Summary
Wij presenteren een protocol voor vetweefsel afgeleide microvasculaire brokken belovend vascularisatie eenheden vertegenwoordigen isoleren. Ze kunnen snel worden geïsoleerd, vereisen geen in vitro verwerking en kunnen aldus worden gebruikt voor één-stap prevascularization op verschillende gebieden van weefselengineering.
Abstract
Een functionele microvasculaire netwerk van centraal belang voor de overleving en integratie van gemanipuleerde weefselconstructen. Voor dit doel zijn verscheidene angiogene en prevascularization strategieën vastgesteld. De meeste cel-gebaseerde benaderingen omvatten tijdrovende stappen in vitro voor de vorming van een microvasculaire netwerk. Ze zijn daarom niet geschikt voor intraoperatieve eenstaps werkwijzen. Vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten (ad-MVF) vertegenwoordigen veelbelovende vascularisatie eenheden. Ze kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit vetweefsel en vertonen een functionele microvaatje morfologie. Bovendien zijn ze snel weer in elkaar in nieuwe microvasculaire netwerken na implantatie in vivo. Daarnaast zijn er ad-MVF aangetoond dat lymfangiogenese induceren. Tenslotte ze een rijke bron van mesenchymale stamcellen, die verder kunnen bijdragen tot hun hoge vascularisatie potentieel. In eerdere studies hebben we de opmerkelijke vascularizati aangetoondop de capaciteit van de ad-MVF in engineered bot en huid substituten. In de huidige studie, doen we verslag van een gestandaardiseerd protocol voor de enzymatische isolatie van ad-MVF uit muizen vetweefsel.
Introduction
Weefselmanipulatie is gericht op de vervaardiging van weefsels en organen vervangingsmiddelen die de functie van inoperabele handhaven herstellen of versterken in vivo tegenhangers 1, 2. Het lot van gemanipuleerde weefselconstructen cruciaal afhangt van een adequate vascularisatie 3. Microvasculaire netwerken binnen deze constructies moeten hiërarchisch worden georganiseerd met kleine slagaders, haarvaten en venulen efficiënte doorbloeding na inoculatie aan het vaatstelsel van de ontvanger 4 mogelijk te maken. Het genereren van dergelijke netwerken is een van de belangrijkste uitdagingen in tissue engineering. Voor dit doel heeft een breed spectrum van experimentele vascularisatie strategieën geïntroduceerd in de afgelopen twee decennia 5, 6.
Angiogene benaderingen stimuleren de ingroei van de ontvanger microvaten in gemanipuleerde tissUES via structurele of fysicochemische modificatie stellage, zoals de opname van groeifactoren 7. Echter, voor de vascularisatie van grote driedimensionale constructies, angiogenese-afhankelijke strategieën sterk beperkt door de langzame groei van het ontwikkelen van microvaten 8.
Daarentegen het begrip prevascularization richt voor het genereren van functionele microvasculaire netwerken binnen weefselconstructen vóór de implantatie 9. Gebruikelijke prevascularization omvat de co-kweek van vat vormende cellen, bijvoorbeeld endotheelcellen, mural cellen of stamcellen 10 binnen steigers. Na de vorming microvasculaire netwerk, kan de prevascularized constructen vervolgens worden geïmplanteerd in weefseldefecten. Opmerkelijk, dit prevascularization aanpak is moeilijk toe te passen in een klinische setting, omdat het is gebaseerd op complexe en tijdrovende in vitro </ em>, welke zijn beperkt door grote obstakels in de regelgeving 9. Derhalve is er nog steeds behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe prevascularization strategieën die meer geschikt zijn voor een brede klinische toepassing zijn.
Prevascularization dergelijke strategie kan de toepassing van vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten (ad-MVF) zijn. ad-MVF vertegenwoordigen krachtige vascularisatie eenheden die in grote hoeveelheden uit het vetweefsel van ratten 11, 12 en 13 muizen worden geoogst. Ze bestaan uit arteriolaire, capillaire en venulaire vat segmenten die een fysiologisch microvaatje morfologie vertonen met een lumen en stabiliserende perivasculaire cellen 14, 15. Deze unieke functie kan de onmiddellijke implantatie van ad-MVF geplaatste steigers in het weefsel gebreken zonder precultivation. Er is de ad-MVF snel weer in elkaar inom functionele microvasculaire netwerken. Bovendien ad-MVF vormen een rijke bron van mesenchymale stamcellen 16, die bovendien kunnen bijdragen tot hun opvallende regeneratievermogen. Dienovereenkomstig worden ad-MVF meer gebruikt in verschillende gebieden van weefselengineering 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
De isolatie van ad-MVF is oorspronkelijk opgericht in ratten 11, 12. Hierin beschrijven we een protocol, dat de gestandaardiseerde isolatie van muizen ad-MVF maakt van epididymale vetkussentjes. Dit kan verder inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ad-MVF functie door het gebruik van transgene muismodellen te bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd volgens de National Institute of richtlijnen Health voor het gebruik van proefdieren en volgde institutionele richtlijnen (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Duitsland).
1. Bereiding van chirurgische instrumenten
- Houden om de dissectie scharen, chirurgische pincet, kleine bereiding scharen, fijne pincet en een steriele Petrischaal met 15 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM, 10% foetaal kalfsserum (FCS), 100 U / ml penicilline, 0,1 mg / ml streptomycine ) voor het oogsten epididymale vetkussentjes.
- Bloot chirurgische instrumenten om een desinfecterende oplossing gedurende 5 min. Alternatief steriliseren (stoomsterilisatie, 121 ° C, 20 min).
2. Dieren en anesthesie
- Kies zorgvuldig de stam van de muizen, zoals aangegeven voor de studie en de onderwerp in onderzoek.
LET OP: In deze studie hebben we gebruik gemaakt mannelijke wild-type C57BL / 6-muizen als donor voor het oogsten van epididymale vet. Van belang is kan ad-MVF ook worden geïsoleerd uit transgene green fluorescent protein (GFP) -positieve donor dieren (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. Dit draagt het grote voordeel dat de fragmenten gemakkelijk door immunohistochemische kleuring van GFP na implantatie in GFP-negatieve wild-type muizen 14. - Verdoven dieren een intraperitoneale injectie van xylazine (15 mg / kg) en ketamine (75 mg / kg). Zorg ervoor dat de dieren diep verdoofd door het uitvoeren van een teen knijpen met geen antwoord. smeermiddel oog wordt niet aangeduid als donordieren worden gedood na vetafname.
OPMERKING: Zorg ervoor dat analgesie en chirurgische steriliteit zijn in overleg met de betrokken richtlijnen van het land en de instelling waaraan de experimenten zijn gepland.
- Breng het dier naar een operatietafel. Plaats het dier in liggende positie onder een chirurgische stereomicroscoop en bevestig diepe anesthesie met behulp van teen knijpen.
- Blokkeer de poten met tape op een chirurgisch laken en desinfecteren de buik met desinfecterende oplossing.
- Scheid de buikhuid vrij van het onderliggende spierlaag met dissectie scharen.
- Voer een middellijn laparotomie met dissectie scharen en zijdelings vouw de flappen van de buikwand.
- Bilateraal identificeren testis, epididymis en de epididymis vetkussentje met de fijne pincet (Figuur 1). Niet schadelijk voor de intestinale structuren om fecale besmetting van de vetkussentjes te voorkomen.
- Oogst de epididymale vetkussentjes met de kleine voorbereiding schaar en de fijne tang onder de stereomicroscoop. Houd een veiligheidsmarge van enkele mm tussen de bijbal en het vetverminderen het risico van accidentele epididymis oogsten.
LET OP: Deze procedure kan ook worden uitgevoerd zonder een stereomicroscoop. Echter, dit kan verder het risico van ongewilde verwondingen van de bijbal en zaadstrengen verhogen. - Breng de epididymale vetkussentjes in een petrischaal met 15 ml DMEM voorverwarmd bij 37 ° C gedurende het transport naar het laboratorium cel.
- Offeren dierlijke insnijding van de abdominale aorta of cervicale dislocatie.
4. Isolatie van ad-MVF
- Bereid drie steriele petrischalen met 15 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), steriele 14 mL polypropyleen (PP) buizen een steriele 50-mL Erlenmeyer steriele 1,5 mL conische microcentrifugebuizen en gesteriliseerd fijne schaar.
- Was de vetkussentjes driemaal in petrischalen met 15 ml PBS onder een laminaire stroming kap.
- Breng het vet in een 14 ml buis PP. Bepaal de hoeveelheid geoogste vetweefsel (in mL) met behulp van tHij buis schaal. Gehakt het vetweefsel mechanisch met een fijne schaar tot een homogene weefselsuspensie wordt verkregen.
- Transfer gehakt weefsel met twee volumina collagenase NB4G (0,5 U / ml PBS) in een 50-mL erlenmeyer met behulp van 10 ml pipet meten. Het totale volume wordt driemaal het volume van vetweefsel gemeten in stap 4.3. Voeren omzetting van weefsel in een incubator gedurende 10 min onder krachtig roeren door middel van een geautomatiseerd roerder (grootte van magnetische roerstaaf: 25 mm) bij 37 ° C en vochtige atmosferische omstandigheden met 5% CO2.
- Zich aan een kleine fractie (10 pi) van het gedigereerde weefsel onder een microscoop te beoordelen of de vertering kan worden. Nagaan of het digestaat bevat voornamelijk "vrije" ad-MVF naast enkele cellen, wat aangeeft het juiste punt op de enzymatische vertering (figuur 2) te stoppen.
OPMERKING: Deze stap vereist ervaring met de procedure en is cruciaal voor de kwaliteitvan geïsoleerde ad-MVF. Langdurige vertering van vet resulteert in een single-cell suspensie zonder ad-MVF. - Neutraliseer het enzym met twee volumina PBS / 20% FCS. Het totale volume wordt driemaal het volume van de suspensie cel-vat in stap 4.4. Breng de cel-suspensie vat terug in nieuwe pp buizen.
- Incubeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 37 ° C tot ad-MVF scheiden van achtergebleven vet door zwaartekracht. Verwijder voorzichtig de fat supernatant met 1 mL precisiepipet. Herhaal deze cyclus meerdere malen met een 100-ul precisiepipet tot de suspensie lijkt vetvrij zijn.
- Zet een 500 pm filter op een 50-ml conische centrifugebuis. Breng de cel-suspensie vat met 10 ml pipet meten van het 14-mL PP buizen op het filter membraan achtergebleven vet stolsels te verwijderen. Breng de gefilterde suspensie in nieuwe 14-mL PP buizen naar het aantal individuele ad-MVF isoleert de geplande experimenten.
LET OP: Voor in vitro assays gericht op de vorming van microvasculaire netwerk kan het gunstig zijn om verder te zuiveren van de cel-suspensie vat de beeldkwaliteit bij microscopische analyse te verbeteren. Daartoe kan de suspensie worden bovendien eenmaal gefilterd met een 20 urn filter om enkele cellen van de ad-MVF verzameld op het filter te verwijderen. - Centrifugeer de cel-suspensie vat (600 xg, 5 min, kamertemperatuur) om een pellet die ad-MVF verkrijgen.
- Na centrifugeren de bovenstaande vloeistof tot 1 ml overblijft. Resuspendeer de pellet met ad-MVF in deze 1 ml en breng de suspensie in een 1,5-ml conische microcentrifugebuis.
- Centrifugeer de ad-MVF suspensie in de microcentrifugebuis (600 xg, 5 min) om een pellet te verkrijgen.
- Verwijder het supernatant van de pellet in de vereiste uiteindelijke volume van PBS / 20% FCS hersuspenderen.
OPMERKING: Het aantal ad-MVF per isolaat kan worden beoordeeld door microscopisch tellen. Voor dit doel, 1/10 van de uiteindelijke cel-vessel suspensie wordt verdund 1:10 in PBS en 100 pi van deze verdunning wordt overgebracht in een putje van een plaat met 96 putjes. Het gehele aantal ad-MVF vertoont een vat morfologie wordt vervolgens geteld en geëxtrapoleerd naar de gehele isolaat. De vereiste ad-MVF concentratie en zuivering kan individueel worden afgestemd op de betreffende in vitro of in vivo toepassing van de ad-MVF. Dit kan de inbedding van ad-MVF collageen gels voor de in vitro analyse van de vorming microvasculaire netwerk of het enten van ad-MVF op draagstructuren voor in vivo implantatie in weefseldefecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit onderzoek voerden we zes ad-MVF isolatie procedures vetweefsel van 7- tot 12-maanden oude mannelijke wild-type C57BL / 6 muizen (gemiddeld lichaamsgewicht: 35 ± 1 g). Figuur 1 toont het oogsten van murine epididymaal vetkussentjes latere mechanische en enzymatische ad-MVF isolatie. De tijd die nodig is voor het oogsten van vet was 30 minuten en voor de isolatie van ad-MVF bedroeg 120 min. In totaal heeft de procedure duurde 150 minuten.
We geoogst 1,2 ± 0,1 ml vetweefsel per donordier. Deze hoeveelheid vet mag de isolatie van 42.000 ± 2.000 ad-MVF per ml. De gemiddelde lengte van de geïsoleerde ad-MVF was 42 ± 1 pm (figuur 2A). De duur van enzymatische digestie werd bepaald door middel van microscopische controle zoals getoond in figuur 2B. ad-MVF vertoonde een typische microvaatje morfologie met hiërarchische vessel segmenten (Figuur 2C).
We bovendien kenmerk ad-MVF middels flowcytometrie. Hiervoor werden ad-MVF verder geknipt in loslaten van cellen gedurende 30 minuten tot enkele cellen 15. De flowcytometrische analyses onthulden dat ad-MVF bevatten 26 ± 2% CD31-positieve endotheelcellen, 17 ± 2% α-gladde spier actine (SMA) -positieve perivasculaire cellen en 9 ± 1% van de cellen positief voor de mesenchymale stamcel marker CD117 (Figuur 3A-C). Na uitzetten op een dermale vervanging, die is vastgesteld en onmiddellijk coupes voor histologische analyses grotere ad-MVF werden hoofdzakelijk gelokaliseerd op het oppervlak van het implantaat (Figuur 3D). Echter, zou capillaire vaatsegmenten ook worden gedetecteerd in zijn poriën. Immunohistochemische kleuring van gezaaid ad-MVF openbaarde verder fysiologische microvasculaire configuratie met arteriolair, venularen capillair-achtige fragmenten (Figuur 3E).
Figuur 1: ad-MVF Isolatie. A) Na de middenlijn laparotomie, worden de epididymale vetkussentjes (sterretjes) geïdentificeerd. Het vetweefsel wordt geoogst met een kleine preparaat schaar en het dier opgeofferd door insnijding van de abdominale aorta (pijlpunt). B) Mechanische hakken van de vetkussentjes met een fijne schaar totdat het weefsel suspensie er homogeen. C) Voor enzymatische digestie, collagenase wordt toegevoegd aan de weefselsuspensie. D) De cel-suspensie vat wordt geïncubeerd en de bovenstaande vetlaag wordt weggegooid. E) Na centrifugeren, de pellet die ad-MVF wordt geresuspendeerd en kan worden gebruikt voor verschillende toepassingen, zoals de in vitro analyse van Microvascular netwerkvorming of zaaien van ad-MVF op draagstructuren voor in vivo implantatie in weefseldefecten (F). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: morfologische kenmerken van ad-MVF. A) Lengte distributie van vers geïsoleerde ad-MVF. Gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (n = 6). B) Microscopische beeld van een cel-suspensie vat uitstrijkje met grote (pijl), middelgrote (dubbele pijlen) en kleine (zwarte pijlpunten) ad-MVF en enkele cellen (witte pijlen). Schaal bar = 110 urn. Hogere vergroting openbaart dat ad-MVF vertonen een volwassen microvaatje morfologie met hiërarchische microvaatjes segmenten (C,
Figuur 3: Flowcytometrische, histologische en immunohistochemische Kenmerken van ad-MVF. AC) Flow cytometrische analyses van vers geïsoleerde ad-MVF illustreert CD31-positieve endotheelcellen (A), α-SMA-positief perivasculaire cellen (B) en CD117-positieve mesenchymale stamcellen (C) fracties. Passende isotype-identieke controles werden gebruikt om drempelniveaus te passen. Gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (n = 6). D) hematoxyline en eosine gekleurde coupe van een geënte dermale vervanging. Enkele capillair vat segmenten in het implantaat &# 39; s poriën (pijlpunten). Grotere microvaatjes met venulaire (dubbele pijl) of arteriolen (pijl) morfologie gelokaliseerd op het oppervlak. Schaalstaaf = 40 urn. Gebroken lijn = implantaat grens. E) Karakterisering van ad-MVF middels immunohistochemische detectie van de endotheelcel merker CD31 (rood) en perivasculaire cel marker α-SMA (groen). Celkernen werden gekleurd met een DNA-bindende fluorescerende kleurstof (blauw). Arteriolaire ad-MVF (pijl) worden gekenmerkt door een dikkere α-SMA-positief cellaag vergelijking met fragmenten venulaire met een groter lumen (dubbele pijl). Pijlpunten = capillaire ad-MVF. Schaalstaaf = 25 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie presenteren we een gevestigde protocol voor de isolatie van ad-MVF. Het verkrijgen van ad-MVF uit muizen vetweefsel is een eenvoudige procedure met een paar kritische stappen. Muizen vertonen verschillende subcutane en intra-abdominale vet. Zoals eerder beschreven voor ratten, de meest geschikte vetbron voor de isolatie van ad-MVF de epididymale vetkussentjes door hun omvang, homogene structuur en minimale verontreiniging met grotere bloedvaten 11, 12. Daarentegen subcutane vetafzettingen in muizen veel kleiner en hechtend aan het omringende weefsel. De excisie van epididymale vetkussentjes draagt het risico van onopzettelijke verwonding van de bijbal en zaadstrengen, waardoor verontreiniging van het verzamelde weefsel met sperma. Daarom is de identificatie van de bijbal, testis en zaadstrengen is van groot belang in deze procedure. Bovendien moet de vetkussentjes rapidl zijny verwerkt na de oogst ex vivo weefselschade te minimaliseren. Tot slot dient te worden overwogen dat er grote leeftijdsafhankelijke variaties in de doorbloeding van muizen epididymaal vetkussentjes 23. In onze ervaring, het gebruik van 6- tot 12-maanden oude mannelijke donor muizen voldoende hoeveelheden van ad-MVF voor in vitro en in vivo studies. Het kan echter ook mogelijk zijn te isoleren ad-MVF jongere muizen, die kleiner maar vaatrijke vetkussentjes 24 vertonen.
De enzymatische vertering van de geoogste epididymale vetkussentjes bepaalt cruciaal de uiteindelijke kwaliteit van geïsoleerde ad-MVF. Te korte blootstelling aan collagenase leidt tot onvolledige scheiding van ad-MVF uit de omliggende adipocyten. Anderzijds, langdurige vertering leidt tot de vernietiging van ad-MVF een enkele celsuspensie, de zogenaamde stromale vasculaire fractie (SVF). De SVF is een heterogene celpopulatie bevattende mesenchymal stamcellen, endotheliale cellen, pericyten, macrofagen en vele andere celtypen met regeneratief potentieel door paracriene en differentiatiemechanismen 25. Het gebruik van ad-MVF vertoont aanzienlijke voordelen ten opzichte van SVF-gebaseerde benaderingen. De volledig functionele microvaatjes morfologie van ad-MVF laat hun onmiddellijke implantatie voor in vivo-experimenten zonder tijdrovend en complex in vitro teelt. Bovendien is de isolatie van de SVF vereist gewoonlijk de vertering van het weefsel met collagenase tot 90 min 26. Daarentegen mag weefselafbraak niet meer dan 10 minuten voor de isolatie van ad-MVF. Dit ondersteunt het idee van intraoperatieve one-step toepassingen van ad-MVF 9. Hiertoe kan ad-MVF automatisch afgesloten van autologe lipoaspirates en opnieuw overgebracht in een weefsel defect van de patiënt zonder het operatiekamer. Dit is een realistische goal gezien het feit dat het automatisch isoleren van SVF uit lipoaspirates is reeds klinisch gevestigde procedure in plastische chirurgie 27, 28, 29.
Onlangs hebben we een sterk effect van ad-MVF op de in vivo vascularisatie van het bot 14 en de huid 15 substituten aangetoond. Van belang, vonden we dat het nuttig is enkele cellen niet te verwijderen uit de ad-MVF te isoleren, omdat zij een fysiologische omgeving die bijdraagt aan de hoge vascularisatie capaciteit van ad-MVF 13 kunnen voorzien. Daarom gebruikten we een 500-um filter tijdens de isolatie van ad-MVF voor het verwijderen van grotere niet-gedigereerd vette stolsels. Bovendien vonden we dat ad-MVF induceren lymfangiogenese in geïmplanteerd huid vervangt 15. Daarom kan ad-MVF ook veelbelovende bouwstenen voor lymphatic tissue engineering en lymfoedeem therapie.
Voor de succesvolle vertaling van deze experimentele bevindingen in de klinische praktijk, de volgende logische stap is om te verduidelijken of menselijk vetweefsel is geschikt voor de isolatie van ad-MVF als knaagdieren vet. In deze context is een kritiek punt is de hoeveelheid vet die nodig is om grote hoeveelheden ad-MVF isoleren. De hierin beschreven protocol resulteerde in ongeveer 40.000 ad-MVF per ml vetweefsel. Dienovereenkomstig zou 3 ml vetweefsel nodig om 1 cm2 huid huidsubstituut 15 prevascularize. Daarom kan deze benadering niet haalbaar is voor de behandeling van grotere wonden of ernstig zieke patiënten te wijten zijn aan een beperkte hoeveelheid beschikbaar vetweefsel voor ad-MVF isolement.
Naast een breed spectrum van mogelijke in vivo toepassingen in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde, ad-MVF zijn ook geschikt voor in vitro modelleren van angiogene procEsses. Zo hebben rat ad-MVF gekweekt zijn in drie-dimensionale collageen hydrogels om de vorming van nieuwe microvasculaire netwerken 30 te bestuderen. Soortgelijke benaderingen zijn gebruikt om geavanceerde beeldvormende technieken voor de visualisatie van neovessel groei 13 of interstitiële matrixomvorming tijdens angiogenese 31 te evalueren.
Tezamen bieden deze bevindingen wijzen erop dat ad-MVF zijn niet alleen veelbelovend vascularisatie en lymfangiogene eenheden voor toekomstige therapeutische strategieën, maar ook voor fundamenteel onderzoek op het gebied van angiogenese en vasculaire fysiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de uitstekende technische ondersteuning van Janine Becker, Caroline Bickelmann en Ruth Nickels. Deze studie werd gefinancierd door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - German Research Foundation) - LA 2682 / 7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
