homogène et une contamination minimale avec de plus grands vaisseaux sanguins 11, 12. En revanche, les dépôts de graisse sous-cutanée chez les souris sont beaucoup plus petits et plus adhérente aux tissus environnants. Cependant, l'excision des coussinets adipeux de l'épididyme porte le risque de blessure accidentelle des épididyme et cordons spermatiques, ce qui entraîne une contamination du tissu récolté avec spermes. Par conséquent, l'identification des épididyme, et testiculaire cordons spermatiques est d'une grande importance dans cette procédure. De plus, les tampons de graisse doivent être rapidly traité après la récolte pour minimiser les dommages aux tissus ex vivo. Enfin, il faut considérer qu'il existe des variations importantes liées à l' âge dans la vascularisation des coussinets adipeux de l' épididyme de souris 23. Dans notre expérience, l'utilisation de 6- âgés de 12 mois à des souris mâles donneurs fournit des quantités suffisantes d'ad MVF pour in vitro et in vivo. Cependant, il peut également être possible d'isoler ad MVF de souris plus jeunes, qui présentent de plus petites mais coussinets de graisse très vascularisées 24.
La digestion enzymatique des tampons de graisse épididyme récoltés détermine fondamentalement la qualité finale ad-MVF isolé. exposition trop courte pour collagénase conduit à une séparation incomplète des ad-MVF de adipocytes environnantes. D'autre part, les résultats de la digestion prolongée dans la destruction de ad-MVF à une suspension cellulaire unique, la fraction dite vasculaire stromale (SVF). Le SVF est une population cellulaire hétérogène contenant mLes cellules souches esenchymal, les cellules endothéliales, péricytes, les macrophages et beaucoup d' autres types de cellules ayant un potentiel de régénération grâce à des mécanismes paracrines et de différenciation 25. L'utilisation d'ad-MVF présente des avantages considérables par rapport aux approches fondées sur SVF. La morphologie des microvaisseaux entièrement fonctionnelle ad-MVF permet leur implantation immédiate pour des expériences in vivo sans temps et complexe culture in vitro. De plus, l'isolement de la FSV nécessite habituellement la digestion du tissu avec de la collagénase jusqu'à 90 min 26. En revanche, la dégradation des tissus ne doit pas dépasser 10 minutes pour l'isolement des ad-MVF. Cela soutient l'idée d'applications peropératoires une étape de ad-MVF 9. A cet effet, ad-MVF peut être automatiquement isolé de lipoaspirates autologues et transféré dans un défaut de tissu du patient sans quitter la salle d'opération. Ceci est un goa réalistel considérant le fait que l'isolement automatique de SVF de lipoaspirates est déjà établi une procédure clinique dans la chirurgie plastique 27, 28, 29.
Récemment, nous avons fait preuve d' un fort effet de ad-MVF in vivo sur la vascularisation de l' os 14 et 15 peau substituts. D'intérêt, nous avons constaté qu'il est avantageux de ne pas éliminer les cellules individuelles de l'ad-MVF isoler, car ils peuvent fournir un environnement plus physiologique qui contribue à la grande capacité de vascularisation ad-MVF 13. Par conséquent, nous avons seulement utilisé un filtre de 500 um pendant l'isolement de ad MVF pour l'élimination des caillots plus gros graisse non digéré. De plus, nous avons constaté que ad-MVF induisent lymphangiogenèse dans la peau implantée remplace 15. Par conséquent, ad-MVF peut également être prometteur blocs de construction pour lymphatIC ingénierie tissulaire et la thérapie de lymphoedème.
Pour la traduction réussie de ces résultats expérimentaux dans la pratique clinique, la prochaine étape logique est de préciser si le tissu adipeux humain est également adapté pour l'isolement de ad MVF sous forme de graisse de rongeurs. Dans ce contexte, une question essentielle est la quantité de graisse nécessaire pour isoler de grandes quantités d'ad-MVF. Le protocole décrit ici a donné lieu à environ 40 000 ad MVF par ml tissu adipeux. En conséquence, 3 mL tissu adipeux serait nécessaire de prevascularize 1 cm 2 de substitut de peau dermique 15. Par conséquent, cette approche peut ne pas être possible pour le traitement des grandes blessures ou des patients gravement malades en raison d'une quantité limitée de tissu adipeux disponible pour l'isolation ad MVF.
À côté d' un large éventail de possibilités pour des applications in vivo chez l' ingénierie tissulaire et la médecine régénérative, ad-MVF sont également appropriés pour la modélisation in vitro de proc angiogéniqueesses. Par exemple, ad-MVF rat ont été cultivées en trois dimensions hydrogels de collagène pour étudier la formation de nouveaux réseaux microvasculaires 30. Des approches similaires ont été utilisées pour évaluer les techniques d'imagerie sophistiquées pour la visualisation de la croissance de néovaisseaux 13 ou remodelage de la matrice interstitielle au cours de l' angiogenèse 31.
Pris ensemble, ces résultats indiquent que ad-MVF sont non seulement prometteurs et unités lymphangiogéniques vascularisation des stratégies thérapeutiques futures, mais aussi pour la recherche fondamentale dans le domaine de l'angiogenèse et de la physiologie vasculaire.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants pour l'excellente assistance technique de Janine Becker, Caroline Bickelmann et Ruth Nickels. Cette étude a été financée par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Fondation allemande pour la recherche) - LA 2682 / 7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
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