Summary
Wir stellen ein Protokoll Fettgewebe stamm mikrovaskulärer Fragmente zu isolieren, die viel versprechende Vaskularisierung Einheiten darstellen. Sie können schnell isoliert werden, erfordern nicht in vitro - Prozessierung und somit für Prävaskularisation Ein-Schritt verwendet werden kann , in verschiedenen Bereichen des Tissue Engineering.
Abstract
Ein funktionelles mikrovaskulären Netzwerk ist von entscheidenden Bedeutung für das Überleben und die Integration von Engineered Gewebekonstrukten. Zu diesem Zweck wurden mehrere angiogene und Prävaskularisation Strategien etabliert. Allerdings sind die meisten zellbasierte Ansätze sind zeitraubend in vitro Schritte zur Bildung eines mikrovaskulären Netzwerk. Daher sind sie für die intraoperative Ein-Schritt-Verfahren nicht geeignet. Fettgewebe abgeleiteten mikrovaskulärer Fragmente (ad-MVF) stellen vielversprechende Vaskularisierung Einheiten. Sie lassen sich leicht aus Fettgewebe und weisen eine funktionelle microvessel Morphologie isoliert werden. Darüber hinaus wieder zusammenbauen sie schnell in neue mikrovaskuläre Netzwerke nach Implantation in vivo. Darüber hinaus Ad-MVF wurde Lymphangiogenese induziert. Schließlich sind sie eine reiche Quelle von mesenchymalen Stammzellen, die weiterhin ihre hohen Potential Vaskularisierung beitragen können. In früheren Studien haben wir die bemerkenswerte vascularizati demonstriertauf der Kapazität des Ad-MVF in engineered Knochen und Hautersatz. In der vorliegenden Studie berichten wir über ein standardisiertes Protokoll für die enzymatische Trennung von Ad-MVF aus murinen Fettgewebe.
Introduction
Tissue Engineering konzentriert sich auf der Herstellung von Gewebe- und Organersatz , die erhalten, wiederzuherzustellen oder die Funktion des inoperablen in vivo Pendants 1, 2 zu erhöhen. Das Schicksal von Engineered Gewebekonstrukten hängt entscheidend von einer adäquaten Vaskularisation 3. Die mikrovaskuläre Netzwerke innerhalb dieser Konstrukte hierarchisch mit Arteriolen, Kapillaren organisiert werden sollte, und Venolen nach inosculation der dem Empfänger Gefäß 4 effiziente Durchblutung zu ermöglichen. Die Erzeugung solcher Netzwerke gehört zu den wichtigsten Herausforderungen in Tissue Engineering. Zu diesem Zweck wird ein breites Spektrum von experimenteller Vaskularisierung Strategien wurde in den letzten zwei Jahrzehnten eingeführt 5, 6.
Angiogenen Ansätze fördern das Einwachsen des Empfängers microvessels in engineered tissUEs durch strukturelle oder physikochemischen Gerüstmodifikation, wie beispielsweise die Einarbeitung von Wachstumsfaktoren 7. Doch für die Vaskularisierung von großen dreidimensionalen Konstrukten, Angiogenese-abhängigen Strategien werden durch langsame Wachstumsraten deutlich begrenzt von microvessels 8 zu entwickeln.
Im Gegensatz dazu soll der Begriff Prävaskularisation zur Erzeugung von funktionellen mikrovaskuläre Netzwerke innerhalb des Gewebes , um ihre Implantation 9 vor konstruiert. Herkömmliche Prävaskularisation beinhaltet die Co-Kultur des gefäßbildenden Zellen, wie Endothelzellen, mural Zellen oder Stammzellen 10, innerhalb von Gerüsten. Nach mikrovaskuläre Netzwerkbildung können die prävaskularisierten Konstrukte dann in Gewebedefekte implantiert werden. Bemerkenswert, dieser Prävaskularisation Ansatz ist schwierig , in einer klinischen Einstellung zu übernehmen, weil sie auf komplexe und zeitraubend in vitro basiert </ em> Verfahren, die von den großen regulatorischen Hürden 9 begrenzt sind. Dementsprechend besteht weiterhin ein Bedarf an der Entwicklung neuartiger Prävaskularisation Strategien, die besser geeignet für eine breite klinische Anwendung sind.
Eine solche Strategie kann Prävaskularisation die Anwendung von Fettgewebe stamm mikrovaskulärer Fragmente (ad-MVF) sein. ad-MVF stellt potente Vaskularisierung 11 Einheiten , die in großen Mengen aus dem Fettgewebe von Ratten geerntet werden können, 12 und 13 Mäuse. Sie bestehen aus Arteriolen, Kapillaren und Venolen Gefäßsegmente, die eine physiologische microvessel Morphologie mit einem Lumen aufweisen , und Stabilisieren perivaskuläre Zellen 14, 15. Diese einzigartige Funktion ermöglicht die sofortige Implantation von Ad-MVF ausgesät Gerüsten in Gewebedefekten ohne Vorkultur. Dort wieder zusammenbauen der Ad-MVF schnell infunktionellen mikrovaskuläre Netzwerke. Weiterhin ad-MVF stellt eine reiche Quelle von mesenchymalen Stammzellen , 16, die mit ihrer markanten Regenerationsfähigkeit zusätzlich beitragen können. Dementsprechend ad-MVF wird zunehmend in verschiedenen Bereichen des tissue engineering 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21 verwendet.
Die Isolierung von ad-MVF wurde ursprünglich in Ratten 11 hergestellt worden ist , 12. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die standardisierte Isolierung von Maus-Ad-MVF von epididymal Fettpolstern ermöglicht. Diese können vorsehen, weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen ad-MVF Funktion zugrundeliegenden von transgenen Mausmodellen.
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Protocol
Alle Verfahren wurden für die Verwendung von Versuchstieren nach dem National Institute of Health Richtlinien durchgeführt und anschließend institutionelle Richtlinien (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Deutschland).
1. Herstellung von chirurgischen Instrumenten
- Halte bereit, die Dissektion Schere, chirurgische Pinzette, kleine Vorbereitung Schere, feine Pinzette und eine sterile Petrischale mit 15 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, 10% fötalen Kälberserum (FCS), 100 U / ml Penicillin, 0,1 mg / ml Streptomycin ) epididymal Fettpolster für die Ernte.
- Expose die chirurgischen Instrumente mit einer Desinfektionslösung für 5 min. Alternativ sterilisiert (Dampfsterilisation; 121 ° C, 20 min).
2. Tiere und Anästhesie
- Wählen Sie sorgfältig die Belastung der Mäuse wie für die Studie darauf hin, und die Gegenstand untersucht.
HINWEIS: In dieser Studie verwendeten wir männliche Wildtyp-C57BL / 6-Mäuse als Spender für die Ernte der epididymal Fett. Von Interesse, ad-MVF auch aus transgenen grün fluoreszierendem Protein (GFP) -positiven Spendertieren (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22 getrennt werden kann. Dies trägt den großen Vorteil , dass die Fragmente durch immunhistochemische Färbung von GFP nach Implantation in GFP-negativen 14 - Wildtyp - Mäuse leicht nachweisbar sind. - Anesthetize die Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von Xylazin (15 mg / kg) und Ketamin (75 mg / kg). Achten Sie darauf, dass die Tiere tief anästhesiert werden durch eine Zehe Prise ohne Antwort ausführt. Augen Schmiermittel ist nicht angezeigt, da die Spendertiere nach Fett Ernte geopfert werden.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Analgesie und chirurgische Sterilität ist in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien des Landes und Institution, wo die Experimente geplant sind.
- Übertragen Sie das Tier auf einem Operationstisch. Legen Sie das Tier in Rückenlage unter einem chirurgischen Stereomikroskop und bestätigen tiefe Narkose toe Prise verwenden.
- Immobilisieren die Pfoten von ihnen zu einem Operationstuch Taping und desinfizieren Lösung des Bauches mit desinfizieren.
- Trennt die Bauchhautschicht frei von der darunter liegenden Muskel mit der Dissektion Schere.
- Durchführen einer Mittellinie Laparotomie mit der Dissektion Schere und seitlich der Klappen der Bauchwand entfalten.
- Bilateral identifizieren , Hoden, Nebenhoden und die epididymalen Fettpolster unter Verwendung der feinen Pinzette (Abbildung 1). Sie nicht die Darm-Strukturen schädigen fäkale Verunreinigung der Fettpolster zu verhindern.
- Ernten Sie die epididymal Fettpolster mit der kleinen Vorbereitung Schere und der feinen Pinzette unter dem Stereomikroskop. Halten Sie einen Sicherheitsabstand von mehreren Millimetern zwischen den Nebenhoden und das Fettdas Risiko einer versehentlichen epididymal Ernte reduzieren.
Hinweis: Dieses Verfahren kann auch ohne Stereomikroskop durchgeführt werden. Jedoch kann dies das Risiko einer versehentlichen Verletzung der Nebenhoden und Samenstränge erhöhen. - Übertragen die epididymalen Fettpolster in eine Petrischale mit 15 ml DMEM vorerwärmt auf 37 ° C für den Transport an die Zelllabor.
- Opfert das Tier durch Einschneiden der Bauchaorta oder zervikaler Dislokation.
4. Isolierung von Ad-MVF
- Bereiten drei sterile Petrischalen mit 15 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), sterile 14-ml-Polypropylen (PP) Röhrchen, einer sterilen 50-ml-Erlenmeyerkolben, steriles 1,5 ml-konisches Mikrozentrifugenröhrchen und sterilisiert feine Schere.
- Waschen Sie die Fettpolster dreimal in Petrischalen mit 15 ml PBS unter einer Laminarströmungshaube.
- Übertragen Sie das Fett in einen 14-ml PP Röhrchen. Bestimmt das Volumen des geernteten Fettgewebes (in ml) mit Hilfe von ter Rohr Skala. Zerkleinert den Fettgewebes mechanisch mit dem feinen Schere bis eine homogene Gewebesuspension erhalten wird.
- Übertragen das zerkleinerte Gewebe mit zwei Volumina Kollagenase NB4G (0,5 U / ml PBS) in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben mit Hilfe von 10-ml-Messpipette. Das Gesamtvolumen wird dreimal das Volumen von Fett in Schritt gemessen Gewebe 4.3. Führen Gewebeverdauungs in einem Inkubator für 10 min unter kräftigem Rühren mittels einem automatisierten Rührer (Größe der magnetischen Rührstab: 25 mm) bei 37 ° C und befeuchtete atmosphärische Bedingungen mit 5% CO 2.
- Beachten Sie einen kleinen Bruchteil (10 & mgr; l) des verdauten Gewebes unter dem Mikroskop, um zu beurteilen, ob die Verdauung gestoppt werden kann. Sicherzustellen , dass der Gärrest enthält hauptsächlich „freie“ ad-MVF neben Einzelzellen, die entsprechende Stelle , welche die enzymatische Verdauung zu stoppen (Abbildung 2).
HINWEIS: Dieser Schritt erfordert Erfahrung mit dem Verfahren und ist von entscheidender Bedeutung für die Qualitätvon Ad-MVF isoliert. Längere Fettverdauung führt zu einer Einzelzellsuspension ohne Ad-MVF. - Neutralisieren des Enzyms mit zwei Volumina PBS / 20% FCS. Das Gesamtvolumen wird dreimal das Volumen der Zellgefäß Suspension in Schritt 4.4. Übertragen Sie die Zell-Schiff Suspension wieder in neue PP Rohren.
- Inkubieren der Suspension für 5 min bei 37 ° C vom restlichen Fett durch die Schwerkraft ad-MVF zu trennen. Dann entfernen Sie vorsichtig den Hauptfettüberstand mit einem 1-ml pipettiert. Wiederholen Sie diesen Zyklus mehrmals mit einem 100-ul pipettiert, bis die Suspension fettfrei zu sein scheint.
- Bringe einen 500-um-Filter auf einem konischen 50 ml-Zentrifugenröhrchen. Übertragen der Zellengefäß Suspension mit einer 10-ml-Messpipette aus den 14-ml-PP-Rohren auf die Filtermembran verbleibende Fett Gerinnsel zu entfernen. Überträgt die filtrierte Suspension in neue 14-ml-PP-Röhrchen nach der Anzahl der einzelnen ad-MVF-Isolaten für die geplanten Experimente.
HINWEIS: in vitro - Assays auf mikrovaskuläre Netzwerkbildung konzentriert, kann es von Vorteil sein , um die Zellsuspension Gefäß zu reinigen die Bildqualität während der mikroskopischen Analysen zu verbessern. Zu diesem Zweck kann die Suspension zusätzlich gefiltert einmal mit einem 20-um-Filter auf einzelne Zellen aus dem ad-MVF auf dem Filter gesammelt zu entfernen. - Zentrifugiere die Zellsuspension Gefäß (600 · g, 5 min, Raumtemperatur) zu erhalten, ein Pellet, die ad-MVF.
- Nach dem Zentrifugieren der Überstand entfernt, bis 1 ml verbleibt. Resuspendieren des Pellets mit ad-MVF in diesem 1 ml und überträgt die Suspension in eine 1,5-ml konischen Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifugiere die ad-MVF Suspension in dem Mikrozentrifugenröhrchen (600 · g, 5 min) um ein Pellet zu erhalten.
- Entfernen Sie den Überstand des Pellets in den gewünschten Endvolumen von PBS / 20% FCS resuspendieren.
HINWEIS: Die Anzahl der Ad-MVF pro Isolat kann durch mikroskopische Zählung bewertet werden. Zu diesem Zweck 1/10 der endgültigen Zell-vessel Suspension wird 1:10 in PBS verdünnt, und 100 ul dieser Verdünnung werden in eine Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen überführt. Die gesamte Anzahl der Ad-MVF eine gefäßartige Morphologie aufweist, wird dann auf die gesamte Isolat gezählt und hochgerechnet. Die erforderliche ad-MVF Konzentrierung und Reinigung können einzeln in vitro an den jeweiligen angepasst werden oder in vivo Anwendung des ad-MVF. Dies kann für die in vitro - Analyse von mikrovaskulären Netzwerkbildung oder der Aussaat von ad-MVF auf Gerüste für die in - vivo - Implantation in Gewebsdefekten die Einbettung von ad-MVF in Kollagengelen umfasst.
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Representative Results
In der vorliegenden Studie führten wir sechs Ad-MVF Isolierungsverfahren mit Fettgewebe von 7- bis 12-Monate alten männlichen Wildtyp-C57BL / 6-Mäuse (mittleres Körpergewicht: 35 ± 1 g). Abbildung 1 zeigt die Ernte von murinen epididymal Fettpolstern mit anschließender mechanischer und enzymatischen Ad-MVF Isolation. Die Zeit für die Ernte von Fett erforderlich war 30 Minuten und für die Isolierung von Ad-MVF betrug 120 min. Insgesamt dauerte die Prozedur 150 min.
Wir geerntet 1,2 ± 0,1 ml pro Fettgewebes Spendertier. Diese Menge an Fett erlaubte die Isolierung von 42.000 ± 2.000 Ad-MVF pro ml. Die mittlere Länge des isolierten ad-MVF betrug 42 ± 1 um (2A). Die Dauer des enzymatischen Verdau wurde mittels mikroskopischer Kontrolle bestimmt , wie in 2B gezeigt. Ad-MVF zeigte eine typische microvessel Morphologie mit hierarchischen vessel Segmente (2C).
Wir gekennzeichnet zusätzlich den ad-MVF mittels Durchflusszytometrie. Zu diesem Zweck ad-MVF wurden weiter in Zellablösung Lösung 15 für 30 Minuten in einzelne Zellen verdaut. Die durchflusszytometrischen Analysen zeigten, dass ad-MVF 26 ± 2% CD31-positiven Endothelzellen enthalten, 17 ± 2% α-Aktin der glatten Muskulatur (SMA) -positiven perivaskuläre Zellen und 9 ± 1% Zellen, die positiv für den mesenchymalen Stammzellmarker CD117 (3A-C). Nach dem Aussäen auf einem dermalen Hautersatz, der fixiert wurde und sofort für histologische Analysen geschnittene größere ad-MVF wurde auf der Implantatoberfläche (Abbildung 3D) hauptsächlich lokalisiert. Jedoch könnte Kapillargefäß Segmente auch innerhalb ihrer Poren detektiert werden. Immunhistochemische Färbung von ausgesät ad-MVF ergab weitere physiologische microvessel Konfiguration mit arteriolar, venulärenund Kapillar-ähnliche Fragmente (Figur 3E).
Abbildung 1: Ad-MVF Isolation. A) Nach der Mittellinie Laparotomie, die epididymal Fettpolster (Sternchen) identifiziert. Das Fettgewebe wird mit einer kleinen Schere Zubereitung geerntet und das Tier wird durch Einschneiden der Bauchaorta (Pfeilspitze) geopfert. B) Mechanische mincing der Fettpolster mit einer feinen Schere bis die Gewebesuspension erscheint homogen. C) Für die enzymatische Verdauung wird Kollagenase auf die Gewebesuspension zugegeben. D) Die Zellsuspension wird Gefäß inkubiert und der Überstand Fettschicht wird verworfen. E) Nach der Zentrifugation die Pellets ad-MVF enthält , wird resuspendiert und kann für verschiedene Anwendungen, wie beispielsweise die in vitro - Analyse von Microvasc verwendet werden ,ular Netzwerkbildung oder die Aussaat von ad-MVF auf Gerüste für die in - vivo - Implantation in Gewebedefekte (F). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Morphologische Merkmale des Ad-MVF. A) Länge Verteilung von frisch isolierten Ad-MVF. Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (n = 6). B) Mikroskopische Aufnahme eines zellGefäßAufhängung Abstrich mit großem (Pfeil), mittlere (Doppelpfeile) und kleine (schwarze Pfeile) ad-MVF sowie einzelne Zellen (weißen Pfeile). Maßstabsbalken = 110 & mgr; m. Eine stärkere Vergrößerung zeigt , dass die Ad-MVF zeigen eine reife microvessel Morphologie mit hierarchischen microvessel Segmente (C,
Abbildung 3: Durchflusszytometrie, histologische und immunhistochemische Merkmale des Ad-MVF. AC) durchflusszytometrische Analysen von frisch isolierten ad-MVF illustriert CD31-positiven Endothelzellen (A), α-SMA-positive perivaskuläre Zelle (B) und CD117-positive mesenchymalen Stammzelle (C) -Fraktionen. Geeignete Isotyp-identische Kontrollen wurden verwendet Schwellenwerte anzupassen. Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (n = 6). D) Hämatoxylin und Eosin-gefärbten Abschnitts eines seeded dermalen Hautersatz. Einige Kapillargefäß Segmente werden in dem Implantat befindet und# 39; s Poren (Pfeilspitzen). Größere microvessels mit venulären (Doppelpfeil) oder Arteriolen (Pfeil) Morphologie auf seiner Oberfläche lokalisiert. Maßstabsbalken = 40 um. Die gestrichelte Linie = Implantat Grenze. E) Charakterisierung von Ad-MVF durch immunhistochemischen Nachweis der endothelialen Zellmarker CD31 (rot) und das perivaskuläre Zellmarker α-SMA (grün). Zellkerne wurden mit einem DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoff (blau) gefärbt. Arteriolären ad-MVF (Pfeil) durch eine dickere α-SMA-positive Zellschicht charakterisiert, verglichen Fragmente mit einer größeren Lumen (Doppelpfeil), um venulären. Pfeilspitzen = Kapillare ad-MVF. Maßstabsbalken = 25 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In dieser Studie stellen wir ein etabliertes Protokoll für die Isolierung von Ad-MVF. Ad-MVF Gewinnung von Maus-Fettgewebe ist ein einfaches Verfahren mit einigen kritischen Schritten. Mäuse zeigen verschiedene subkutane und intraabdominalem Fettdepots. Wie zuvor für Ratten beschrieben, 11 die am besten geeignete Fettquelle für die Isolierung von Ad-MVF sind die epididymal Fettpolster aufgrund ihrer Größe, homogener Struktur und minimaler Kontamination mit größeren Blutgefäßen, 12. Im Gegensatz dazu sind die subkutane Fettablagerungen in Mäusen viel kleiner und haftend an das umgebende Gewebe. Allerdings trägt die Exzision von epididymal Fettpolster das Risiko einer versehentlichen Verletzung der Nebenhoden und Samenstränge, mit Spermien zu einer Kontamination des geernteten Gewebes führt. Daher ist die Identifizierung von Nebenhoden und Hoden Samenstränge von großer Bedeutung in diesem Verfahren. Darüber hinaus sollten die Fettpolster sein rapidly verarbeitet , nachdem ex vivo Gewebeschäden zu minimieren Ernte. Schließlich sollte in Betracht gezogen werden , dass es in der Vaskularisierung von Maus epididymal Fettpolster 23 große altersabhängigen Variationen sind. Nach unserer Erfahrung ist die Verwendung von 6- bis 12 Monate alten männlichen Spendermäuse liefert ausreichende Mengen an Ad-MVF für in - vitro und in - vivo - Studien. Möglich , ad-MVF von jüngeren Mäusen Es kann aber auch zu isolieren, die 24 kleinere , aber gefäßFettPolster aufweisen.
Die enzymatische Verdauung der geernteten epididymal Fettpolster bestimmt entscheidend die endgültige Qualität des isolierten Ad-MVF. Eine zu kurze Exposition zu Kollagenase führt zu einer unvollständigen Trennung der Ad-MVF aus den umliegenden Adipozyten. Auf der anderen Seite, verlängerte Verdauung führt zur Zerstörung des Ad-MVF zu einer einzigen Zellsuspension, die so genannte Stroma Gefäßfraktion (SVF). Die SVF ist ein heterogener Zellpopulation enthält, mesenchymal Stammzellen, Endothelzellen, Perizyten, Makrophagen und viele andere Zelltypen mit regenerativer Potenzial durch parakrine und Differenzierungsmechanismen 25. Die Verwendung von Ad-MVF weist erhebliche Vorteile im Vergleich zu SVF-basierten Ansätzen. Die voll funktionsfähige microvessel Morphologie der Ad-MVF ermöglicht ihre sofortige Implantation in vivo - Experimenten ohne zeitaufwändige und komplexe In - vitro - Kultivierung. Darüber hinaus erfordert die Isolierung des SVF in der Regel die Verdauung des Gewebes mit Kollagenase bis zu 90 min 26. Im Gegensatz dazu sollte Gewebeabbau nicht mehr als 10 min für die Isolierung von ad-MVF. Dies unterstützt die Idee der intraoperativen Einstufen-Anwendungen von Ad-MVF 9. Zu diesem Zweck ad-MVF automatisch aus autologem lipoaspirates und übertragen zurück in einen Gewebedefekt des Patienten, ohne den Operationssaal isoliert werden kann. Dies ist eine realistische goal die Tatsache , dass die automatisierte Isolierung von SVF aus lipoaspirates ist bereits ein klinisch etabliertes Verfahren in der plastischen Chirurgie unter Berücksichtigung 27, 28, 29.
Vor kurzem haben wir eine starke Wirkung von Ad-MVF auf die in vivo Vaskularisierung von Knochen 14 und die Haut 15 Substitute unter Beweis gestellt. Von Interesse fanden wir , dass es nicht zu entfernen , einzelne Zellen aus dem Ad-MVF isolieren, weil sie eine physiologische Umgebung bereitstellen, die 13 auf die hohe Vaskularisierung Kapazität von Ad-MVF trägt vorteilhaft ist. Deshalb haben wir nur einen 500-um-Filter bei der Isolierung von Ad-MVF zur Entfernung von größerem nicht verdaute Fett Klumpen. Darüber hinaus fanden wir , dass Ad-MVF in implantierten Haut induziert Lymphangiogenese 15 ersetzt. Daher Ad-MVF kann auch für lymphat vielversprechende Bausteine werdenic Tissue Engineering und Lymphödem-Therapie.
Für die erfolgreiche Umsetzung dieser experimentellen Befunde in die klinische Praxis, ist der nächste logische Schritt ist zu klären, ob die menschliche Fettgewebe zur Isolierung von Ad-MVF als Nagetier Fett gleichermaßen geeignet ist. In diesem Zusammenhang ist ein kritischer Punkt die Menge an Fett benötigt große Mengen an Ad-MVF zu isolieren. Die hier beschriebene Protokoll führte zu rund 40.000 Ad-MVF pro ml Fettgewebe. Dementsprechend würde 3 mL Fettgewebes notwendig sein , um prevascularize 1 cm 2 des dermalen Hautersatzes 15. Daher kann dieser Ansatz nicht für die Behandlung von größeren Wunden oder schwerkranken Patienten aufgrund einer begrenzten Menge an verfügbarem Fettgewebes für Ad-MVF Isolation machbar sein.
Neben einem breiten Spektrum möglicher Anwendungen in vivo im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin, Ad-MVF eignen sich auch zur in - vitro - Modellierung von angiogenen proczesse. Zum Beispiel Ratten ad-MVF wurde in dreidimensionalen Collagen Hydrogele kultiviert 30 die Bildung neuer mikrovaskuläre Netzwerk zu studieren. Ähnliche Ansätze wurden für die Visualisierung von neovessel Wachstum 13 oder interstitielle Matrixremodulierung während der Angiogenese 31 zu bewerten anspruchsvolle Bildgebungstechniken verwendet.
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Ad-MVF ist nicht nur vielversprechende Vaskularisierung und lymphangiogenetische Einheiten für zukünftige therapeutische Strategien, sondern auch für die Grundlagenforschung auf dem Gebiet der Angiogenese und vaskulärer Physiologie.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die hervorragende technische Unterstützung von Janine Becker, Caroline Bickelmann und Ruth Nickels. (- Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG) - LA 2682 / 7-1 Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
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