Summary
Vi presentiamo un protocollo per isolare frammenti adiposo microvascolari derivate dal tessuto che rappresentano le unità di vascolarizzazione promettenti. Possono essere isolati rapidamente, non richiedono l'elaborazione in vitro e, pertanto, può essere utilizzato per un passo prevascularization in diversi campi dell'ingegneria dei tessuti.
Abstract
Una rete microvascolare funzionale è di importanza fondamentale per la sopravvivenza e l'integrazione dei costrutti ingegneria tessutale. A questo scopo, sono state stabilite diverse strategie angiogenici e prevascularization. Tuttavia, la maggior parte degli approcci basati su celle includono passi in termini di tempo in vitro per la formazione di una rete microvascolare. Quindi, essi non sono adatti per intraoperatori procedure one-step. Adiposo derivate dal tessuto frammenti microvascolari (ad-MVF) rappresentano le unità vascolarizzazione promettenti. Essi possono essere facilmente isolati dal tessuto grasso e presentano una morfologia microvasi funzionale. Inoltre, essi rapidamente rimontare in nuove reti microvascolari dopo l'impianto in vivo. Inoltre, ad-DMV hanno dimostrato di indurre linfangiogenesi. Infine, sono una ricca fonte di cellule staminali mesenchimali, che possono ulteriormente contribuire alla loro elevato potenziale di vascolarizzazione. In studi precedenti abbiamo dimostrato la notevole vascularizatisulla capacità di ad-MVF in sostituti ossei e cutanei ingegnerizzati. Nel presente studio, riportiamo un protocollo standardizzato per l'isolamento enzimatica di ad-DMV da tessuto adiposo murino.
Introduction
Ingegneria tissutale si concentra sulla fabbricazione di tessuti e organi succedanei mantenere, ripristinare o aumentare la funzione di inutilizzabile in vivo controparti 1, 2. Il destino di costrutti di tessuto ingegnerizzati dipende essenzialmente una vascolarizzazione adeguata 3. Reti microvascolari all'interno di questi costrutti dovrebbero essere organizzati gerarchicamente con arteriole, capillari e venule per consentire efficiente perfusione sanguigna dopo inosculation alla vascolarizzazione del destinatario 4. La generazione di queste reti è tra le principali sfide nel campo dell'ingegneria dei tessuti. A tale scopo, un ampio spettro di strategie di vascolarizzazione sperimentali è stata introdotta nel corso degli ultimi due decenni 5, 6.
approcci angiogenici stimolano la crescita interna dei microvasi dei destinatari nel tiss ingegnerizzatiues mediante modificazione ponteggio strutturale o fisico-chimiche, come ad esempio l'incorporazione di fattori di crescita 7. Tuttavia, per la vascolarizzazione di grandi costrutti tridimensionali, le strategie di angiogenesi-dipendenti sono notevolmente limitate da tassi di crescita lenta di sviluppo di microvasi 8.
Al contrario, il concetto di prevascularization mira per la generazione di reti microvascolari funzionali all'interno del tessuto costruisce prima del loro impianto 9. Prevascularization convenzionale comporta la co-coltura delle cellule del vaso che formano, come le cellule endoteliali, cellule murali o cellule staminali 10, all'interno ponteggi. Dopo la formazione della rete microvascolare, i costrutti prevascularized possono essere impiantati in difetti del tessuto. Degno di nota, questo approccio prevascularization è di difficile applicazione in un ambiente clinico, perché si basa sulla complessa e richiede molto tempo in vitro </ em> le procedure, che sono limitati dai maggiori ostacoli normativi 9. Di conseguenza, v'è ancora una necessità per lo sviluppo di strategie prevascularization nuovi che sono più adatti per un'ampia applicazione clinica.
Tale strategia prevascularization può essere l'applicazione di frammenti di tessuto adiposo derivate microvascolari (ad-MVF). ad-MVF rappresentano le unità di vascolarizzazione potenti che possono essere raccolti in grandi quantità dal tessuto adiposo dei ratti 11, 12 e 13 topi. Sono costituiti da arteriolare, capillare e segmenti di flotta venulari, che presentano una morfologia microrecipiente fisiologico con un lume e stabilizzanti cellule perivascolari 14, 15. Questa caratteristica unica permette l'inserimento immediato di ponteggi ad-MVF-seminato in difetti del tessuto, senza precoltura. C'è, l'annuncio-DMV rapidamente rimontare inalle reti microvascolari funzionali. Inoltre, ad-DMV rappresentano una ricca fonte di cellule staminali mesenchimali 16, che possono inoltre contribuire alla loro capacità rigenerativa sorprendente. Di conseguenza, ad-DMV sono sempre più utilizzati in diversi campi dell'ingegneria dei tessuti 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
L'isolamento di ad-DMV è stato originariamente istituito nel ratti 11, 12. Qui, descriviamo un protocollo, che permette l'isolamento standardizzato di murino ad-DMV da cuscinetti di grasso dell'epididimo. Ciò può fornire ulteriori informazioni sui meccanismi molecolari alla base della funzione ad-DMV utilizzando modelli di topi transgenici.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite secondo l'Istituto Nazionale di Salute linee guida per l'uso di animali da laboratorio e hanno seguito le linee guida istituzionali (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und di veterinaria, Zentralstelle, Saarbrücken, Germania).
1. Preparazione di strumenti chirurgici
- Tenere pronte le forbici dissezione, pinze chirurgiche, forbici preparazione piccole pinza sottile e una piastra di Petri sterile con terreno Eagle modificato da 15 mL Dulbecco (DMEM, 10% siero di vitello fetale (FCS), 100 U / ml di penicillina, 0,1 mg / mL di streptomicina ) per la raccolta cuscinetti di grasso dell'epididimo.
- Esporre gli strumenti chirurgici per una soluzione disinfettante per 5 min. In alternativa, sterilizzarli (sterilizzazione a vapore; 121 ° C, 20 min).
2. Gli animali e l'anestesia
- Scegli con attenzione il ceppo di topi come indicato per lo studio e la soggetto sotto indagine.
NOTA: In questo studio abbiamo utilizzato maschio wild-type C57BL 6 topi / come donatori per la raccolta dei grassi dell'epididimo. Di interesse, ad-DMV può essere isolato anche da transgenici proteina fluorescente verde (GFP) animali donatori -positive (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. Questo porta il grande vantaggio che i frammenti sono facilmente individuabili dalla colorazione immunoistochimica di GFP dopo l'impianto in topi wild-type GFP-negativi 14. - Anestetizzare gli animali con un'iniezione intraperitoneale di xilazina (15 mg / kg) e ketamina (75 mg / kg). Assicurarsi che gli animali sono profondamente anestetizzati eseguendo un pizzico piedi con nessuna risposta. lubrificante occhio non è indicata come animali donatori vengono sacrificati dopo la raccolta grasso.
NOTA: Assicurarsi che l'analgesia e la sterilità chirurgica sono in accordo con le rispettive linee guida del paese e istituzione in cui sono previsti gli esperimenti.
- Trasferire l'animale ad un tavolo operatorio. Posto l'animale in posizione supina allo stereomicroscopio chirurgica e confermare anestesia profonda con punta pizzico.
- Immobilizzare lo zampe da loro nastratura ad un telo chirurgico e disinfettare l'addome con soluzione disinfettante.
- Separare la pelle addominale libera dello strato muscolare sottostante con le forbici dissezione.
- Eseguire una laparotomia mediana con le forbici dissezione e lateralmente spiegare i lembi della parete addominale.
- Bilateralmente identificare testicolo, epididimo e il cuscinetto adiposo dell'epididimo base alle pinza sottile (Figura 1). Non danneggiare le strutture intestinali per evitare la contaminazione fecale delle cuscinetti adiposi.
- Raccogliere i cuscinetti adiposi dell'epididimo con le forbici piccole di preparazione e le pinza sottile allo stereomicroscopio. Mantenere un margine di sicurezza di diversi mm tra l'epididimo e il grasso perridurre il rischio di accidentali raccolta dell'epididimo.
NOTA: Questa procedura può essere eseguita anche senza uno stereomicroscopio. Tuttavia, questo può aumentare ulteriormente il rischio di lesioni accidentali dell'epididimo e corde spermatiche. - Trasferire i cuscinetti adiposi dell'epididimo in una capsula Petri contenente 15 ml di DMEM preriscaldato a 37 ° C per il trasporto al laboratorio cella.
- Sacrificare l'animale tramite incisione dell'aorta addominale o dislocazione cervicale.
4. Isolamento di ad-MVF
- Preparare tre piastre sterili con 15 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), provette sterili di polipropilene da 14 ml (PP), una beuta da 50 ml sterile, sterili provette coniche microcentrifuga da 1,5 ml e forbici sottili sterilizzati.
- Lavare i cuscinetti adiposi tre volte in piastre Petri con 15 ml di PBS sotto una cappa a flusso laminare.
- Trasferire il grasso in un tubo da 14 ml in PP. Determinare il volume del tessuto adiposo raccolto (in mL) per mezzo di tHe scala tubo. Tritare il tessuto grasso meccanicamente con fini forbici fino ad ottenere una sospensione omogenea tessuto.
- Trasferire il tessuto tritato con due volumi di collagenasi NB4G (0,5 U / mL PBS) in un pallone da 50 mL beuta con 10 mL di misurazione pipetta. Il volume totale diventa tre volte il volume del tessuto grasso, determinato nel passo 4.3. Eseguire digestione tissutale in un incubatore per 10 min sotto vigorosa agitazione mediante un agitatore automatico (dimensione di ancoretta magnetica: 25 mm) a 37 ° C e le condizioni atmosferiche umidificati con 5% di CO 2.
- Osservare una piccola frazione (10 ml) del tessuto digerito sotto un microscopio per giudicare se la digestione può essere fermato. Accertarsi che il digestato contiene principalmente "libero" ad-DMV accanto a singole cellule, che indica il punto appropriato per arrestare il processo di digestione enzimatica (Figura 2).
NOTA: Questo passaggio richiede esperienza con la procedura ed è fondamentale per la qualitàdi isolato ad-MVF. Prolungato risultati digestione dei grassi in una cella singola sospensione senza ad-DMV. - Neutralizzare dell'enzima con due volumi di PBS / FCS 20%. Il volume totale diventa tre volte il volume della sospensione cellulare vasi nel passaggio 4.4. Trasferire la sospensione cellulare-nave di nuovo in nuovi tubi PP.
- Incubare la sospensione per 5 min a 37 ° C per separare ad-DMV rimanga grasso per gravità. Quindi rimuovere con attenzione il surnatante grasso principale con una precisione pipetta da 1 ml. Ripetere questo ciclo più volte con una pipetta di precisione da 100 ml fino a quando la sospensione sembra essere priva di grassi.
- Mettere un filtro da 500 micron in cima ad una provetta da centrifuga conica da 50 ml. Trasferire la sospensione cellulare vasi con una pipetta di misurazione 10 mL dai tubi 14-mL PP sulla membrana filtrante per rimuovere i coaguli residuo grasso. Trasferire la sospensione filtrata in nuove provette da 14 mL PP secondo il numero dei singoli ad-DMV isolati per gli esperimenti pianificati.
NOTA: Per in Vitro saggi incentrati sulla formazione rete microvascolare, può essere utile per purificare ulteriormente la sospensione cellulare vasi per migliorare la qualità delle immagini durante analisi al microscopio. A tale scopo, la sospensione può essere ulteriormente filtrata una volta con un filtro da 20 micron per rimuovere le cellule singole dal ad-DMV raccolti sul filtro. - Centrifugare la sospensione cellulare cardiovascolare (600 xg, 5 min, temperatura ambiente) per ottenere un pellet contenente ad-DMV.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante fino 1 mL viene lasciata. Risospendere il pellet con ad-DMV in 1 ml e trasferire la sospensione in una provetta conica da 1,5 mL.
- Centrifugare la sospensione ad-DMV nella provetta (600 xg, 5 min) per ottenere un pellet.
- Rimuovere il surnatante per risospendere il pellet nel volume finale richiesto di PBS / FCS 20%.
NOTA: Il numero di ad-DMV per isolare può essere valutata mediante conteggio al microscopio. A tale scopo, 1/10 della cellula-vesse finalel sospensione viene diluita 1:10 in PBS e 100 pl di questa diluizione vengono trasferiti in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. L'intero numero di ad-DMV presentante una morfologia a recipiente viene contato e estrapolato a tutta isolare. La concentrazione ad-MVF richiesto e la purificazione possono essere adattati individualmente al rispettivo in vitro o in vivo applicazione dell'annuncio-DMV. Ciò può includere l'incorporamento di annuncio-DMV in gel di collagene per l'analisi in vitro di formazione rete microvascolare o la semina di ad-DMV su scaffold per l'impianto in vivo in difetti del tessuto.
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Representative Results
Nel presente studio abbiamo eseguito sei procedure di isolamento ad-MVF con il tessuto grasso da 7 a 12 mesi maschio wild-type C57BL 6 topi / (peso corporeo medio: 35 ± 1 g). La Figura 1 illustra la raccolta dei cuscinetti adiposi dell'epididimo murini con conseguente isolamento meccanico ed enzimatica ad-DMV. Il tempo necessario per la raccolta di grasso era 30 minuti e per l'isolamento di ad-DMV era di 120 min. In totale, la procedura ha avuto 150 min.
Abbiamo raccolto 1.2 ± 0.1 mL di tessuto adiposo per donatore animale. Questa quantità di grasso ha permesso l'isolamento di 42.000 ± 2.000 ad-DMV per mL. La lunghezza media della isolato ad-DMV era 42 ± 1 um (Figura 2A). La durata della digestione enzimatica è stata determinata mediante controllo microscopico come mostrato in Figura 2B. ad-MVF esibito una tipica morfologia microvasi con ves gerarchicisegmenti SEL (Figura 2C).
Abbiamo inoltre caratterizzato l'annuncio-DMV mediante citometria di flusso. A tal fine, ad-DMV sono stati ulteriormente digeriti in soluzione distacco cellulare per 30 minuti in singole celle 15. L'analisi citofluorimetrica rivelato che ad-DMV contiene 26 ± 2% di cellule CD31-positive endoteliali, 17 ± 2% α-actina del muscolo liscio (SMA) cellule perivascolari -positive e cellule 9 ± 1% positive per il marcatore di cellule staminali mesenchimali CD117 (Figura 3A-C). Dopo la semina su un sostituto dermico pelle, fissato e sezionato immediatamente per le analisi istologiche, grandi annuncio-DMV stati localizzata principalmente sulla superficie dell'impianto (Figura 3D). Tuttavia, i segmenti dei vasi capillari possono essere rilevati anche all'interno dei suoi pori. La colorazione immunoistochimica di seminato ad-DMV rivelato ulteriore configurazione microvasi fisiologica con arteriolare, venularee frammenti capillari-simile (Figura 3E).
Figura 1: ad-MVF isolamento. A) A seguito della linea mediana laparotomia, vengono identificati i cuscinetti di grasso dell'epididimo (asterischi). Il tessuto adiposo viene raccolto con una piccola forbice preparazione e l'animale è sacrificato mediante incisione dell'aorta addominale (punta di freccia). B) macinazione meccanica dei cuscinetti adiposi con forbici sottili fino alla sospensione di tessuto appare omogenea. C) Per la digestione enzimatica, collagenasi viene aggiunta alla sospensione di tessuto. D) La sospensione cellulare viene incubato vaso e lo strato di grasso supernatante viene scartato. E) Dopo la centrifugazione, il pellet contenente annuncio-DMV viene risospeso e può essere utilizzato per diverse applicazioni, come l'analisi in vitro di microvascformazione di reti colare o la semina di ad-DMV su scaffold per l'impianto in vivo nei difetti dei tessuti (F). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: caratteristiche morfologiche ad-DMV. A) distribuzione della lunghezza di appena isolato ad-MVF. Media ± errore standard della media (n = 6). B) Immagine microscopica di una sospensione di cellule striscio vasi con ampio (freccia), (doppie frecce medie) e piccole (frecce nere) ad-DMV così come singole cellule (frecce bianche). Barra di scala = 110 micron. Maggiore ingrandimento rivela che ad-DMV presentano una morfologia microvasi matura con segmenti microvasi gerarchico (C,
Figura 3: citometrica a flusso, caratteristiche istologiche e immunoistochimici della annuncio-DMV. AC) analisi citofluorimetrica di fresco isolato illustrante ad-MVF CD31-positive cellule endoteliali (A), α-SMA-positivi cellule perivascolari (B) e le frazioni di cellule staminali mesenchimali CD117-positive (C). controlli isotipo-identico appropriati sono stati usati per regolare i livelli di soglia. Media ± errore standard della media (n = 6). D) ematossilina-eosina sezione macchiato di un seminato sostituto dermico pelle. Alcuni segmenti dei vasi capillari si trovano nell'impianto &# 39; s pori (punte di freccia). microvasi più grandi con venulare (doppia freccia) o arteriolare morfologia (freccia) sono localizzate sulla sua superficie. bar scala = 40 micron. Rotto la linea di confine = impianto. E) Caratterizzazione ad-DMV mediante immunoistochimica rilevamento del marker endoteliale CD31 (rosso) e il perivascolari α-SMA indicatore di cella (verde). nuclei delle cellule sono state colorate con un colorante fluorescente legame al DNA (blu). Arteriolare ad-MVF (freccia) sono caratterizzati da uno strato di cellule α-SMA-positivi più spessa rispetto alla venulare frammenti con un lume maggiore (doppia freccia). Punte di freccia = capillare ad-MVF. bar scala = 25 pm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio vi presentiamo un protocollo consolidata per l'isolamento di ad-MVF. Ottenere ad-MVF dal tessuto adiposo murino è una procedura semplice con pochi passaggi critici. I topi mostrano sottocutaneo diverso e depositi di grasso intra-addominale. Come precedentemente descritto per ratti, la fonte di grassi più adatto per l'isolamento di annuncio-DMV sono i cuscinetti adiposi dell'epididimo causa delle loro dimensioni, struttura omogenea e poco contaminate con vasi sanguigni più grandi 11, 12. Al contrario, i depositi di grasso sottocutaneo in topi sono molto più piccole e più aderente al tessuto circostante. Tuttavia, l'escissione di cuscinetti adiposi epididimali si assume il rischio di lesioni accidentali dell'epididimo e corde spermatico, con conseguente contaminazione del tessuto raccolto con spermatozoi. Pertanto, l'identificazione di epididimo, testicolo e corde spermatico è di grande importanza in questa procedura. Inoltre, i cuscinetti di grasso dovrebbe essere rapidly produzione secondo la raccolta di minimizzare ex vivo danno tissutale. Infine, si deve considerare che ci sono grandi variazioni dipendenti dall'età nella vascolarizzazione di cuscinetti adiposi murino dell'epididimo 23. Nella nostra esperienza, l'uso di topi da 6 a 12 mesi di età del donatore maschio fornisce una quantità sufficiente di ad-DMV per in vitro e in vivo. Tuttavia, può anche essere possibile isolare ad-DMV da topi più giovani, che presentano cuscinetti di grasso più piccole ma altamente vascolarizzati 24.
La digestione enzimatica dei cuscinetti adiposi dell'epididimo raccolte determina in modo cruciale la qualità finale del isolato ad-MVF. Troppo breve esposizione alla collagenasi conduce alla separazione incompleta ad-DMV da adipociti circostanti. D'altro canto, i risultati digestione prolungati nella distruzione di ad-DMV ad una sospensione di cellule singole, la frazione vascolare cosiddetto stromale (SVF). La SVF è una eterogenea popolazione di cellule contenenti mcellule staminali esenchymal, cellule endoteliali, periciti, macrofagi e molti altri tipi di cellule con potenziale di rigenerazione attraverso paracrino e differenziazione meccanismi 25. L'uso di annuncio-DMV presenta notevoli vantaggi rispetto agli approcci SVF-based. La morfologia microvasi completamente funzionale di ad-MVF consente l'immediato impianto per esperimenti in vivo senza tempo e complesso nella coltivazione vitro. Inoltre, l'isolamento della SVF solito richiede la digestione del tessuto con collagenasi fino a 90 min 26. Al contrario, la degradazione dei tessuti non deve superare i 10 minuti per l'isolamento di ad-MVF. Questo supporta l'idea di intraoperatorie applicazioni one-step di ad-MVF 9. A tal fine, ad-DMV può essere isolato automaticamente da lipoaspirato autologhi e trasferito nuovamente dentro un difetto del tessuto del paziente senza lasciare la sala operatoria. Questo è un goa realisticol considerando il fatto che l'isolamento automatizzato di SVF da lipoaspirato già un procedimento clinicamente stabilita in chirurgia plastica 27, 28, 29.
Recentemente, abbiamo dimostrato un forte effetto di ad-DMV sulla vascolarizzazione in vivo di osso 14 e la pelle 15 sostituti. Di interesse, abbiamo scoperto che è vantaggioso non per rimuovere le cellule singole dall'annuncio-DMV isolare, perché possono fornire un ambiente più fisiologico che contribuisce alla elevata capacità vascolarizzazione di ad-MVF 13. Pertanto, abbiamo usato solo un filtro da 500 micron durante l'isolamento di ad-DMV per la rimozione di grandi coaguli non digeriti grassi. Inoltre, abbiamo trovato che linfoangiogenesi ad-DMV indurre in pelle impiantato sostituisce 15. Quindi, ad-DMV può anche essere promettente mattoni per lymphatingegneria dei tessuti ic e la terapia del linfedema.
Per la definizione di successo di questi risultati sperimentali nella pratica clinica, il passo successivo è chiarire se il tessuto adiposo umano è ideale per l'isolamento di ad-DMV come grasso roditore. In questo contesto, un problema critico è la quantità di grasso necessaria per isolare grandi quantità di ad-MVF. Il protocollo qui descritto ha provocato circa 40.000 ad-DMV per tessuto grasso mL. Di conseguenza, 3 mL tessuto grasso sarebbe necessario prevascularize 1 cm 2 di pelle dermico sostituto 15. Quindi, questo approccio non può essere fattibile per il trattamento di ferite più grandi o pazienti gravemente malati a causa di un numero limitato di tessuto grasso disponibile per l'isolamento ad-DMV.
Accanto a un ampio spettro di applicazioni in vivo potenziale nell'ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa, ad-DMV sono adatti anche per la modellazione in vitro di proc angiogenicaesses. Per esempio, ratto ad-MVF sono state coltivate in idrogel di collagene tridimensionale per studiare la formazione di nuove reti microvascolari 30. Approcci simili sono stati utilizzati per valutare sofisticate tecniche di imaging per la visualizzazione di crescita neovessel 13 o interstiziale rimodellamento della matrice durante l'angiogenesi 31.
Presi insieme, questi risultati indicano che ad-DMV non sono solo promettendo vascolarizzazione e unità lymphangiogenic per strategie terapeutiche future, ma anche per la ricerca di base nel campo dell'angiogenesi e della fisiologia vascolare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Siamo grati per l'eccellente assistenza tecnica di Janine Becker, Caroline Bickelmann e Ruth Nickels. Questo studio è stato finanziato da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - German Research Foundation) - LA 2682 / 7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
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