Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

إعداد على نطاق متوسط ​​من Published: May 30, 2017 doi: 10.3791/55804
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Biology Department, University of Massachusetts Boston, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نهج مباشر وغير مكلفة لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط ​​(0.5-1 ز) وإعداد مقتطفات البروتين التي يمكن استخدامها في التطبيقات البروتين المصب، مثل تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس ).

Abstract

أصبح تحليل التفاعلات البروتينية البروتين نهجا لا غنى عنه لدراسة العمليات والآليات البيولوجية، مثل إشارات الخلية، وتطوير الكائن الحي، والمرض. وغالبا ما يكون من المرغوب فيه للحصول على معلومات مؤشر أسعار المنتجين باستخدام في الجسم الحي المواد، للحصول على وجهة نظر الأكثر طبيعية وغير منحازة من شبكات التفاعل. ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر هو منصة ممتازة لدراسة مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي ، ويتيح نفسه لنهج واضحة لعزل المواد للتجارب البيوكيميائية. على وجه الخصوص، تمثل الأجنة ذبابة الفاكهة نوع مناسب من الأنسجة لدراسة مؤشر أسعار المنتجين، ويرجع ذلك إلى سهولة جمع الحيوانات في هذه المرحلة التنموية وحقيقة أن غالبية البروتينات وأعرب في التطور الجنيني، وبالتالي توفير بيئة ذات صلة للكشف عن معظم مؤشر أسعار المنتجين. هنا نقدم بروتوكول لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط ​​(0.5-1 ز)، وهو مبلغ مثالي لمجموعة واسعة منتطبيقات البروتين، بما في ذلك تحليل مؤشر أسعار المنتجين من قبل تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس). نحن تصف تصاميمنا ل 1 L و 5 L أقفاص لمجموعات الجنين التي يمكن أن تكون بسهولة وتكلفة اقامة في أي مختبر. ونحن نقدم أيضا بروتوكول عام لجمع الجنين واستخراج البروتين لتوليد ليسيتس التي يمكن استخدامها مباشرة في التطبيقات المصب مثل أب-مس. هدفنا هو توفير وسيلة متاحة لجميع الباحثين لتنفيذ تحليلات مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي .

Introduction

الشاشات الجينية، ومؤخرا، النهج الجينومية ثورة في دراسة الوظائف البيولوجية. ومع ذلك، يتم ترميز المعلومات الخلوية الهامة في البروتينات ومجموعتها من الشركاء المتفاعلين. في حين أن شاشات المعدل الجيني التقليدية يمكن تحديد مكونات مسار الحد من معدل واستعادة التفاعلات غير المباشرة، وقوة النهج البروتين يكمن في قدرتها على تحديد شبكات التفاعل الفوري الكامل للبروتينات ذات الاهتمام. وبالتالي، فإن بروتيوميكس طريقة متعامدة قيمة لدراسة النظم البيولوجية، ويكمل علم الجينوم، ترانسكريبتوميكس، والشاشات الوراثية التقليدية. وقد أثبتت تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس) أن يكون نهجا قويا لدراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي) في بيئتهم الأصلية في الخلايا والأنسجة 1 ، 2 . وتسمح هذه الطريقة بتحديد التفاعلات المباشرة أو غير المباشرة في تطوير معينمراحل أو سياقات الأنسجة، وقد استخدمت بنجاح لتحديد متعددة مؤشرات الأداء القياسية الرواية في مجموعة متنوعة من المسارات التنموية (استعرض في المرجع 1 ). على الرغم من النجاح الذي لا جدال فيه لدراسات مؤشر أسعار المنتجين، معظمها قد نفذت في الخلايا المستزرعة، حيث تم الإفراط في التعبير عن البروتينات "الطعم" من الفائدة. هناك نوعان من القضايا مع دراسة مؤشر أسعار المنتجين في زراعة الخلايا: أولا، قد لا يوفر خط خلية محددة مجموعة كاملة من التفاعلات بسبب عدم التعبير عن بعض البروتينات. ثانيا، أوفيركسريسيون عالية عادة ما تستخدم في مثل هذه التحليلات قد تؤدي إلى القطع الأثرية مثل بروتين ميسفولدينغ أو تحديد تفاعلات إيجابية كاذبة.

كل من هذه القيود يمكن التغلب عليها من خلال تحليل مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي . وهناك خطوة محدودة في مثل هذه التجارب هو توافر المواد انطلاق لتنقية المجمعات البروتين. وقد استخدمت منذ فترة طويلة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر كنموذج لتحليل وظيفيوقد ثبت مؤخرا أنه نظام ممتاز لدراسة مؤشرات أسعار المنتجين في الجسم الحي . يمثل تجنين ذبابة الفاكهة نوع الأنسجة جذابة بشكل خاص لدراسة مؤشر أسعار المنتجين، لأن الأجنة يمكن جمعها بسهولة بكميات كبيرة، وأيضا لأن معظم الجينات (> 88٪) يتم التعبير عن مسار التطور الجنيني، وبالتالي توفير غنية في بيئة الجسم الحي للكشف عن ذات الصلة مؤشر أسعار المنتجين 3 .

تقليديا، والدراسات البيوكيميائية في الذباب تستخدم جدا على نطاق واسع مجموعات الجنين (100-150 ز)، مثل تلك اللازمة لتنقية ليسيتس النسخي وظيفية 4 ، 5 . الدراسات السابقة أب- مس في ذبابة الفاكهة تحتاج أيضا كميات كبيرة من الأجنة (5-10 ز)، لأنها اعتمدت على نهج تنقية من خطوتين مثل جنبا إلى جنب تنقية تقارب (تاب)، مع فقدان المرتبطة من المواد في كل خطوة 6 . كبير أمونتيسي من المواد البدء في إنشاء مجموعات الجنين في أقفاص سكانية كبيرة، والتي يمكن أن تكون على حد سواء باهظة الثمن (عند شراؤها تجاريا) وتستغرق وقتا طويلا للحفاظ على ونظيفة 7 ، 8 ، 9 .

التطورات الأخيرة في تطوير نهج تنقية تقارب خطوة واحدة، فضلا عن حساسية متزايدة من مطياف الكتلة، وخفضت الكمية اللازمة من المواد بدءا من قبل حجم من الحجم. باستخدام علامات مثل الببتيد ستريبتافيدين ملزم (سبب) أو بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) والبدء من أقل من 1 غرام من الأجنة، فمن الممكن لعزل كميات من البروتين الطعم والتفاعل المكونات التي ستكون كافية لتحديد من قبل مطياف الكتلة 10 ، 11 .

الهدف من البروتوكول المعروضة هنا هو مساعدة الباحثين أوفيركولي حاجز ينظر إلى التحليل البيوكيميائية من مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي . تحقيقا لهذه الغاية، ونحن نقدم إجراء بسيط وغير مكلفة لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط ​​(0.5-1 ز)، تليها خطوة واحدة إعداد مقتطفات البروتين كامل الخلية التي هي مناسبة لتحليل لاحق من قبل أب-مس أو نهج أخرى . يعتمد أسلوبنا على استخدام 1-L أو 5-L أقفاص السكان حسب الطلب التي يمكن أن تنتج بسهولة من قبل أي مختبر. وعلاوة على ذلك، تم التحقق من صحة ظروف الاستخراج المعروضة هنا في العديد من الدراسات، سواء في الخلايا المستزرعة وفي الجسم الحي 10 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد 5 L أقفاص يطير (لتتناسب مع 15 سم لوحات)

  1. الحصول على المواد اللازمة: 5-كوارت (4.7-L) الحاويات مع غطاء ( الشكل 1A )، شبكة النايلون، وشفرة الحلاقة.
  2. علامة دائرة قطرها 12 سم وقطع حفرة في الجزء السفلي من الحاوية باستخدام شفرة حلاقة ( الشكل 1B ). قطع حفرة قطرها 15 سم في الغطاء ( الشكل 1C ).
  3. قطع شبكة النايلون في 25 × 25 سم الساحات.
  4. وضع شبكة على حافة العلوي من الحاوية واضغط لأسفل مع غطاء ( الشكل 1C ). تأكد من أن شبكة ضيقة والغطاء لا يميل. القفص جاهز للسكن مع الذباب (انظر الخطوة 5.3).

2. إعداد 1 لتر أقفاص يطير (لتتناسب مع 10 سم لوحات)

  1. الحصول على المواد اللازمة: الحفر الكهربائية، 3 بوصة (76 مم) أداة القطع ( الشكل 1E و Fإيغور 1F)، وجرة بلاستيكية مستقيمة 1 لتر مع غطاء، وشبكة من النايلون، وشفرة حلاقة، وورق صنفرة، ونظارات، وقفازات للعمل.
  2. قطع 3 بوصة (76 ملم) الثقوب في الجزء السفلي وغطاء من جرة بلاستيكية ( الشكل 1G )، مع غطاء ثمل بإحكام على الحاوية أثناء الحفر. وضع أداة القطع في وسط الدائرة عند البدء في جعل ثقب.
    تنبيه: ارتد قفازات حماية العين وقفازات العمل أثناء هذه الخطوة.
  3. قم بتدعيم حواف الثقوب مع شفرة حلاقة ورق الصنفرة.
  4. قطع شبكة النايلون في 18 × 18 سم الساحات.
  5. وضع شبكة على حافة العلوي من جرة وتشديد بواسطة شد الغطاء على ( الشكل 1G ). تأكد من أن شبكة ضيقة والغطاء لا يميل. القفص جاهز للسكن مع الذباب (انظر الخطوة 5.3).

3. إعداد لوحات عصير التفاح (آج)

  1. إضافة 19 جرام أجار و 1 L من 18.2 MΩ · سم المياه في قارورة 2 لتر.أضف شريطا مضغوطا، وتخلط لفترة وجيزة.
  2. الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه، ذوبان الجليد 100٪ عصير التفاح التركيز من الأسهم المجمدة، وإعداد 10 مل من 10٪ (الوزن / حجم) محلول الميثيل 4-هيدروكسي بنزوات في الإيثانول.
  3. بعد التعقيم، بدء خلط أجار على لوحة ضجة، وإضافة 80 مل من 100٪ تركيز عصير التفاح و 10 مل من 10٪ (الوزن / حجم) محلول الميثيل 4-هيدروكسي بنزوات إلى قارورة. السماح لتبرد في درجة حرارة الغرفة مع خلط المستمر.
  4. صب 15 سم أطباق بتري (لمدة 5 أقفاص L) أو 10 سم أطباق بتري (ل 1 أقفاص L) بحيث مستوى أجار في كل طبق حوالي 5 مم. تسمح لترسيخ في درجة حرارة الغرفة، والتفاف في أكياس بلاستيكية. لوحات آج يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين.
    ملاحظة: أطباق بيتري يمكن غسلها وإعادة استخدامها.
  5. إعداد معجون الخميرة الرطب: صب بعض الخميرة الجافة النشطة في وعاء 100 مل مع غطاء من شأنها أن تسمح بسهولة خلط، وإضافة الماء بكميات صغيرة مع التحريك، للحصول على سميكة ولكن مختلطة تمامامعجون. تخزين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.

4. إعداد الكواشف تحلل

  1. إعداد 5X تحلل العازلة: 250 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 25٪ الجلسرين، 1٪ أوكتيلفينوكسي بولي (الإثيلينوكسي) الإيثانول (إيجيبال كا-630)، 7.5 ملي مغكل 2 ، 625 ملي كلوريد الصوديوم، 125 ملي ناف، 5 ملي نا 3 فو 4 .
    1. لجعل 200 مل: حل تماما 1 غرام مسحوق نف و 184 ملغ نا 3 فو 4 مسحوق في 71 مل ماء مع التحريك المستمر. إضافة 50 مل 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 7.5، 2 مل 100٪ إيجبال، 1.5 مل 1 M مغكل 2 ، و 25 مل 5 M كلوريد الصوديوم. ثم إضافة 50 مل الجلسرين (إضافة الماضي) والاستمرار في التحريك لمدة 1 ساعة.
    2. تصفية تعقيم باستخدام وحدات تصفية 250 مل. هذه الخطوة يمكن أن تكون بطيئة، ولكن تصفية الحل هو المهم لإزالة الجسيمات غير قابلة للذوبان. قسامة 10 مل في 50 مل أنابيب وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. إعداد 1 M ديثيوثريتول (دت) حل في الماء. تخزين في -20 درجة مئوية في أليكوتس 1 مل.
  3. الحصول على بروتآس أقراص الكوكتيل المانع، مع حمض إيثيلينديامينتيتراسيتيك (إدتا). تخزين في 4 درجات مئوية.
  4. الحصول على 10 مل المحاقن والمرشحات حقنة: قطر 26 مم، خالي من السطوح خلات السليلوز (سفكا)، 0.45 ميكرون حجم المسام.

5. جمع الأجنة يطير

  1. تضخيم خطوط ذبابة المعدلة وراثيا تحمل البروتين الموسومة من الفائدة في زجاجات (ما يقرب من 100 الذباب لكل زجاجة)، ونقل الزجاجات كل يومين حتى يتم تراكم 25-30 زجاجات لكل خط الطيران. تضخيم المخزون السيطرة (على سبيل المثال خط يو ) بطريقة مماثلة.
  2. لوحات آج الدافئة إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 1-2 ساعة، ويمكن أن يتم بين عشية وضحاها). باستخدام إصبع قفاز، نشر بعض معجون الخميرة الرطب في وسط لوحات آج، لجعل تقريبا. 6 سم دائرة لوحة 15 سم ودائرة 4 سم لوحة 10 سم.
  3. تخدير الذباب مع تدفق ثاني أكسيد الكربون باستخدام الإعداد المرحلة ذبابة الفاكهة القياسية، ونقل إلىأقفاص (حوالي 15 زجاجات ناضجة من الذباب لكل 5 قفص لتر، 5 زجاجات لكل 1 لتر قفص).
    1. تغطية القفص السفلي مع لوحات أعدت آج من الخطوة 5.2، وشريط لوحة آج إلى القفص باستخدام شرائط اثنين من الشريط ( أرقام 1D و 1 H ). ومن المفيد أن تطوى على نصائح الشريط الذي يذهب على لوحة لسهولة تقشير عند تغيير لوحات.
    2. بعد استعادة الذباب من التخدير، والحفاظ على الأقفاص مع لوحات في الجزء السفلي وشبكة على القمة.
      ملاحظة: من المهم الانتظار حتى الذباب استرداد تماما، لأنها سوف تلتزم خلاف ذلك لوحة آج ومعجون الخميرة.
    3. في نهاية التجربة، لإعداد قفص للتنظيف، ووضع القفص في الثلاجة لعدة ساعات. غمر شبكة في الماء لبضع ساعات سيسهل التنظيف.
  4. احتضان الأقفاص مع الذباب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أيام وتغيير لوحات آج مرتين في اليوم. لتغيير لوحات، بدوره قفص رأسا على عقب،قشر الشريط من لوحة ولكن عقد لوحة إلى قفص، والاستفادة من قفص كله بلطف على مقاعد البدلاء، وبسرعة مبادلة لوحة قديمة لأخرى جديدة، في محاولة لعدم السماح للذباب للهروب.
    ملاحظة: الذباب تحتاج إلى التكيف مع قفص وسوف تضع أفضل بدءا من اليوم 3. وسوف تستمر زرع في مستوى الذروة لمدة 4-5 أيام. اثنان 5 لتر أقفاص في أعلى قدرة زرع يمكن أن تنتج ما يصل إلى 1 غرام من الأجنة في جمع بين عشية وضحاها. استخدام 1 L أقفاص لتجارب على نطاق أصغر.
  5. السماح للذباب لوضع الأجنة على لوحات آج جديدة بين عشية وضحاها (حوالي 16 ساعة)، أو لأي طول المطلوب الأخرى من الزمن.
  6. في صباح اليوم التالي، علامة وتزن حاويات شبكة لجمع الجنين، واحد لكل خط الطيران المستخدمة.
  7. إعداد 1X تحلل العازلة، وذلك باستخدام الكواشف من القسم 4 (ملاحظة: جاهزة للاستخدام 1X العازلة تحلل يجب أن يكون مستعدا الحق قبل الاستخراج): إضافة 40 مل من الماء إلى 10 مل من 5X تتركز تحلل العازلة (المخزنة في -80 درجة مئوية) في أنبوب 50 مل.
    1. إضافة 50 ميكرولتر من 1 مدت إلى تركيز النهائي من 1 ملم، مزيج جيدا وفصلها إلى اثنين من 50 مل أنابيب، 25 مل في كل منهما. إلى واحد من الأنابيب، إضافة واحد مثبط الأنزيم البروتيني قرص وتدوير في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. في حين أن قرص هو حل، وجمع و ديكوريونات الأجنة (الخطوات 5،8 حتي 6،6). تحقق للتأكد من أن الجهاز اللوحي قد حل تماما، والحفاظ على المخزن المؤقت على الجليد.
      ملاحظة: أنبوب الثاني من العازلة 1X مع دت يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية، وسوف تتطلب فقط إضافة قرص قبل التجربة المقبلة. 25 مل من العازلة تحلل كافية لمدة تصل إلى 2 عينات، مع الأخذ بعين الاعتبار يغسل لاحق خلال خطوات تنقية البروتين.
  8. وضع علامة على لوحات آج على الأقفاص مع الأنماط الجينية من خطوط الطيران المستخدمة، ومقايضة لوحات جديدة.
    ملاحظة: عجينة الخميرة الزائدة يمكن كشط قبالة لوحة في هذه الخطوة. الأجنة يمكن أن يكون عمر على لوحات في 25 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة للحصول على نافذة المطلوب من الوقت التنموي.
  9. إضافة ما يكفي من المياه رo تغطية كل لوحة آج. طرد بلطف الأجنة من لوحة مع فرشاة الطلاء الناعمة (شقة رئيس تقريبا 10 مم واسعة تعمل بشكل جيد لوحات كبيرة). صب الأجنة في حاوية شبكة وزنها ووزنها سابقا، واستنزاف المياه الزائدة.
    1. إذا لزم الأمر، إجراء الشطف الثاني والفرشاة من لوحة لإزالة جميع الأجنة. الجمع بين الأجنة من لوحة إضافية (ق) لنفس خط الطيران في نفس حاوية شبكة.
  10. لفترة وجيزة وصمة عار شبكة على المناشف الورقية لإزالة المياه الزائدة.

6. الجنين ديكوريوناتيون

  1. نصف ملء طبق بتري 6 سم مع التبييض 50٪ (حل فول / فول في الماء).
    ملاحظة: انظر تعليق مهم حول العلامة التجارية التبييض في جدول المواد والكواشف.
    الحذر: ارتداء القفازات وتجنب الحصول على التبييض على الملابس.
  2. إعداد 2 أطباق بتري أكبر مع الماء.
  3. تزج حاوية شبكة مع الأجنة في 50٪ التبييض لمدة 90 ثانية. اضغط على شبكة بلطف خلال إنكوباتيون بضع مرات لتعليق الأجنة في حل التبييض.
  4. في نهاية الحضانة 90 ثانية، وغسل حاوية شبكة في كل من الأطباق 2 بالماء لمدة 10 ثانية.
  5. شطف حاوية شبكة جيدا مع 18.2 MΩ · سم المياه باستخدام زجاجة بخ. أيضا، وغسل الجانبين وخارج حاوية شبكة.
    ملاحظة: لا ينبغي الكشف عن رائحة التبييض بعد غسل شامل.
  6. وصمة عار شبكة حاوية على المناشف الورقية. تزن حاوية شبكة مع الأجنة وطرح وزن الحاوية الفارغة التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.6. تسجيل الوزن الناتج من الأجنة. كمية جيدة من الأجنة لهدف هو 0.5 - 1 غرام.

7. إعداد الجنين استخراج

  1. إضافة 1 مل من العازلة تحلل مع مثبطات الأنزيم البروتيني (من الخطوة 5.7) إلى الخالط الزجاج دونس والحفاظ على الجليد. نقل الأجنة من حاوية شبكة في الخالط.
    ملاحظة: الأجنة يمكن التقاطها مع نهاية مسطحة سفا ملعقة معدنية أو فرشاة ونقلها مباشرة إلى المخزن المؤقت. تنفيذ جميع الخطوات في هذا القسم على الجليد.
  2. يغسل الأجنة المتبقية على شبكة مع إضافية 1 مل تحلل العازلة وإضافة إلى المواد في الخالط. السماح للأجنة تستقر وصولا الى الجزء السفلي من الخالط، ونضح بعناية طاف.
  3. إضافة العازلة تحلل مع مثبطات الأنزيم البروتيني (من الخطوة 5.7) إلى الخالط، وتهدف ل 5-6 مل من العازلة تحلل لكل غرام من الأجنة.
  4. تجانس الأجنة التي 4-6 السكتات الدماغية مع مدقة فضفاضة المناسب.
    ملاحظة: خلال السكتات الدماغية الأولى، سيكون هناك المزيد من المقاومة. في محاولة لتحريك مدقة في حركة مستمرة لتجنب رش الحل.
  5. تجانس الأجنة التي كتبها 8-10 السكتات الدماغية مع مدقة ضيقة المناسب.
  6. احتضان جناسة على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  7. نقل جناسة في أنابيب ميكروسنتريفوج وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في سرعة قصوى (حوالي 13،000 زغ).
  8. Avoidiنغ الكريات وطبقة الدهون أعلى جدا، ونقل سوبرناتانتس إلى أنابيب ميكروسنتريفوج جديدة وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في سرعة قصوى (حوالي 13،000 زغ).
  9. نضح بعناية سوبرناتانتس مع 1 مل غيض وتحميلها إلى المبردة 10 مل المحاقن مع 0.45 ميكرون مرشحات تعلق (الجمع بين قسامات من نفس العينة في حقنة واحدة). دفع كل من الحل في أنبوب المسمى 15 مل على الجليد. استخراج يمكن استخدامها على الفور لتجارب تنقية البروتين لاحق أو المفاجئة المجمدة في النيتروجين السائل وأبقى في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
    ملاحظة: فمن الأفضل لتجميد مقتطفات بدلا من الأجنة، لأنه خلال ذوبان لاحق من الأجنة البروتياز قد تصبح تنشيط وتؤدي إلى تدهور البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتوضيح استخدام هذا البروتوكول في تجربة تنقية معقدة البروتين، أنشأنا خط متماثل قابلة للحياة ذبابة، الذراع إغف- إرك، معربا عن إغف الموسومة ذبابة الفاكهة خارج الخلية ينظم إشارة كيناز (إرك، المشفرة من قبل الجينات توالت ) تحت السيطرة من المدرع أعرب عنها في كل مكان ( الذراع ) المروج 18 ، 19 . الذراع المروج نشط خلال معظم مراحل ذبابة الفاكهة التطور الجنيني 19 . وقد أعدت الليسيتات باستخدام بروتوكول وصفها، والتعبير عن البروتين من التحوير الذراع إغف - إرك أكده النشاف الغربية لإجمالي البروتين إرك للكشف عن مستويات في وقت واحد و إغف-إرك المعدلة وراثيا، و الهجرة في 42 كيلو دالتون و 69 كيلو دالتون ، على التوالي ( الشكل 2A ). فرقة واحدة المقابلة ل إير الذاتية المنشأ تم الكشف عن K (42 كيلو دالتون) في خط التحكم يو . هذه النتيجة تؤكد نجاح استخراج إرك و إغف-إرك من الأجنة.

لاختبار ما إذا كان لدينا بروتوكول استخراج مناسبة لتنقية لاحقة من البروتين الموسومة، وتعرض مقتطفات من الذباب يو والذراع إغف - إرك لتنقية تقارب باستخدام الخرز غفب-أغاروس بعد البروتوكولات المعمول بها 10 ، 11 . أظهر تلطيخ الفضة من العينات التي تعمل على التدرج سدز-بادج تنقية ناجحة من البروتين الطعم، إغف-إرك ( الشكل 2B ). إلى جانب إغف-إرك نفسها، حارة التجريبية تحتوي على نطاقات إضافية لم يتم ملاحظتها في العينة يو السيطرة، مما يشير إلى أن إجراءات تنقية استرداد البروتينات إرك التفاعل المحتملة.

"سرك =" / فيليز / ftp_upload / 55804 / 55804fig1.jpg "/>
الشكل 1 : إعداد الأقفاص السكانية. ( A - D ) قفص 5-L مصنوع من حاوية بلاستيكية. ( A ) حاوية البداية. ( ب ) عرض أسفل القفص 5 L. ( C ) المنظر العلوي، بسبب، 5، الل، قفص، ب، شبكة، أتاشد. ( D ) تجميعها 5 L قفص مع 15 سم لوحة عصير التفاح، وعرض أسفل. ( E و F) مثقاب 3 بوصة (76 مم) يستخدم لحفر الثقوب في الحاوية 1 لتر. ( G ، H ) A 1 L قفص. ( G ) المنظر العلوي، بسبب، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، 1، l، سلة لكرة السلة، ب، شبكة، أتاشد. ( H ) تجميعها 1 L قفص مع لوحة عصير التفاح 10 سم المرفقة، عرض أسفل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 : استخراج وتنقية إغف-إرك من الأجنة. ( A ) لطخة غربية تظهر التعبير عن إغف-إرك و إرك الذاتية في مستخلص أعدت من خط وراث - إغف - إرك المعدلة وراثيا. تم استخدام خط يو كعنصر تحكم. الأخضر، مجموع إرك الأجسام المضادة. الأحمر، الوزن الجزيئي، علامة. ( ب ) هلام ملون الفضة تظهر تنقيته إغف-إرك والبروتينات المرتبطة بها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول المقدمة هنا هو إجراء بسيط وعمومي لإعداد أقفاص السكان ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط، وجعل مقتطفات البروتين خلية كاملة من الأجنة. ويمكن استخدام مقتطفات الناتجة في مجموعة متنوعة من التطبيقات المصب، مثل تنقية المجمعات البروتين على راتنجات تقارب. فمن الأهمية بمكان لأداء خطوات استخراج على الجليد واستخدام تثبيط البروتيني قوية، للحد من تدهور البروتين. كما هو موضح، والبروتوكول هو مناسبة لعزل معظم سيتوبلازميك وبعض الغشاء والبروتينات النووية القابلة للذوبان 6 ، 10 ، 12 ، 15 . ويمكن تكييفها بسهولة لتنقية أكثر تركيزا من البروتينات من مقصورات أخرى، مثل عزل البروتينات النووية أقل قابلية للذوبان باستخدام استخراج الملح عالية 5 . كما هو مذكور في الخطوة 5.8، يمكن أن تكون أوقات جمع الجنين والشيخوخة فتراتالتي أنشئت في فترات دقيقة للحصول على مراحل تنموية مختلفة.

وغالبا ما يكون من المرغوب فيه للتأكد من أن البروتين الموسومة من الفائدة وأعرب عن مستويات مطابقة عن كثب لمستويات الذاتية التعبير، كما أظهرنا باستخدام الأجسام المضادة إرك لمكافحة الكلي ( الشكل 2A ). إذا كان الجسم المضاد ضد البروتين الداخلي غير متوفر، ويمكن التحقق من وظائف البنيات من قبل المقايسات الأخرى، على سبيل المثال في تجربة الإنقاذ الجيني. في معظم الحالات ومع ذلك، فإن أوفيركسريسيون معتدل من البروتين الموسومة لا يزال يؤدي إلى عزل المجمعات البروتين ذات مغزى، ويمكن في الواقع تسهيل استخراج وتنقية البروتينات "الصعبة".

والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو بساطته وإمكانية لإعداد الإجراء كله بتكلفة معتدلة. ميزة إضافية من استخدام أقفاص أصغر هو أن عدة خطوط المعدلة وراثيا يمكن إعدادها وتحليلها في باراللتر، والتي قد لا تكون مجدية عند استخدام أقفاص أكبر. أقفاص ذبابة وصفنا هنا يمكن تنظيفها بسهولة وإعادة استخدامها لسنوات. بدلا من جعل أقفاص 1 لتر من الجرار نالجين كما هو موضح، فمن الممكن استخدام الحاويات الأخرى المتاحة، مثل نسخة أصغر من حاوية 5 L.

لقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول (أو الاختلافات مع تعديلات صغيرة) لتنقية المجمعات التي تحتوي على مختلف البروتينات إشارة والمكونات المرتبطة بها، تليها التحليل من قبل مطياف الكتلة 6 ، 10 ، 15 . وقد أدت هذه النهج إلى التعرف على مؤشرات أداء المنتج الجديدة التي تم التحقق من صحة أكثر في الدراسات الوظيفية 10 ، 15 . الاختلافات في البروتوكول المقدمة هنا قد استخدمت سابقا لتحليل فوسفوبروتيوم في ذبابة الفاكهة الجنين 20 ، ودراسة المناظر الطبيعيةمن أوبيكيتيناتيون في التنمية العصبية 21 ، 22 . وبالتالي فإن هذا الإجراء يمثل بوابة مريحة لتحليل مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي ، ويمكن استخدامها لتطبيقات البروتينات الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون أعضاء مختبر فيراكسا على تعليقات مفيدة حول المخطوطة واقتراحات لتحسين البروتوكول. تم دعم أف من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM105813 و NS096402. وقد دعم لي من جامعة ماساتشوستس بوسطن سانوفي جنزيمي الدكتوراه زمالة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) Home Depot 209330 For making 5-L cages.
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) Home Depot 209320 Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm Fisher Scientific FB0875714 Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm Fisher Scientific FB0875713A Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.
Sefar NITEX nylon mesh Sefar 03-180/44 180 micron, 44% open area, used for fly cages.
Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor Home Depot 49-56-9670 3 inch cutting tool for making 1-L cages.
Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure Fisher Scientific 11-823-33 For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.
Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch Red Star  can be purchased from Amazon.com or other suppliers.
Frozen 100% Apple Juice Concentrate  can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can.
Methyl 4-hydroxybenzoate Acros Organics AC126965000 also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.
IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml Sigma I8896 used for preparing lysis buffer.
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane  Fisher Scientific 09-740-2A 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.
Corning SFCA syringe filters  Fisher Scientific 09-754-21 SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples.
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles Fisher Scientific 14-823-2A for filtering final extract samples. BD cat # 309604.
Bleach Clorox used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.
Corning Costar Netwell Plates Fisher Scientific 07-200-213 mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well.
Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml Fisher Scientific 06-435B homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
  2. Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
  3. Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
  4. Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
  5. Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
  6. Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
  7. Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
  8. Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
  9. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
  10. Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
  11. Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).
  12. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
  13. Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
  14. Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
  15. Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).
  16. Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
  17. Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
  18. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  19. Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
  20. Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
  21. Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
  22. Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 123، استخراج، المحللة، والبروتين،
إعداد على نطاق متوسط ​​من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مقتطفات الجنين للتجارب بروتيوميك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne,… More

Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne, S., Kyriakakis, P., Veraksa, A. Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55804, doi:10.3791/55804 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter