Summary
نقدم بروتوكول لعزل الدهنية شظايا الاوعية الدموية الدقيقة المستمدة من الأنسجة التي تمثل وحدات الأوعية الدموية واعدة. أنها يمكن أن تكون معزولة بسرعة، لا تتطلب في تجهيز المختبر، وبالتالي يمكن استخدامها لprevascularization خطوة واحدة في مختلف مجالات هندسة الأنسجة.
Abstract
شبكة الاوعية الدموية الدقيقة وظيفية ذات أهمية محورية لبقاء والتكامل من بنيات الأنسجة هندسيا. لهذا الغرض، وقد وضعت عدة استراتيجيات عائية وprevascularization. ومع ذلك، وتشمل معظم النهج القائمة على الخلايا في المختبر الخطوات تستغرق وقتا طويلا لتشكيل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة. وبالتالي، فهي ليست مناسبة لإجراءات خطوة واحدة أثناء العملية. الدهنية المشتقة من الأنسجة شظايا الاوعية الدموية الدقيقة (إعلان MVF) تمثل وحدات الأوعية الدموية واعدة. أنها يمكن أن تكون معزولة بسهولة من الأنسجة الدهنية ويحمل التشكل microvessel وظيفية. وعلاوة على ذلك، فإنها يحشدوا بسرعة إلى شبكات الاوعية الدموية الدقيقة جديدة بعد زرع في الجسم الحي. وبالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت أن إعلان MVF للحث على lymphangiogenesis. وأخيرا، فهي مصدرا غنيا للخلايا الجذعية الوسيطة، والتي قد تزيد من إمكانية المساهمة في الأوعية الدموية العالية. في دراسات سابقة أننا أظهرنا في vascularizati رائععلى قدرة إعلان MVF في هندسة العظام والجلد بدائل. في هذه الدراسة، ونحن التقرير على بروتوكول موحد لعزل الأنزيمية للإعلان MVF من الأنسجة الدهنية في الفئران.
Introduction
وتركز هندسة الأنسجة في تصنيع الأنسجة والأعضاء البديلة التي تحتفظ، استعادة أو زيادة وظيفة غير صالحة للعمل في نظرائهم الجسم الحي 1 و 2. مصير يبني الأنسجة المهندسة يعتمد بشكل حاسم على الأوعية الدموية كافيا 3. شبكات الاوعية الدموية الدقيقة داخل هذه ثوابت ينبغي تنظيم هرمي مع الشرايين، الشعيرات الدموية، والأوردة للسماح كفاءة الارواء الدم بعد مفاغمة إلى الأوعية الدموية المستلم 4. الجيل من هذه الشبكات هو من بين التحديات الرئيسية في هندسة الأنسجة. لهذا الغرض، تم تقديم مجموعة واسعة من الاستراتيجيات الأوعية الدموية التجريبية على مدى العقدين الماضيين 5، 6.
النهج عائية تحفيز النمو الداخلي من microvessels المتلقي إلى TISS هندسياUES عن طريق الهيكلي أو الفيزيائية تعديل سقالة، مثل إدماج عوامل النمو 7. ومع ذلك، من أجل الأوعية الدموية من بنيات كبيرة ثلاثية الأبعاد والاستراتيجيات التي تعتمد على الأوعية الدموية تقتصر بشكل ملحوظ بنسب نمو بطيئة تطوير microvessels 8.
في المقابل، فإن مفهوم prevascularization يهدف لتوليد شبكات الاوعية الدموية الدقيقة وظيفية في غضون الأنسجة يبني قبل ترسيخها على 9. ينطوي prevascularization التقليدية وثقافة مشتركة من الخلايا المكونة للسفينة، مثل الخلايا البطانية، والخلايا الجدارية أو الخلايا الجذعية 10، ضمن السقالات. بعد تشكيل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة، ويمكن بعد ذلك يبني prevascularized يتم زرعها في عيوب الأنسجة. الجدير بالذكر أن هذا النهج prevascularization يصعب تطبيقه في عملية إعداد سريرية، لأنه يقوم على معقدة وتستغرق وقتا طويلا في المختبر </ م> الإجراءات التي تم منعها من قبل العقبات التنظيمية الرئيسية 9. وبناء على ذلك، لا يزال هناك حاجة لتطوير استراتيجيات prevascularization الرواية التي هي أكثر ملاءمة لتطبيق السريرية واسع.
قد تكون هذه الاستراتيجية prevascularization تطبيق شظايا الاوعية الدموية الدقيقة المستمدة من الأنسجة الدهنية (إعلان MVF). إعلان MVF تمثل وحدات الأوعية الدموية القوية التي يمكن حصادها في كميات كبيرة من الأنسجة الدهنية من الفئران 11 و 12 و 13 الفئران. وهي تتألف من تصلب، الشعرية، وشرائح سفينة venular، الذي يحمل التشكل microvessel الفسيولوجية مع التجويف وتحقيق الاستقرار في الخلايا المحيطة بالأوعية 14 و 15. تسمح هذه الميزة الفريدة غرس فوري من السقالات الإعلان MVF المصنف إلى عيوب الأنسجة دون precultivation. هناك، وإعلان MVF يحشدوا بسرعة فيإلى شبكات الاوعية الدموية الدقيقة وظيفية. وعلاوة على ذلك، شبيه MVF تمثل مصدرا غنيا للخلايا الجذعية الوسيطة 16، والتي قد تسهم بالإضافة إلى القدرة على التجدد ضرب بهم. وفقا لذلك، وتستخدم إعلان MVF على نحو متزايد في مختلف مجالات هندسة الأنسجة 14 و 15 و 17 و 18 و 19 و 20 و 21.
وقد أنشئت أصلا عزلة إعلان MVF في الفئران 11 و 12. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يسمح للعزلة موحدة من الفئران إعلان MVF من منصات الدهون بربخي. وهذا قد تقدم مزيدا من الإيضاحات الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظيفة إعلان MVF باستخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمعهد الوطني للمبادئ التوجيهية الصحية لاستخدام حيوانات التجارب ويتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية (Landesamt FÜR Soziales، Gesundheit اوند Verbraucherschutz، أبت. Lebensmittel- اوند Veterinärwesen، Zentralstelle، ساربروكن، ألمانيا).
1. إعداد الأدوات الجراحية
- حافظ على استعداد للمقص تشريح، ملقط جراحي، مقص إعداد صغيرة، ملقط غرامة وطبق بتري معقمة مع 15 مل Dulbecco والمتوسطة النسر المعدلة (DMEM و 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، و 100 U / مل البنسلين، 0.1 ملغ / مل الستربتومايسين ) للحصاد منصات بربخي الدهون.
- كشف الأدوات الجراحية إلى حل تعقيم لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، تعقيم لهم (التعقيم بالبخار، 121 ° C، 20 دقيقة).
2. الحيوانات والتخدير
- تختار بعناية سلالة من الفئران كما هو مبين في الدراسة و الموضوع قيد التحقيق.
ملاحظة: في هذه الدراسة استخدمنا الذكور من النوع البري C57BL / 6 الفئران الجهات المانحة للحصاد بربخي الدهون. من الفائدة، شبيه MVF قد تكون معزولة أيضا من المعدلة وراثيا الخضراء بروتين فلوري (GFP) الحيوانات المانحة -positive (C57BL / 6-TG (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. هذا يحمل ميزة كبيرة أن أجزاء قابلة للكشف بسهولة عن طريق تلطيخ المناعى من GFP بعد زرع في الفئران من النوع البري GFP سلبية 14. - تخدير الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من زيلازين (15 ملغ / كلغ) والكيتامين (75 ملغ / كلغ). تأكد من أن الحيوانات هي تخدير عميق عن طريق إجراء قرصة أخمص القدمين مع أي رد. لا يشار العين زيوت التشحيم حيث يتم التضحية الحيوانات المانحة بعد الحصاد الدهون.
ملاحظة: تأكد من تسكين والعقم الجراحية وبالاتفاق مع المبادئ التوجيهية ذات الصلة للبلد ومؤسسة حيث يتم التخطيط للتجارب.
- نقل الحيوانات إلى جدول العملية. وضع الحيوان في موقف ضعيف تحت مجهر تشريحي الجراحية وتأكيد التخدير العميق باستخدام قرصة أخمص قدميه.
- لشل حركة الكفوف عن طريق تسجيل لهم ثنى الجراحية وتطهير البطن مع تطهير الحل.
- فصل الجلد في منطقة البطن خالية من طبقة العضلات الكامنة مع مقص تشريح.
- تنفيذ البطن خط الوسط مع مقص تشريح وأفقيا تتكشف اللوحات من جدار البطن.
- تحديد ثنائيا الخصية، البربخ ولوحة بربخي الدهون باستخدام ملقط غرامة (الشكل 1). لا يضر الهياكل المعوية لمنع تلوث برازي من منصات الدهون.
- حصاد منصات الدهون بربخي مع مقص إعداد الصغيرة وملقط غرامة تحت مجهر تشريحي. الحفاظ على هامش أمان من عدة مم بين البربخ والدهون لالحد من مخاطر حصاد بربخي عرضي.
ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذا الإجراء دون مجهر تشريحي. ولكن هذا قد تزيد من خطر الإصابة العرضية من البربخ وحبل منوي. - نقل منصات بربخي الدهون في طبق بتري تحتوي على 15 مل من DMEM قبل ساخنة-في 37 ° C لنقل إلى المختبر الخلية.
- التضحية الحيوانية شق من الشريان الأورطي البطني أو خلع عنق الرحم.
4. عزل إعلان MVF
- إعداد ثلاثة أطباق بتري معقمة مع 15 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، معقم 14 مل البولي بروبلين أنابيب (PP)، وهي معقمة 50 مل دورق مخروطي، عقيمة 1.5 مل أنابيب مخروطية microcentrifuge لومقص غرامة معقمة.
- غسل منصات الدهون ثلاث مرات في أطباق بتري مع 15 مل من برنامج تلفزيوني تحت غطاء تدفق الصفحي.
- نقل الدهون في أنبوب 14 مل PP. تحديد حجم الأنسجة الدهنية حصاد (في مل) من خلال ركان أنبوب الحجم. فرم الأنسجة الدهنية ميكانيكيا مع مقص غرامة حتى يتم الحصول على تعليق الأنسجة متجانسة.
- نقل الأنسجة المفروم مع مجلدين من كولاجيناز NB4G (0.5 U / مل PBS) في قارورة 50 مل مخروطي من خلال 10 مل قياس ماصة. يصبح الحجم الكلي ثلاث مرات حجم الأنسجة الدهنية قياس في الخطوة 4.3. أداء الهضم الأنسجة في حاضنة لمدة 10 دقيقة مع التحريك القوي عن طريق والنمام الآلي (حجم شريط مغناطيسي: 25 ملم) عند 37 درجة مئوية والظروف الجوية ترطيب مع 5٪ CO 2.
- مراقبة جزء صغير (10 ميكرولتر) من الأنسجة هضمها تحت المجهر للحكم على ما إذا كانت عملية الهضم يمكن وقفها. التأكد من أن digestate يحتوي أساسا "الحرة" إعلان MVF بجانب الخلايا واحد، مشيرا إلى النقطة المناسبة لوقف عملية الهضم الأنزيمية (الشكل 2).
ملاحظة: هذه الخطوة تتطلب خبرة للإجراءات وأمر بالغ الأهمية للجودةمن عزل إعلان MVF. المطول النتائج الهضم الدهون في تعليق وحيد الخلية دون إعلان MVF. - تحييد انزيم مع مجلدين من PBS / 20٪ FCS. يصبح الحجم الكلي ثلاث مرات حجم تعليق الخلية الأوعية الدموية في الخطوة 4.4. نقل تعليق خلية الأوعية الدموية مرة أخرى في أنابيب PP جديدة.
- احتضان تعليق لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل إعلان MVF من تبقى الدهون عن طريق الجاذبية. ثم إزالة بعناية طاف الدهون الرئيسي مع دقة ماصة 1 مل. تكرار هذه الدورة عدة مرات مع دقة ماصة 100 ميكرولتر حتى يظهر تعليق لتكون خالية من الدهون.
- وضع مرشح 500 ميكرون على رأس أنبوب الطرد المركزي مخروطي 50 مل. نقل تعليق خلية الأوعية الدموية مع ماصة قياس 10 مل من 14 مل أنابيب PP على الغشاء فلتر لإزالة جلطات الدهون المتبقية. نقل تعليق تصفيتها في أنابيب 14 مل PP جديدة وفقا لعدد من الأفراد إعلان MVF يعزل للتجارب مخطط لها.
ملاحظة: للفي vitrس فحوصات التركيز على تشكيل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة، قد يكون مفيدا لزيادة تنقية تعليق خلية الأوعية الدموية لتحسين جودة التصوير خلال التحليلات المجهرية. لهذا الغرض، وتعليق قد تتم تصفيته بالإضافة إلى ذلك مرة واحدة مع فلتر 20 ميكرون لإزالة الخلايا واحد من إعلان MVF جمعها على التصفية. - الطرد المركزي تعليق خلية الأوعية الدموية (600 x ج، 5 دقائق، درجة حرارة الغرفة) للحصول على بيليه تحتوي على إعلان MVF.
- بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف حتى 1 تبقى مل. إعادة تعليق بيليه مع إعلان MVF في هذا 1 مل ونقل تعليق في أنبوب microcentrifuge مخروطي 1.5 مل.
- الطرد المركزي تعليق إعلان MVF في أنبوب microcentrifuge (600 x ج، 5 دقائق) للحصول على بيليه.
- إزالة طاف لإعادة تعليق بيليه في الحجم النهائي المطلوب من PBS / 20٪ FCS.
ملاحظة: عدد الإعلانية MVF في عزلة يمكن تقييمها من قبل العد المجهري. لهذا الغرض، 1/10 من النهائي خلية vesseغير المخفف ل تعليق 01:10 في برنامج تلفزيوني ويتم نقل 100 ميكرولتر من هذا التخفيف في بئر من لوحة 96-جيدا. ثم يتم حساب عدد كامل من إعلان MVF اظهار التشكل مثل السفن واستقراء لعزل كله. تركيز إعلان MVF وتنقية المطلوبة يمكن تكييفها بشكل فردي إلى منها في المختبر أو في تطبيق الجسم الحي للإعلان MVF. هذا ويمكن أن تشمل التضمين من إعلان MVF في المواد الهلامية الكولاجين للتحليل في المختبر لتشكيل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة أو البذر من إعلان MVF على السقالات في الجسم الحي زرع في عيوب الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة أجرينا ستة إجراءات العزل إعلان MVF مع الأنسجة الدهنية من 7- لمن العمر 12 شهرا من الذكور من النوع البري C57BL / 6 الفئران (يعني وزن الجسم: 35 ± 1 غرام). يوضح الشكل (1) حصاد الفئران منصات بربخي الدهون مع الميكانيكية والأنزيمية العزلة إعلان MVF اللاحقة. كان الوقت اللازم لحصاد الدهون 30 دقيقة ولعزل إعلان MVF كان 120 دقيقة. في المجموع، واستغرق إجراء 150 دقيقة.
نحن تحصد 1.2 ± 0.1 مل من الأنسجة الدهنية للحيوان الواحد المانحة. هذه الكمية من الدهون يسمح عزلة 42000 ± 2000 إعلان MVF لكل مليلتر. وكان متوسط طول المعزول إعلان MVF 42 ± 1 ميكرومتر (الشكل 2A). تم تحديد مدة الهضم الأنزيمي عن طريق مراقبة مجهرية كما هو مبين في الشكل 2B. عرضت إعلان MVF التشكل microvessel نموذجي مع فيس الهرميةشرائح قانون حالة الطوارئ (الشكل 2C).
ونحن بالإضافة إلى ذلك يتميز الإعلان-MVF عن طريق التدفق الخلوي. لهذا الغرض، وكذلك هضم إعلان MVF في حل الخلية المفرزة لمدة 30 دقيقة في الخلايا واحد (15). وcytometric تدفق أظهر التحليل أن إعلان MVF يحتوي على 26 ± 2٪ خلايا CD31 إيجابي البطانية، 17 ± 2٪-α العضلات الملساء الأكتين (SMA) الخلايا المحيطة بالأوعية -positive، والخلايا 9 ± 1٪ إيجابية لالوسيطة الخلايا الجذعية علامة CD117 (الشكل 3A-C). بعد البذر على بديل الجلد الجلد، والتي كانت ثابتة ومقطوع على الفور لتحليل النسيجي، وأكبر وإعلان MVF المحلية بشكل رئيسي على سطح الغرسة في (الشكل 3D). ومع ذلك، يمكن أيضا أن يتم الكشف عن أجزاء السفينة الشعرية داخل المسام. تلطيخ المناعى من المصنف إعلان MVF كشف مزيد من التكوين microvessel الفسيولوجية مع تصلب، venularومثل شعري شظايا (الشكل 3E).
الشكل 1: إعلان MVF العزلة. A) وبعد فتح البطن خط الوسط، ويتم تحديد منصات بربخي الدهون (النجمة). يتم حصاد الأنسجة الدهنية مع مقص إعداد صغيرة والتضحية الحيوانية شق من الشريان الأورطي البطني (رأس السهم). B) يظهر تنميق الميكانيكية من منصات الدهون مع مقص غرامة حتى تعليق الأنسجة متجانسة. C) لعملية الهضم الأنزيمي، يتم إضافة كولاجيناز إلى تعليق الأنسجة. D) وحضنت تعليق خلية الأوعية الدموية ويتم تجاهل طبقة طاف الدهون. E) بعد الطرد المركزي، وبيليه معلق تحتوي على إعلان MVF، ويمكن استخدامها لتطبيقات مختلفة، مثل تحليل في المختبر من microvascتشكيل شبكة ular أو البذر من إعلان MVF على السقالات في الجسم الحي زرع في عيوب الأنسجة (F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخصائص المورفولوجية للإعلان MVF. أ) توزيع طول المعزولة حديثا إعلان MVF. ± يعني الخطأ المعياري للمتوسط (ن = 6). ب) صورة مجهرية لخلية الأوعية الدموية تعليق مسحة مع كبير (السهم)، (الأسهم المزدوجة المتوسطة الحجم) والصغيرة (السهام السوداء) إعلان MVF وكذلك الخلايا واحد (السهام البيضاء). شريط مقياس = 110 ميكرون. التكبير العالي يكشف عن أن إعلان MVF تبدي microvessel التشكل ناضجة مع قطاعات microvessel الهرمي (C،
الشكل (3): تدفق Cytometric، النسيجية والخصائص المناعية للإعلان MVF. AC) تدفق cytometric تحليلات المعزولة حديثا توضح إعلان MVF-CD31 إيجابي الخلايا البطانية (A)، α-SMA إيجابية الخلايا المحيطة بالأوعية (B) وCD117 إيجابية الخلايا الجذعية الوسيطة (C) الكسور. استخدمت الضوابط المناسبة-نمط إسوي مطابق لضبط مستويات العتبة. ± يعني الخطأ المعياري للمتوسط (ن = 6). D) الهيماتوكسيلين والقسم الملطخة يوزين من المصنف بديلا الجلد الجلد. تقع بضع شرائح سفينة الشعرية في زرع و# 39؛ ق المسام (السهام). يتم ترجمة microvessels أكبر مع venular (السهم مزدوج) أو تصلب (السهم) التشكل على سطحه. شريط مقياس = 40 ميكرومتر. خط مكسور = الحدود الزرع. E) توصيف إعلان MVF عن طريق كشف المناعى من البطانية خلية علامة CD31 (أحمر) وحول الأوعية α-SMA علامة الخلية (الخضراء). كانت ملطخة نواة الخلية مع صبغة الفلورسنت ملزم الحمض النووي (الأزرق). تتميز تصلب إعلان MVF (السهم) من قبل سمكا طبقة الخلايا-SMA إيجابية α بالمقارنة مع venular شظايا مع التجويف أكبر (السهم مزدوج). النصال = الشعرية إعلان MVF. شريط مقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة نقدم بروتوكول راسخة لعزل إعلان MVF. الحصول على إعلان MVF من الأنسجة الدهنية في الفئران هو إجراء بسيط مع عدد قليل من الخطوات الحاسمة. الفئران المعرض تحت الجلد المختلفة، ورواسب الدهون داخل البطن. كما هو موضح سابقا بالنسبة للفئران، ومصدر الدهون الأنسب لعزل إعلان MVF هي منصات بربخي الدهون بسبب حجمها، بنية متجانسة والحد الأدنى من التلوث مع الأوعية الدموية أكبر 11 و 12. في المقابل، رواسب الدهون تحت الجلد في الفئران هي أصغر بكثير وأكثر تمسكا الأنسجة المحيطة بها. ومع ذلك، فإن الختان من منصات الدهون بربخي يحمل خطر إصابة عرضية من البربخ وحبل منوي، مما أدى إلى تلوث النسيج المقطوع مع الحيوانات المنوية. ولذلك، فإن تحديد البربخ والخصية وحبل منوي أمر ذو أهمية كبرى في هذا الإجراء. وعلاوة على ذلك، يجب أن تكون منصات الدهون rapidlذ معالجتها بعد الحصاد للحد من خارج الحي تلف الأنسجة. وأخيرا، فإنه ينبغي النظر أن هناك اختلافات كبيرة تعتمد على العمر في الأوعية الدموية من منصات الدهون بربخي الفئران 23. في تجربتنا، واستخدام الفئران الذكور المانحة عمرها 12 أشهر 6- أن يوفر كميات كافية من إعلان MVF لفي التجارب المختبرية والدراسات المجراة. ومع ذلك، قد يكون من الممكن أيضا لعزل إعلان MVF من الفئران الشابة، التي تظهر أصغر ولكن أوعية دموية للغاية منصات الدهون 24.
عملية الهضم الأنزيمي من منصات الدهون بربخي تحصد يحدد بشكل حاسم الجودة النهائية للمعزولة إعلان MVF. معرض قصيرة جدا لكولاجيناز يؤدي إلى فصل غير مكتمل من إعلان MVF من الخلايا الشحمية المحيطة بها. من ناحية أخرى، والنتائج الهضم طويلة في تدمير إعلان MVF إلى تعليق خلية واحدة، ما يسمى انسجة جزء الأوعية الدموية (SVF). في صندوق التبرعات الخاص هو غير المتجانسة التي تحتوي على السكان الخلية مالخلايا الجذعية esenchymal، الخلايا البطانية، pericytes، الضامة، والعديد من أنواع الخلايا الأخرى مع إمكانية التجدد من خلال آليات نظير الصماوي والتمايز 25. استخدام الإعلانية MVF يعرض مزايا كبيرة بالمقارنة مع النهج القائمة على صندوق التبرعات الخاص. مورفولوجيا microvessel تعمل بكامل طاقتها من إعلان MVF يسمح زرع المباشرين لفي التجارب المجراة دون تستغرق وقتا طويلا ومعقدا في زراعة المختبر. وعلاوة على ذلك، وعزل من صندوق التبرعات الخاص وعادة ما يتطلب هضم الأنسجة مع كولاجيناز تصل إلى 90 دقيقة 26. في المقابل، يجب ألا تتجاوز تدهور الأنسجة 10 دقيقة لعزل إعلان MVF. وهذا يدعم فكرة أثناء العملية التطبيقات خطوة واحدة من إعلان MVF 9. لهذا الغرض، شبيه MVF قد تكون معزولة تلقائيا من lipoaspirates ذاتي وتحويلها مرة أخرى إلى وجود خلل أنسجة المريض دون أن تترك المسرح العملية. هذا هو واقعي غوال النظر في حقيقة أن العزلة الآلي للصندوق التبرعات الخاص من lipoaspirates هي بالفعل إجراءات المتبعة سريريا في الجراحة التجميلية 27 و 28 و 29.
في الآونة الأخيرة، لقد أثبتنا تأثير قوي من إعلان MVF على الأوعية الدموية في الجسم الحي من العظام والجلد 14 15 بدائل. من الفائدة، وجدنا أنه من المفيد عدم إزالة الخلايا واحد من إعلان MVF عزل، لأنها قد توفر بيئة أكثر الفسيولوجية التي تساهم في قدرة الأوعية الدموية عالية من إعلان MVF 13. لذلك، كنا فقط تصفية 500 ميكرون خلال عزل إعلان MVF لإزالة جلطات غير يهضم الدهون أكبر. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن إعلان MVF لحث lymphangiogenesis في الجلد زرع بدائل 15. ومن هنا، شبيه MVF يمكن أيضا أن تكون واعدة اللبنات الأساسية لlymphatهندسة الأنسجة جيم والعلاج وذمة لمفية.
لترجمة ناجحة من هذه النتائج التجريبية في الممارسة السريرية، فإن الخطوة المنطقية التالية هي لتوضيح ما إذا كانت الأنسجة الدهنية لجسم الإنسان هي مناسبة أيضا للعزلة إعلان MVF كما القوارض الدهون. وفي هذا السياق، مسألة حاسمة هي كمية الدهون اللازمة لعزل كميات كبيرة من إعلان MVF. أسفرت هنا وصف بروتوكول في ما يقرب من 40000 إعلان MVF لكل مليلتر الأنسجة الدهنية. وبناء على ذلك، فإن 3 مل الأنسجة الدهنية تكون ضرورية لprevascularize 1 سم 2 من الجلد الجلد بديل 15. وبالتالي، قد لا يكون هذا النهج عمليا لعلاج الجروح الكبيرة أو المرضى المصابين بأمراض شديدة بسبب كمية محدودة من الأنسجة الدهنية المتاحة للإعلان MVF العزلة.
إلى جانب مجموعة واسعة من إمكانات في تطبيقات المجراة في هندسة الأنسجة والطب التجديدي، شبيه MVF هي أيضا مناسبة لفي المختبر نمذجة بروك عائيةesses. على سبيل المثال، تم تربيتها الفئران إعلان MVF في الهلاميات المائية الكولاجين ثلاثية الأبعاد لدراسة تشكيل شبكات الاوعية الدموية الدقيقة 30 الجديدة. وقد استخدمت نهج مماثلة لتقييم تقنيات التصوير المتطورة لتصور النمو neovessel 13 أو الخلالي إعادة عرض مصفوفة خلال الأوعية الدموية 31.
أخذت معا، وهذه النتائج تشير إلى أن إعلان MVF ليست فقط واعدة الأوعية الدموية وحدات lymphangiogenic لاستراتيجيات علاجية مستقبلية، ولكن أيضا للبحث الأساسي في مجال الأوعية الدموية وعلم وظائف الأعضاء الأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للمساعدة التقنية الممتازة جانين بيكر، كارولين بيكلمان وروث نيكيلس. وقد تم تمويل هذه الدراسة من خلال منحة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG - مؤسسة الأبحاث الألمانية) - LA 2682 / 7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
