Summary
אנו מציגים פרוטוקול לבודד שברי כלי דם ברקמה שומני נגזרות המייצגים יחידות כלי דם הבטיח. הם יכולים להיות מבודדים במהירות, אינו דורש עיבוד במבחנה, ובכך, ניתן להשתמש prevascularization צעד אחד בתחומים שונים של הנדסת רקמות.
Abstract
רשת כלי דם פונקציונלית היא בעל חשיבות המרכזית להישרדות והאינטגרציה של מבני רקמות מהונדסים. לשם כך, מספר אסטרטגיות אנגיוגנזה ו prevascularization הוקמו. עם זאת, רוב הגישות מבוססות תאים כוללות גוזלת זמן במבחנת צעדים ליצירת רשת כלי דם. לפיכך, הם אינם מתאימים נהלי צעד אחד תוך ניתוחיים. רקמת שומן הנגזרת שברי כלי דם (ad-MVF) מייצג יחידות כלי דם הבטיח. הם יכולים להיות בקלות לבודד מרקמות שומן ולהציג מורפולוגיה microvessel פונקציונלית. יתר על כן, הם להרכיב מחדש במהירות לתוך רשתות כלי דם חדשות לאחר השתלת in vivo. בנוסף, אד-MVF הוכח לגרום lymphangiogenesis. לבסוף, הם מקור עשיר של תאי גזע mesenchymal, אשר עשוי לתרום לפוטנציאל כלי הדם הגבוה שלהם. במחקרים קודמים אנו הדגמנו את vascularizati המדהיםעל יכולת של MVF מודעת תחליפי עצם ועור מהונדסים. במחקר הנוכחי, אנו מדווחים על פרוטוקול סטנדרטי עבור הבידוד אנזימטי של אד-MVF מרקמות שומן בעכברים.
Introduction
הנדסת רקמות מתמקדת הייצור של תחליפי רקמה ואיבר מקיימים, לשחזר או להגדיל את הפונקציה של שמיש ב עמיתיהם vivo 1, 2. גורלם של מבני רקמות מהונדסים תלוי באופן מכריע על כלי דם הולם 3. רשתות כלי דם בתוך המבנים האלה צריכים להיות מאורגנים באופן היררכי עם arterioles, נימים, ו venules לאפשר טפטוף דם יעיל אחרי inosculation אל כלי הדם של הנמען 4. הדור של רשתות כאלה הוא בין האתגרים המרכזיים בתחום הנדסת רקמות. לשם כך, קשת רחבה של אסטרטגיות כלי דם ניסיוני כבר הציגה במהלך שני העשורים האחרונים 5, 6.
גישות אנגיוגנזה לעורר את ingrowth של microvessels הנמען Tiss מהונדסיםUES באמצעות שינוי פיגום מבני או physicochemical, כגון השילוב של צמיחת גורמי 7. עם זאת, עבור כלי דם של המבנים התלת-ממדי גדול, אסטרטגיות תלויי אנגיוגנזה מוגבלים במידה ניכרת בשיעורי צמיחה איטית של פיתוח microvessels 8.
לעומת זאת, מושג prevascularization שואף עבור הדור של רשתות כלי דם פונקציונליות בתוך רקמת הבונה לפני ההשתלה שלהם 9. Prevascularization הקונבנציונלי כרוך לתרבות המשותפת של תאים מייצרי כלי, כגון תאי אנדותל, תאי ציור קיר או תאי גזע 10, בתוך פיגומים. לאחר היווצרות רשת כלי דם, מבני prevascularized לאחר מכן ניתן מושתלים לתוך פגמים ברקמות. ראוי לציון, גישת prevascularization זה קשה ליישם במסגרת רפואית, משום שהיא מבוססת על קומפלקס זמן רב במבחנה </ em> נהלים, אשר מוגבלים על ידי מכשולים רגולטוריים מרכזיים 9. בהתאם לכך, יש עדיין צורך לפיתוח אסטרטגיות prevascularization רומן כי הם יותר מתאימים יישום קליני רחב.
אסטרטגיה כזו prevascularization עשויה להיות היישום של שברי כלי דם נגזר רקמה שומני (ad-MVF). אד-MVF מייצג יחידות של כלי דם חזקים כי ניתן לקצור בכמויות גדולות מרקמת השומן של חולדות 11, 12 ו עכברים 13. הם מורכבים arteriolar, נימים, ומגזרי כלי venular, אשר מציגים מורפולוגיה microvessel פיזיולוגית עם לומן ותאי perivascular ייצוב 14, 15. תכונה ייחודית זו מאפשרת ההשתלה המיידית של פיגומי אד-MVF זרע לתוך פגמי רקמות ללא precultivation. יש, במודעה-MVF במהירות להרכיב מחדש בלרשתות כלי דם פונקציונליות. יתר על כן, אד-MVF מייצג מקור עשיר של תאי גזע mesenchymal 16, אשר עשוי גם לתרום יכולת ההתחדשות הבולטת שלהם. בהתאם לכך, אד-MVF משמש יותר ויותר בתחומים שונים של הנדסת רקמות 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
בידודו של אד-MVF כבר נקבע במקור בחולדות 11, 12. בזאת, אנו מתארים פרוטוקול, אשר מאפשר בידוד הסטנדרטי של MVF מודעה בעכברים מן רפידות שומן epididymal. זה עשוי לספק תובנות נוספות המנגנונים המולקולריים שבבסיס פונקציה אד-MVF באמצעות מודלים עכבר מהונדס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים בוצעו על פי המכון הלאומי הנחיות הבריאות לשימוש בחיות מעבדה ועקבו הנחיות מוסדיים (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, אבט. Lebensmittel- und Veterinärwesen, ה"צנטרלשטלה", זארבריקן, גרמניה).
1. הכנת מכשירים כירורגיים
- שמור מוכנים מספריים לנתיחה, מלקחיים כירורגיים, מספרי הכנה קטנים, מלקחיים בסדר צלחת פטרי סטרילית עם 15 בינוני הנשר השונים של המ"ל Dulbecco (DMEM; 10% נסיוב עגל עוברי (FCS), 100 פניצילין U / mL, 0.1 מ"ג / mL סטרפטומיצין עבור) קציר רפידות שומן epididymal.
- לחשוף את מכשירי ניתוח לפתרון חיטוי עבור 5 דקות. לחלופין, לעקר אותם (עיקור קיטור; 121 ° C, 20 דקות).
2. בעלי חיים הרדמה
- בחר בקפידה את זן של עכברים כמצוין לחקר ואת הנושא תחת חקירה.
הערה: במחקר זה השתמשנו C57BL / 6 עכברי-בר זכר כתורמות עבור קצירת השומן epididymal. מעניין, אד-MVF ניתן לבודד גם מחלבון ניאון ירוק מהונדסות (GFP) חיות תורמות -positive (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. זו נושאת את היתרון העיקרי שרסיסי ניתנים לזיהוי בקלות על ידי מכתים immunohistochemical GFP לאחר ההשתלה לתוך עכברי-בר GFP שלילי 14. - להרדים את החיות עם זריקה intraperitoneal של xylazine (15 מ"ג / ק"ג) ו קטמין (75 מ"ג / ק"ג). ודא כי בעלי החיים מורדמים עמוק על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן עם כל תגובה. חומר סיכת עין אינה שמוזכר בתור החיות התורמות מוקרבות לאחר קצירת שומן.
הערה: ודא כי שיכוך כאבים ועקר כירורגיים עולים בקנה אחד עם ההנחיות המתאימות של המדינה ואת המוסד שבו הניסויים מתוכננים.
- מעבירים את החיה אל שולחן הניתוח. מניחים את חיה במצב שכיבה תחת סטראו כירורגי לאשר הרדמה עמוקה באמצעות צביטה הבוהן.
- לשתק את הכפות ידי מקליט אותם לעטוף כירורגית ולחטא את הבטן עם חיטוי פתרון.
- הפרד את עור הבטן ללא שכבת השריר הבסיסית עם מספריים לנתיחה.
- בצעו פיום קו האמצע עם מספריים לנתיחה ו רוחבית נפרשים סגר היטב את דופן הבטן.
- בילטרלי לזהות האשכים, יותרת האשך ואת כרית שומן epididymal באמצעות מלקחיים עדינים (איור 1). אל תפגעו מבני המעיים כדי למנוע זיהום צואתי של רפידות השומן.
- קציר רפידות שומן epididymal עם מספרי הכנה קטנים מלקחי הקנס תחת סטראו. שמור מרווח ביטחון של כמה מ"מ בין יותרת האשך ואת השומןלהפחית את הסיכון של קצירת epididymal בשוגג.
הערה: הליך זה יכול להתבצע גם ללא סטראו. עם זאת, זה עלול להגביר עוד יותר את הסיכון של פגיעה בשוגג של יותרת האשך ואת מיתרי הזרע. - העברת רפידות שומן epididymal לתוך צלחת פטרי המכילה 15 מיליליטר של DMEM מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס להובלה למעבדת התא.
- להקריב את החיה על ידי חתך של אבי העורקים בבטן או נקע בצוואר הרחם.
בידוד 4. של אד-MVF
- הכן שלוש מנות סטרילי פטרי עם 15 מ"ל של בופר פוספט (PBS), פוליפרופילן 14 מ"ל סטרילי (PP) צינורות, בקבוק 50 מ"ל Erlenmeyer סטרילית, צינורות microcentrifuge חרוטי 1.5-מ"ל סטרילי מספריים קנס מעוקר.
- שלוש פעמים לשטוף את רפידות שומן בצלחות פטרי עם 15 מ"ל של PBS מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית.
- מעבירים את השומן לתוך צינור 14 מ"ל PP. לקבוע את עוצמת הקול של רקמת שומן שנקטפה (ב מיליליטר) באמצעות tהוא בהיקף הצינור. לרכך את רקמת השומן מכאני עם המספריים בסדר עד השעית רקמה הומוגנית מתקבלת.
- העברת רקמה טחון עם שני כרכים של collagenase NB4G (0.5 U / mL PBS) לתוך בקבוק 50 מ"ל Erlenmeyer באמצעות 10 מ"ל מדידת פיפטה. הנפח הכולל הופך שלוש פעמים את נפח רקמת שומן נמדדה צעד 4.3. בצע לעיכול רקמה באינקובטור במשך 10 דקות תחת בחישה נמרצת באמצעות בוחש אוטומטי (בגודל של בר ומערבבים מגנטי: 25 מ"מ) ב- 37 ° C ותנאים אטמוספריים humidified עם 5% CO 2.
- שימו שבריר קטן (10 μL) של הרקמה מתעכל תחת מיקרוסקופ כדי לשפוט האם ניתן לעצור את תהליך העיכול. שיבטיח כי העיכול בעיקר מכיל "חינם" אד-MVF ליד תאים בודדים, המציין את הנקודה המתאימה כדי לעצור את תהליך עיכול אנזימטי (איור 2).
הערה: שלב זה דורש ניסיון עם ההליך הוא קריטי לאיכותשל אד-MVF מבודד. ממושכת תוצאות עיכול שומן השעית תא בודד ללא פרסומות MVF. - לנטרל את האנזים עם שני כרכים של PBS / 20% FCS. הנפח הכולל הופך שלוש פעמים את עוצמת הקול של השעית תא-כלי בשלב 4.4. מעביר את השעית תא-כלי בחזרה לתוך צינורות PP חדשים.
- לדגור על השעיית עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס להפריד אד-MVF מן הנותרים שומן על ידי כוח הכבידה. אז בזהירות להסיר את supernatant השומן העיקרי עם טפטף דיוק 1-מיליליטר. חזור על מחזור זה כמה פעמים עם טפטף דיוק 100-μL עד ההשעיה שנראית ללא שומן.
- שים מסנן 500 מיקרומטר על גבי צינור צנטריפוגות חרוטי 50 מ"ל. מעבירים את ההשעיה-כלי התא עם טפטפת מדידה 10 מ"ל מן הצינורות PP 14 מ"ל על הממברנה הסינון כדי להסיר הנותרים קרישי שומן. מעבירים את ההשעיה מסונן לתוך צינורות חדשים 14 מ"ל PP לפי מספר מודעה-MVF הפרט מבודד עבור הניסויים המתוכננים.
הערה: ב vitrמבחני o התמקדות ביצירת רשת כלי הדם, זה עשוי להיות מועיל יותר כדי לטהר את ההשעיה-כלי התא כדי לשפר את איכות ההדמיה במהלך ניתוחים מיקרוסקופיים. לשם כך, על השעיית ניתן לסנן גם פעם עם מסנן 20 מיקרומטר להסיר תאים בודדים מהמודעה-MVF שנאספו על המסנן. - צנטריפוגה ההשעיה-כלי התא (600 XG, 5 דקות, בטמפרטורת החדר) כדי להשיג גלולה המכילה אד-MVF.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant עד 1 מ"ל שנשאר. Resuspend גלולה עם אד-MVF ב 1 זה מ"ל ולהעביר את ההשעיה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל חרוטית.
- צנטריפוגה ההשעיה אד-MVF בצינור microcentrifuge (600 XG, 5 דק ') כדי להשיג גלולה.
- הסר את supernatant מחדש להשעות את הגלולה בהיקף הסופי הנדרש של PBS / 20% FCS.
הערה: מספר המודעה-MVF לכל לבודד ניתן להעריך על ידי ספירה מיקרוסקופית. לשם כך, 1/10 של התא-vesse הסופיl ההשעיה היא מדוללת 1:10 ב PBS ו 100 μL של דילול זה מועברים לתוך באר של צלחת 96-היטב. המספר השלם של אד-MVF מציג מורפולוגיה כלי דמוי נספר אז אקסטרפולציה לבודד כולו. ריכוז אד-MVF נדרש וטיהור ניתן להתאים באופן אישי את המתאימים במבחנה או ביישום vivo של אד-MVF. זה יכול לכלול את וההטבעה של MVF המודעה ג'ל קולגן לניתוח במבחנה של היווצרות רשת כלי דם או הזריעה של אד-MVF על פיגומים להשתלת in vivo לתוך פגמים ברקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר הנוכחי ביצענו שש פרוצדורות בידוד אד-MVF עם רקמת השומן בין 7 ל wild-type זכר בן 12 חודש C57BL / 6 עכברים (משקל הגוף הממוצע: 35 ± 1 g). איור 1 מדגים את הקצירה של רפידות שומן epididymal בעכברים עם בידוד מכנים האנזימטית שלאחר מכן אד-MVF. הזמן הדרוש קצירת השומן היה 30 דקות ו לבידוד של אד-MVF היה 120 דקות. בסך הכל, ההליך לקח 150 דקות.
אנו קוצרים 1.2 ± 0.1 מיליליטר של רקמת שומן לכל חיה תורמת. סכום זה של שומן אפשר הבידוד של 42,000 ± 2000 אד-MVF לכל מיליליטר. אורכו הממוצע של-MVF המודעה הבודד היה 42 ± 1 מיקרומטר (איור 2 א). משך עיכול אנזימטי נקבע על ידי אמצעי השליטה מיקרוסקופית כפי שמוצג באיור 2B. אד-MVF הציג מורפולוגיה microvessel טיפוסית עם Ves ההיררכימגזרי SEL (איור 2C).
אנחנו גם שאפיינו את המודעה-MVF באמצעות cytometry זרימה. לשם כך, אד-MVF היה מתעכל נוסף לפתרון ניתוק תא למשך 30 דקות לתוך אחד תאים 15. תזרים cytometric הניתוח גילה כי ad-MVF לכלול 26 ± 2% תאי אנדותל חיובי CD31, 17 ± 2% יקטינו שריר α-חלקה (SMA) תאי perivascular -positive, ו 9 ± 1 תאי% חיוביים עבור הסמן בתאי גזע mesenchymal CD117 (איור 3A-C). לאחר זריעת על תחליף עור עורי, אשר היה קבוע מחולק באופן מיידי עבור ניתוחים היסטולוגית, גדול אד-MVF היו נקודתיים בעיקר על פני השטח של השתל (איור 3D). עם זאת, פלחי כלי נימים יכולים גם להתגלות בתוך הנקבוביות שלה. מכתים immunohistochemical-MVF מודעה זורע עוד חשף תצורת microvessel פיסיולוגי עם arteriolar, venularושברים דמויי נימים (האיור 3E).
איור 1: בידוד אד-MVF. א) בעקבות פיום קו האמצע, ריפוד השומן epididymal (כוכביות) מזוהים. רקמת השומן היא שנקטפה עם מספרי הכנה קטנים החי הוא הקריב ידי חתך של אב העורקים בבטן (חץ). B) מִצטַעֲצֵעַ מכניות של רפידות שומן עם מספריים בסדר עד השעית הרקמות מופיעה הומוגנית. ג) עיכול אנזימטי, collagenase מתווסף השעית הרקמות. ד) השעית תא-כלי מודגרות ואת שומן supernatant השכבה נמחקת. לאחר צנטריפוגה E), גלולה המכילה אד-MVF הוא resuspended והוא יכול לשמש עבור יישומים שונים, כגון ניתוח חוץ גופית של microvascהיווצרות רשת ular או הזריעה של אד-MVF על פיגומים להשתלת in vivo לתוך פגמי רקמות (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מאפיינים מורפולוגיים של אד-MVF. א) חלוקת אורך-MVF מודעה המבודד טרי. ± ממוצע סטיית התקן של הממוצע (n = 6). B) תמונה מיקרוסקופית של משטח השעית תא-כלי עם גדול (חץ), בינוניים (חצים כפולים) וקטן (ראשים חץ שחור) אד-MVF כמו גם תאים בודדים (ראשי חץ לבנים). סרגל קנה מידה = 110 מיקרומטר. הגדלה גבוהה מגלה כי התערוכה אד-MVF מורפולוגיה microvessel בוגרת עם פלחי microvessel היררכית (C,
איור 3: תזרים Cytometric, היסטולוגית מאפייני אימונוהיסטוכימיים של אד-MVF. AC) זרימה cytometric מנתח של תא האנדותל CD31 חיובי הממחישות-MVF מודעה מבודדים טרי (א), α-SMA-חיובי תא perivascular (B) ו CD117 חיובי תאי גזע mesenchymal (C שברים). שולט אלוטיפ זהה מתאים שמשו להתאים רמות סף. ± ממוצע סטיית התקן של הממוצע (n = 6). D) Hematoxylin וסעיף מוכתם eosin של תחליף עור עורי זרע. כמה מגזרים כלי נימי ממוקמים השתל &# 39; s נקבובית (ראשי חץ). גדול microvessels עם venular (חץ כפול) או arteriolar (חץ) מורפולוגיה הם נקודתיים על פני השטח שלה. בר סולם = 40 מיקרומטר. קו שבור = גבול שתל. E) אפיון של אד-MVF באמצעות זיהוי אימונוהיסטוכימיים של הסמן תא האנדותל CD31 (אדום) ואת α-SMA סמן תא perivascular (ירוק). גרעין התא הוכתמו פלורסנט לצבוע מחייב-DNA (כחול). אד-MVF arteriolar (חץ) מאופיינים עבה שכבת התאים α-SMA-חיובי בהשוואה venular שברי עם לומן גדול (חץ כפול). ראשי חץ = נימי אד-MVF. בר סולם = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול ומבוסס על הבידוד של אד-MVF. קבלת פרסומות MVF מרקמות שומן בעכברים היא הליך פשוט עם כמה צעדים קריטיים. עכברים להפגין תת עורית שונה ופיקדונות שומן intraabdominal. כפי שתואר לעיל עבור חולדות, מקור שומן המתאים ביותר עבור בידוד של אד-MVF הם רפידות שומן epididymal בשל גודלם, מבנה הומוגני זיהום מינימלי עם כלי דם גדול 11, 12. לעומת זאת, מצבורי שומן תת עורי בעכברים הם הרבה יותר קטנים יותר חסיד אל הרקמה שמסביב. עם זאת, כריתה של רפידות שומן epididymal נושא בסיכון של פגיעה בשוגג של יותרת האשך ואת מיתרי הזרע, וכתוצאה מכך זיהום של הרקמה שנקטפו עם זרע. לכן, זיהוי של יותרת האשך, האשכים ואת מיתרי הזרע הינה בעלת חשיבות רבה בהליך זה. יתר על כן, ריפוד השומן צריך להיות rapidly מעובד לאחר הקטיף כדי למזער לשעבר vivo נזק לרקמות. לבסוף, יש לשקול את זה כי יש וריאציות עיקריות תלוי גיל כלי הדם של רפידות שומן epididymal בעכברי 23. מניסיוננו, השימוש 6 ל- עכברים תורמים זכרו 12 חודשים ישנים מספק כמויות מספיקות של אד-MVF עבור במבחנה במחקרי vivo. עם זאת, זה יכול להיות גם אפשרי לבודד את המודעה-MVF מעכברים צעירים, אשר מציגים קטנות אבל מאוד vascularized רפידות שומן 24.
העיכול אנזימטי של רפידות שומן epididymal שנקטפו מכריע קובע את האיכות הסופית של MVF מודעה המבודד. אקספוזיציה קצרה מדי כדי collagenase מובילה חוסר הפרדת אד-MVF מ adipocytes שמסביב. מצד השני, תוצאות עיכול ממושכי חורבן אד-MVF כדי השעית תא בודדת, שבר כלי הדם שנקראת סטרומה (SVF). SVF הוא מטר המכיל אוכלוסייה הטרוגנית תאתאי גזע esenchymal, תאי אנדותל, pericytes, מקרופאגים סוגי תאים רבים אחרים עם פוטנציאל ההתחדשות באמצעות מנגנונים paracrine והבחנה 25. השימוש אד-MVF מציג יתרונות משמעותיים בהשוואה גישות מבוססות SVF. מורפולוגיה microvessel הפונקציונלית המלא של אד-MVF מאפשרת ההשתלה המיידית שלהם בניסויי vivo בלי זמן רב ומורכב בטיפוח במבחנה. יתר על כן, את הבידוד של SVF בדרך כלל דורש עיכול של רקמת עם collagenase עד 90 דק '26. לעומת זאת, ניוון רקמות לא יעלה על 10 דקות לבידוד של אד-MVF. זה תומך ברעיון של יישומי צעד אחד תוך ניתוחיים של אד-MVF 9. לשם כך, אד-MVF ניתן לבודד אוטומטית lipoaspirates אוטולוגי והועבר בחזרה פגם רקמות של המטופל מבלי לעזוב את תיאטרון הפעולה. זהו גואה מציאותיl בהתחשב בעובדה הבידוד האוטומטי של SVF מן lipoaspirates הוא כבר הליך הוקם קלינית ניתוחים פלסטיים 27, 28, 29.
לאחרונה, אנו הדגמנו השפעה חזקה של אד-MVF על כלי דם in vivo של 14 עצם ועור 15 תחליפים. מעניין, מצאנו שזה מועיל שלא להסיר תאים בודדים מהמודעה-MVF לבודד, משום שהם עשויים לספק סביבה פיזיולוגית יותר שתורמת ליכולת כלי הדם הגבוהה של 13 אד-MVF. לכן, אנחנו רק השתמשנו במסנן 500 מיקרומטר במהלך הבידוד של אד-MVF להסרת קרישי שומן בלתי מעוכל גדולים. יתר על כן, מצאנו כי ad-MVF לגרום lymphangiogenesis בעור מושתל תחליפי 15. לפיכך, מודעות-MVF יכול להיות גם מבטיח אבני הבניין lymphatהנדסת רקמות IC וטיפול בצקת לימפתית.
על התרגום המוצלח של ממצאים הניסיוניים אלה לתוך פרקטיקה קלינית, הצעד ההגיוני הבא הוא לברר האם רקמת שומן אדם מתאימה באותה מידה עבור הבידוד של אד-MVF כשומן מכרסם. בהקשר זה, נושא קריטי הוא כמות השומן הנדרשת כדי לבודד כמויות גדולות של אד-MVF. בזאת המתואר בפרוטוקול הביא כ 40,000 אד-MVF לכל רקמות שומן מ"ל. לפיכך, 3 מ"ל שמן רקמות יהיה צורך prevascularize 1 ס"מ 2 של תחליף עור עורי 15. לפיכך, גישה זו עשויה להיות לא ריאלית לטיפול בפצעים גדולים או חולים קשים בשל כמות מוגבלת של רקמות שומן זמינות עבור בידוד אד-MVF.
לצד קשת רחבה של פוטנציאל ביישומים vivo בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, אד-MVF מתאימים גם הדוגמנות במבחנה של proc אנגיוגנזהesses. לדוגמה, מודעה-MVF חולדה כבר בתרבית הידרוג'ל קולגן תלת ממדי כדי לחקור היווצרות רשתות כלי הדם החדשים 30. בדומה לגישות שמשו להעריך טכניקות הדמיה מתוחכמות להדמיה של צמיחת neovessel 13 או שיפוץ מטריצת ביניים במהלך אנגיוגנזה 31.
יחדיו, ממצאים אלה מצביעים על כך אד-MVF אינו מבטיח רק כלי דם ויחידות lymphangiogenic לאסטרטגיות טיפוליות בעתיד, אלא גם למחקר בסיסי בתחום אנגיוגנזה ופיזיולוגית כלי דם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים על הסיוע הטכני המצוין של ג'נין Becker, קרוליין Bickelmann ורות ניקלס. מחקר זה מומן על ידי מענק של (DFG - קרן המחקר הגרמנית) - LA 2682 / 7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
