Summary
我々は、有望な血管新生単位を表し、脂肪組織由来の微小血管断片を単離するためのプロトコルを提示します。それらはインビトロ処理に必要とせず、従って、組織工学の異なる分野でワンステップprevascularizationために使用することができる、迅速に分離することができます。
Abstract
機能的微小血管ネットワークは、改変された組織構築物の生存および統合のための極めて重要重要です。この目的のために、いくつかの血管新生およびprevascularization戦略が確立されています。しかし、ほとんどの細胞ベースのアプローチは、微小血管ネットワークの形成のために時間のかかるインビトロの工程を含みます。したがって、それらは手術ワンステップ手順には適していません。脂肪組織由来の微小血管フラグメント（AD-MVF）が有望な血管新生単位を表します。彼らは簡単に脂肪組織から単離され、機能的な微小血管の形態を示すことができます。また、彼らは急速にin vivoでの移植後の新しい微小血管のネットワークに組み立て直します。また、広告-MVFは、リンパ管新生を誘導することが示されています。最後に、彼らはさらに高い血管新生の可能性に寄与し得る間葉系幹細胞の豊富な源です。以前の研究では、我々は顕著vascularizatiを示しました設計骨や皮膚代替で広告-MVFの容量に。本研究では、我々は、マウスの脂肪組織からの広告-MVFの酵素を単離するための標準化されたプロトコルについて報告します。
Introduction
組織工学は、 インビボの対応1,2 に動作不能の機能を回復または増強、維持、組織および器官代替の製造に焦点を当てています。設計組織構築物の運命は決定的に十分な血管新生3に依存します。これらの構成要素内の微小血管ネットワークが階層的に受信者の血管系4にinosculation後の効率的な血液灌流を可能にするために動脈、毛細血管、および細静脈で整理する必要があります。このようなネットワークの生成は、組織工学における主要な課題の一つです。この目的のために、実験的な血管新生戦略の幅広いスペクトルは、最後の二十年5、6の上に導入されました。
血管新生のアプローチは、設計TISSに受信者の微小血管の成長を刺激しますそのような成長因子7の取り込みなどの構造的または物理化学的骨格修飾によりUEの、。しかし、大規模な3次元構造の血管新生のために、血管新生依存戦略が著しく微小血管8の開発の遅い成長速度によって制限されています。
組織内の機能微小血管ネットワークの世代が前に彼らの移植の9に構築するためにこれとは対照的に、prevascularizationの概念が目指しています。従来prevascularizationは、足場内の内皮細胞、壁画細胞または幹細胞10などの血管形成細胞の共培養を含みます。微小血管ネットワークを形成した後、prevascularized構築物はその後、組織欠損に移植することができます。それは複雑で時間のかかるインビトロに基づいているため、注目すべきは、このprevascularizationアプローチは、臨床現場で適用することは困難です</ em>の主要な規制のハードル9によって制限されている手順、。したがって、広範な臨床応用のために、より適している小説prevascularization戦略の開発の必要性が依然として存在しています。
そのようなprevascularization戦略は、脂肪組織由来の微小血管フラグメント（AD-MVF）のアプリケーションであってもよいです。 AD-MVFラット11、12及びマウス13の脂肪組織から大量に収穫することができる強力な血管新生単位を表します。彼らは細動脈、毛細管、及びルーメンと生理的な微小血管形態を示す細静脈血管セグメント、および安定血管周囲細胞14、15から成ります。このユニークな機能は、前培養することなく、組織欠損に広告-MVF-シードの足場の即時注入することができます。そこでは、広告-MVFは急速で組み立て直します機能的な微小血管ネットワークへ。また、AD-MVFは、さらにその打撃再生能力に寄与し得る間葉系幹細胞16の豊富な供給源を表します。したがって、AD-MVFはますます組織工学14、15、17、18、19、20、21の異なる分野で使用されています。
広告-MVFの単離は、もともとラット11、12に設立されました。ここで、我々は精巣上体脂肪パッドからマウス広告-MVFの標準化された単離を可能にするプロトコルを記述します。これは、トランスジェニックマウスモデルを使用して広告MVF機能の根底にある分子メカニズムさらなる洞察を提供することができます。
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Protocol
すべての手順は、実験動物の使用のための健康ガイドラインの国立研究所に従って実行し、施設のガイドライン（LandesamtエリーゼSoziales、GesundheitウントVerbraucherschutz、アプト。Lebensmittel-ウントVeterinärwesen、Zentralstelle、ザールブリュッケン、ドイツ）を追跡しました。
手術器具の調製
- 10％ウシ胎児血清（FCS）、100U / mLのペニシリン、0.1mg / mlのストレプトマイシン、準備解剖ハサミ、外科用鉗子、小さな調製はさみ、微細鉗子及び15mLのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM滅菌ペトリ皿を保ちます）精巣上体脂肪パッドを収穫するため。
- 5分間消毒液に手術器具を公開します。あるいは、（; 121℃、20分間蒸気滅菌）それらを滅菌。
2.動物および麻酔
- 慎重に研究のために示されているように、マウスの系統を選択し、調査中の対象。
注：本研究では、精巣上体脂肪の収穫のためのドナーとしてのオスの野生型C57BL / 6マウスを使用しました。興味深いのは、AD-MVFは、トランスジェニック緑色蛍光タンパク質（GFP）陽性ドナー動物（C57BL / 6-TG（CAG-EGFP）1Osb / J）22から単離することができます。これは、断片は、GFP陰性野生型マウス14への移植後のGFPの免疫組織化学染色によって容易に検出されている主な利点を負いません。 - キシラジン（15ミリグラム/ kg）およびケタミン（/ kgを75 mg）を腹腔内注射で動物を麻酔。動物が深く無応答とつま先のピンチを実行することにより、麻酔をかけていることを確認してください。ドナー動物の脂肪、収穫後に屠殺されているとして、目の潤滑剤が示されていません。
注：鎮痛および外科無菌性は、実験が計画されている国や機関のそれぞれのガイドラインと一致していることを確認してください。
- 操作テーブルに動物を転送します。手術用実体顕微鏡下仰臥位で動物を置き、つま先のピンチを使用して深い麻酔を確認。
- 手術用ドレープにそれらをテーピングで足を固定化し、解決策を消毒し、腹部を消毒します。
- 解剖ハサミで下の筋肉層のない腹部の皮膚を分離します。
- 解剖ハサミで正中開腹術を実行し、横方向に腹壁のフラップを展開。
- 両側精巣、精巣上体および微細鉗子（ 図1）を用いて、精巣上体脂肪パッドを識別する。 脂肪パッドの糞便汚染を防止するために、腸の構造に害を与えないでください。
- 実体顕微鏡下の小さな準備ハサミと細かい鉗子で精巣上体脂肪パッドを収穫。 副睾丸脂肪の間に数mmの安全マージンを保ちます偶然の精巣上体収穫のリスクを減らします。
注：この手順は、実体顕微鏡なく行うことができます。しかし、これはさらに精巣上体および精索の不慮の損傷のリスクを高める可能性があります。 - 細胞実験室への輸送のために、37℃で予備加熱DMEMの15 mLを含むペトリ皿に精巣上体脂肪パッドを転送します。
- 腹部大動脈または頸椎脱臼を切開することによって動物を生け贄に捧げます。
広告-MVFの4分離
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）15mLの滅菌14-mLのポリプロピレン（PP）チューブ、滅菌50mLの三角フラスコ、滅菌した1.5 mLのコニカルマイクロ遠心チューブ、滅菌微細なハサミで三枚の滅菌ペトリ皿を準備します。
- 層流フードの下でPBS 15mLでペトリ皿に三回脂肪パッドを洗浄します。
- 14-mLのポリプロピレンチューブに脂肪を移します。 Tによって（ML）に採取脂肪組織の量を決定します彼チューブスケール。均質な組織懸濁液が得られるまで微細はさみで機械的に脂肪組織をミンチ。
- ピペットを測定する10ミリリットルを用いて50 mLの三角フラスコにコラゲナーゼNB4G（0.5 U / mLのPBS）2つの容量と細分化した組織を移します。総量は、ステップ4.3で測定された脂肪組織の容積の3倍になります。 37℃、5％CO 2を含む加湿大気条件：自動攪拌機（25ミリメートル磁気攪拌棒のサイズ）によって激しく攪拌しながら10分間インキュベーター内組織消化を行います。
- 消化を停止させることができるかどうかを判断するために顕微鏡下で消化された組織の小部分（10μL）を観察します。消化物は、主に酵素消化工程（ 図2）を停止するための適切なポイントを示し、次の単一細胞への「遊離」AD-MVFが含まれていることを確かめます。
注：この手順は、手順と経験を必要とし、品質のために重要です広告-MVFを単離しました。広告-MVFせずに、単一細胞懸濁液中の脂肪の消化結果を延長しました。 - PBS / 20％FCS 2つの容量を有する酵素を中和します。総体積は、ステップ4.4において、細胞容器懸濁液の体積の3倍となります。新しいPPチューブにバック細胞血管懸濁液を移します。
- 重力によって脂肪残りからAD-MVFを分離するために37°Cで5分間懸濁液をインキュベートします。次いで、注意深く1-mLの精密ピペットで主脂肪上清を除去します。サスペンションは、無脂肪のように表示されるまで、100-μLの精密ピペットでこのサイクルを数回繰り返します。
- 50 mLのコニカル遠心管の上部に500μmのフィルターを置きます。残りの脂肪塊を除去するために濾過膜上に14-mLのPP管からの10-mLのメスピペットを用いて細胞血管懸濁液を移します。個々のAD-MVF計画実験のため分離の数に応じて新たな14-mLのポリプロピレンチューブに濾過した懸濁液を移します。
注：のためにvitrで微小血管ネットワークの形成に焦点を当てOアッセイは、さらに顕微鏡分析の間に結像品質を改善するために、細胞容器懸濁液を精製することが有益であり得ます。この目的のために、懸濁液をさらにフィルター上に集めAD-MVFから単一細胞を除去するために20μmのフィルターで一度ろ過してもよいです。 - 遠心分離機AD-MVFを含むペレットを得るために、細胞容器懸濁液（600×gで、5分間、室温）。
- 1mLのが残されるまで遠心分離後、上清を除去します。この1mLのAD-MVFでペレットを再懸濁し、1.5 mLのコニカル遠心チューブに懸濁液を移します。
- 遠心分離ペレットを得るためにマイクロチューブのAD-MVF懸濁液（600×gで、5分間）。
- PBS / 20％FCSの必要な最終体積でペレットを再懸濁し、上清を取り除きます。
注：分離株あたりの広告-MVFの数は、顕微鏡の計数によって評価することができます。この目的のために、最終細胞-vesseの1/10L懸濁液をPBSで1:10に希釈し、この希釈液の100μLを96ウェルプレートのウェルに移します。容器状の形態を呈するAD-MVFの全体数を計数し、全単離するために外挿されます。必要なAD-MVF濃度および精製は、個々に、インビトロまたはAD-MVF のin vivoアプリケーションでそれぞれに適合させることができます。これは、微小血管ネットワーク形成または組織欠損にインビボで移植するための足場上のAD-MVFの播種のインビトロ分析のためのコラーゲンゲルにおけるAD-MVFの埋め込みを含むことができます。
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Representative Results
本研究では、7〜12ヶ月齢のオスの野生型C57BL / 6マウス（35±1グラムの体重の平均）から、脂肪組織で6 AD-MVF単離手順を行いました。 図1は、後続の機械的および酵素AD-MVF分離有するマウス精巣上体脂肪パッドの採取を示す図です。脂肪の収穫に必要な時間は30分であり、AD-MVFの単離のために120分でした。合計では、手順が150分を要しました。
我々は、ドナー動物あたりの脂肪組織の1.2±0.1ミリリットルを回収しました。脂肪のこの量は、mL当たり42,000±2,000の広告-MVFの分離を可能にしました。単離されたAD-MVFの平均長さは42±1μmで（ 図2A）でした。 図2Bに示すように、酵素消化の持続時間は、顕微鏡制御により決定しました。広告-MVFは、階層的なVESとの典型的な微小血管の形態を示しましたSELセグメント（ 図2C）。
我々はさらに、フローサイトメトリーによって広告MVFを特徴とします。この目的のために、AD-MVFはさらに単セル15内に30分間、細胞剥離溶液中で消化しました。フローサイトメトリーは、AD-MVFが26±2％のCD31陽性内皮細胞、17±2％のα平滑筋アクチン（SMA）陽性血管周囲細胞、および間葉系幹細胞マーカーについて陽性9±1％の細胞が含まれていることを明らかにしましたCD117（ 図3A-C）。組織学的分析のためにすぐに固定し、切片化した真皮皮膚代替、に播種した後、より大きな広告-MVFは、主に、インプラントの表面（ 図3D）に局在していました。しかし、毛細血管の血管セグメントはまた、その細孔内に検出することができました。播種広告-MVFの免疫組織化学染色は、さらに細動脈、細静脈と生理的微小血管構造を明らかにしました毛細管様フラグメント（ 図3E）。
図1：AD-MVF 分離。 A）正中開腹後、精巣上体脂肪パッド（アスタリスク）が識別されます。脂肪組織は、小さな準備ハサミで採取され、動物は腹部大動脈（矢印）の切開によって犠牲にされます。細かいハサミで脂肪パッドのB）機械ミンチ組織懸濁液を均質に表示されるまで。酵素消化のためのC）は 、コラゲナーゼは、組織懸濁液に添加します。 D）細胞容器懸濁液をインキュベートし、上清脂肪層は廃棄されます。 E）は、遠心分離後、AD-MVFを含有するペレットを再懸濁され、そのようなmicrovascのインビトロ分析のような異なる用途に使用することができますウラルネットワーク形成または組織欠損（F）にインビボで移植するための足場上のAD-MVFの播種。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：AD-MVF の形態的特徴。新たに単離されたAD-MVFのA）長さの分布。平均±平均の標準誤差（N = 6）。 B）大（矢印有する細胞血管サスペンション塗抹標本の顕微鏡画像）、中型（二重矢印）および小（黒矢印）AD-MVFならびに単一細胞（白矢印）。スケールバー= 110μmで。より高い倍率は、（Cをその広告MVF呈する階層微小血管セグメントを有する成熟した微小血管形態を明らかにする
図3：フローサイトメトリー、組織学的および広告-MVFの免疫組織化学的特性。 AC）フローサイトメトリーは、新たに単離されたAD-MVF CD31陽性内皮細胞（A）を示す、α-SMA陽性の血管周囲細胞（B）及びCD117陽性の間葉系幹細胞（C）の分画の分析します。適切なアイソタイプ同じコントロールが閾値レベルを調整するために使用しました。平均±平均の標準誤差（N = 6）。 D）ヘマトキシリンおよび播種真皮代用皮膚のエオシン染色切片。いくつかの毛細血管セグメントがインプラントに位置しています＆＃39; S孔（矢印）。細静脈（二重矢印）または動脈（矢印）の形態を有する大規模な微小血管は、その表面に局在しています。 =40μmのスケールバー。破線=インプラントのボーダー。内皮細胞マーカーCD31（赤色）の免疫組織化学的検出および血管周囲細胞マーカーα-SMA（緑）によってAD-MVFのE）キャラクタリゼーション。細胞核は、DNA結合蛍光色素（青色）で染色しました。細動脈AD-MVF（矢印）より大きな内腔（二重矢印）と細静脈の断片と比較した場合、より厚いα-SMA陽性細胞の層によって特徴付けられます。矢頭=キャピラリー広告-MVF。 =25μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、AD-MVFの単離のための十分に確立プロトコルを提示します。マウスの脂肪組織からの広告-MVFを取得することは、いくつかの重要なステップで簡単な手続きです。マウスは異なる皮下および腹腔内脂肪沈着を示します。以前にラットに関して記載したように、AD-MVFの単離のために最も適した脂肪源は、より大きな血管11との均質構造と最小限の汚染、12彼らのサイズに起因精巣上体脂肪パッドです。対照的に、マウスにおける皮下脂肪沈着ははるかに小さく、周囲の組織に対してより接着性です。しかし、精巣上体脂肪パッドの切除は、精子と採取した組織の汚染が生じ、精巣上体および精索の不慮の損傷のリスクを負います。したがって、精巣上体、精巣と精索の識別は、この手順では非常に重要です。また、脂肪パッドはrapidlする必要がありますyはex vivoで組織の損傷を最小限に抑えるために収穫した後に処理します。最後に、マウスの精巣上体脂肪パッド23の血管新生の主要な年齢依存性のばらつきがあることを考慮すべきです。我々の経験では、6〜12ヶ月齢のオスドナーマウスの使用は、インビトロおよびインビボの研究で広告-MVFの十分な量を提供します。しかし、また、小さいが高度に血管脂肪パッド24を示す若いマウスからの広告-MVFを分離することが可能です。
収穫精巣上体脂肪パッドの酵素消化は決定的に分離された広告-MVFの最終的な品質を決定します。コラゲナーゼするにはあまりにも短い博覧会は、周囲の脂肪細胞からの広告-MVFの不完全な分離につながります。一方、単一細胞懸濁液にAD-MVFの破壊における長期消化の結果、いわゆる間質血管系画分（SVF）。 SVFは、Mを含む不均一な細胞集団でありますesenchymal幹細胞、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージおよびパラクリンおよび分化機構25を介して再生能を有する多くの他の細胞型。 SVFベースのアプローチと比較した場合、AD-MVFの使用は、かなりの利点を示します。広告-MVFの完全に機能する微小血管の形態は、 インビトロ栽培で時間がかかり、複雑せずにin vivo実験のための彼らの即時注入することができます。また、SVFの単離は、通常、90分26までコラゲナーゼによる組織の消化を必要とします。対照的に、組織分解は、Ad-MVFの単離のために10分を超えてはなりません。これは、広告-MVF 9の術中ワンステップのアプリケーションのアイデアをサポートしています。この目的のために、AD-MVFは自動的に自己脂肪吸引物から単離することができ、手術室を離れることなく、患者の組織欠損に戻さ。これは現実的なゴア脂肪吸引物からSVFの自動化されたアイソレーションが既に形成外科27、28、29の臨床的に確立された手順であることを考慮リットル。
最近、我々は骨14と皮膚15代替のin vivoでの血管新生の広告-MVFの強力な効果を実証しています。興味深いのは、私たちは、彼らが広告-MVF 13の高い血管新生能力に寄与し、より生理的環境を提供することができるので、分離広告-MVFから単一細胞を除去しないことが有益であることがわかりました。したがって、我々は、より大きな非消化脂肪の塊を除去するための広告-MVFの単離中に500μmのフィルターを使用しました。また、私たちはその広告-MVFが移植された皮膚代替物15にリンパ管新生を誘発ました。このため、広告-MVFもlymphatのためのビルディングブロックを約束することができますIC組織工学やリンパ浮腫療法。
臨床診療へのこれらの実験結果の成功翻訳するために、次の論理的なステップは、ヒト脂肪組織は、げっ歯類の脂肪として広告-MVFの単離にも同様に適しているかどうかを明らかにすることです。この文脈では、重要な問題は、広告-MVFを大量に分離するために必要な脂肪の量です。プロトコル説明ここはmLの脂肪組織あたり約40,000広告-MVFもたらし。従って、3mLの脂肪組織は、皮膚、皮膚代用15から1cm 2 prevascularizeする必要があります。従って、このアプローチは、より大きな創傷またはAd-MVFの単離のための利用可能な脂肪組織の限られた量による重症患者の治療のために実行可能ではないかもしれません。
組織工学と再生医療のin vivoアプリケーションにおける潜在的な広範囲のほかに、広告-MVFはまた、血管新生PROCのin vitroモデル化に適していますesses。例えば、ラットの広告-MVFは、新たな微小血管ネットワーク30の形成を研究するために、三次元コラーゲンハイドロゲルで培養されています。同様のアプローチは、血管新生31中新血管成長13または間質マトリックスリモデリングの視覚化のための高度なイメージング技術を評価するために使用されてきました。
まとめると、これらの知見は、その広告-MVFだけでなく、血管新生および血管生理学の分野における基礎研究のために、今後の治療戦略のための血管新生とリンパ管ユニットを約束されていません示しています。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、ジャニーン・ベッカー、キャロライン・ビッケルマンとルース・ニッケルズの優れた技術支援のために感謝しています。 （ - ドイツ研究協会DFG） - LA 2682 / 7-1この研究は、ドイツForschungsgemeinschaftの助成金によって賄われていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
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