Summary
이 프로토콜의 목표는 중형 규모 (0.5-1g)에서 초파리 ( Drosophila) 배아를 수집하고 친화도 정화 - 질량 분광 분석 (AP-MS)과 같은 하류의 단백질 응용 분야에서 사용할 수있는 단백질 추출물을 제조하는 간단하고 저렴한 접근법을 제공하는 것입니다 ).
Abstract
단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs)의 분석은 세포 신호, 생물 발달 및 질병과 같은 생물학적 과정과 기전을 연구하는 데 없어서는 안될 접근법이되었습니다. 상호 작용 네트워크에 대해 가장 자연스럽고 편향된 시각을 얻기 위해 생체 내 물질을 사용하여 PPI 정보를 얻는 것이 종종 바람직합니다. 초파리 Drosophila melanogaster 는 생체 내 에서 PPI를 연구 할 수있는 훌륭한 플랫폼이며 생화학 실험을위한 물질 분리에 대한 직접적인 접근법을 제공합니다. 특히, 초파리 배아는이 발달 단계에서 동물을 수집하는 용이함과 대부분의 단백질이 배아 발생에서 발현되므로 대부분의 PPI를 밝힐 수있는 관련 환경을 제공하기 때문에 PPI를 연구하기위한 편리한 유형의 조직을 대표한다. 여기에 중간 규모 (0.5-1 g)의 Drosophila 배아를 수집하기위한 프로토콜을 제시합니다.이 배지는 광범위한 범위의친화도 정제 - 질량 분석법 (AP-MS)에 의한 PPI 분석을 포함한 프로테옴 응용 분야에 사용됩니다. 우리는 모든 실험실에서 쉽고 저렴하게 설치 될 수있는 배아 컬렉션을위한 1L 및 5L 케이지에 대한 설계를 설명합니다. 우리는 AP-MS와 같은 다운 스트림 응용 분야에서 직접 사용할 수있는 lysate를 생성하기위한 배아 채집 및 단백질 추출을위한 일반적인 프로토콜을 제공합니다. 우리의 목표는 모든 연구자들이 생체 내 PPI 분석을 수행 할 수있는 접근 방법을 제공하는 것입니다.
Introduction
유전 적 스크린과 최근에 게놈 접근법은 생물학적 기능에 대한 연구에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 중요한 세포 정보는 단백질 및 상호 작용하는 파트너의 앙상블로 인코딩됩니다. 기존의 유전체 개질제 스크린은 속도 제한 경로 구성 요소를 식별하고 간접적 인 상호 작용을 회복 할 수 있지만 proteomic 접근법의 강점은 관심 단백질의 완전한 즉각적인 상호 작용 네트워크를 확인하는 능력에 있습니다. 따라서, Proteomics는 생물 시스템을 연구하고, 유전체학, 전 사체 공학 및 전통적인 유전자 스크린을 보완하는 귀중한 직각 방법입니다. Affinity purification-mass spectrometry (AP-MS)는 세포와 조직의 고유 환경에서 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs)을 연구하는 강력한 접근법으로 입증되었습니다. 이 방법은 특정 개발 단계에서 직접 또는 간접 상호 작용을 식별 할 수있게합니다여러 단계의 발달 과정에서 다수의 새로운 PPI를 확인하는데 성공적으로 사용되어왔다 (참고 문헌 1 에서 검토 됨). PPI 연구의 확실한 성공에도 불구하고, 대부분이 배양 세포에서 수행되어 관심있는 "미끼"단백질이 과발현되었다. 세포 배양에서 PPI를 연구하는 데는 두 가지 문제가 있습니다. 첫째, 특정 세포주는 특정 단백질의 발현 부족으로 인해 상호 작용을 완전히 제공하지 못할 수 있습니다. 둘째, 이러한 분석에서 일반적으로 사용되는 높은 과발현은 단백질 오 폴딩 또는 위양성 상호 작용의 동정과 같은 인위적인 결과를 초래할 수있다.
이러한 두 가지 한계 는 생체 내 PPI를 분석함으로써 극복 될 수 있습니다. 그러한 실험에서의 제한 단계는 단백질 복합체를 정제하기위한 출발 물질의 이용 가능성이다. Drosophila melanogaster 는 오랫동안 기능 분석을위한 모델로 사용되어 왔습니다또한 최근에는 생체 내에서 PPI를 연구하기위한 우수한 시스템으로 나타났습니다. Drosophila embryogenesis는 배아가 대량으로 쉽게 채취 될 수 있고 또한 대부분의 유전자 (> 88 %)가 배아 발생 과정에서 발현되므로 관련 성을 감지하기위한 풍부한 생체 내 환경을 제공하기 때문에 PPI를 연구하기에 특히 매력적인 조직 유형을 나타낸다 PPIs 3 .
전통적으로 파리에서의 생화학 적 연구는 기능적 전사 물을 정제하는 데 필요한 것과 같이 매우 큰 규모의 배아 컬렉션 (100-150 g)을 이용했다. Drosophila의 이전 AP-MS 연구는 각 단계에서 물질의 관련 손실과 함께 tandem affinity purification (TAP)과 같은 2 단계 정제 방법에 의존했기 때문에 5-10 g의 많은 배아가 필요했습니다. 대 형제시작 물질의 ts은 많은 인구 케이지에 배아 컬렉션을 설치하는 것을 필요로했는데, 이는 상업적으로 구매할 때 비싸고 유지 보수 및 청소에 많은 시간이 소요될 수있다.
질량 분석기의 감도 증가뿐만 아니라 단일 단계 친 화성 정제 접근법의 발전에 대한 최근의 진보는 출발 물질의 필요한 양을 한 단계 줄였습니다. streptavidin 결합 펩타이드 (SBP) 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 태그를 사용하여 1g 미만의 배아에서 시작하여 미끼 단백질과 상호 작용하는 성분의 양을 분리하여 식별 할 수 있습니다. 질량 분석 10 , 11 .
여기에 제시된 의정서의 목표는 연구자들이나는 생체 내 에서 PPI의 생화학 적 분석에 대한 장벽이되었다. 이를 위해 중간 규모 (0.5 ~ 1g)의 초파리 배아를 수집하기위한 간단하고 저렴한 절차를 제공하고, AP-MS 또는 기타 접근법에 의한 후속 분석에 적합한 전체 세포 단백질 추출물을 한 단계 준비합니다 . 우리의 방법은 모든 실험실에서 쉽게 생산할 수있는 맞춤형 1L 또는 5L 인구 케이지의 사용에 의존합니다. 또한, 여기에 제시된 추출 조건은 배양 된 세포와 생체 내 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 두 가지 연구에서 검증되었습니다.
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Protocol
1. 5 L 플라이 케이지의 준비 (15 cm 플레이트에 맞추기)
- 필요한 재료를 얻으십시오 : 뚜껑이있는 5 쿼트 (4.7 리터) 용기 ( 그림 1A ), 나일론 메쉬 및 면도날.
- 면도날 ( 그림 1B )을 사용하여 직경 12cm의 원을 표시하고 컨테이너 바닥에 구멍을 뚫습니다. 뚜껑에 직경 15cm의 구멍을 잘라냅니다 ( 그림 1C ).
- 25 x 25 cm 사각형으로 나일론 메쉬를 자릅니다.
- 메쉬를 용기의 상단 가장자리 위에 놓고 뚜껑을 아래로 누릅니다 ( 그림 1C ). 메시가 단단하고 뚜껑이 기울어 있지 않은지 확인하십시오. 케이지에 파리가 채워질 준비가되었습니다 (5.3 단계 참조).
2. 1 L 플라이 케이지의 준비 (10 cm 플레이트에 맞추기)
- 필요한 재료를 얻으십시오 : 전기 드릴, 76mm (3 인치) 절삭 공구 ( 그림 1E 및 Figure 1F), 뚜껑, 나일론 메쉬, 면도날, 사포, 고글 및 작업용 장갑이있는 직선형 1L 플라스틱 용기.
- 드릴링 중에 뚜껑을 단단히 조일 때 플라스틱 뚜껑 ( 그림 1G )의 바닥과 뚜껑에 3 인치 (76mm)의 구멍을 잘라냅니다 ( 그림 1G ). 구멍을 만들기 시작할 때 절삭 공구를 원의 중심에 놓습니다.
주의 :이 단계에서 눈 보호 장치를 착용하고 장갑을 착용하십시오. - 면도날과 사포로 구멍의 가장자리를 부드럽게합니다.
- 나일론 메쉬를 18x18cm 사각형으로 자른다.
- 항아리의 상단 가장자리 위에 메쉬를 놓고 뚜껑을 조여서 조입니다 ( 그림 1G ). 메시가 단단하고 뚜껑이 기울어 있지 않은지 확인하십시오. 케이지에 파리가 채워질 준비가되었습니다 (5.3 단계 참조).
3. 사과 주스 (AJ) 후판 준비
- 2L 플라스크에 한천 19g과 18.2MΩ · cm 물 1L를 넣는다.교반 막대를 넣고 잠깐 섞는다.
- 30 분 동안 오토 클레이브한다. 한편, 냉동 재고에서 100 % 사과 주스 농축 물을 녹이고 10 % (중량 / 부피) 메틸 4- 하이드 록시 벤조 에이트 용액 10 mL를 에탄올에 용해시킵니다.
- 고압 증기 멸균 한 후 교반 판에 한천을 넣고 100 % 사과 쥬스 농축 물 80 mL와 10 % (중량 / 부피) 메틸 4- 하이드 록시 벤조 에이트 용액 10 mL를 플라스크에 넣는다. 일정한 혼합으로 상온에서 시원하게하십시오.
- 각 접시의 한천 수준이 약 5mm 두께가되도록 15cm 페트리 접시 (5L 우리에 대한) 또는 10cm 페트리 접시 (1L 우리에 대한)를 부어. 실온에서 응고시키고 플라스틱 백으로 포장하십시오. AJ 플레이트는 4 ° C에서 2 주 동안 보관할 수 있습니다.
참고 : 배양 접시는 씻고 다시 사용할 수 있습니다. - 젖은 효모 페이스트를 준비하십시오 : 쉽게 혼합 할 수있는 뚜껑이 달린 100 mL 용기에 활성 건조 효모를 약간 부어 넣고 교반하면서 소량의 물을 가하여 두껍고 완전히 혼합하십시오풀. 4 ° C에서 2 주 동안 보관하십시오.
4. 용해 시약의 준비
- 5x 용해 버퍼를 준비 : 250mM 트리스 산도 7.5, 25 % 글리세롤, 1 % octylphenoxy 폴리 (에틸렌 옥시) 에탄올 (IGEPAL CA-630), 7.5 MM MgCl 2 , 625 MM NaCl, 125 MM NaF, 5 MM Na 3 VO 4 .
- 200 mL를 만들려면 : 지속적으로 교반하면서 71 mL 물에 1 g NaF 파우더와 184 mg Na 3 VO 4 파우더를 완전히 녹입니다. 1M Tris pH 7.5의 50 mL, 100 % IGEPAL 2 mL, 1M MgCl2 1.5 mL 및 5 M NaCl 25 mL를 첨가한다. 그런 다음 글리세롤 50 mL를 넣고 (마지막에 첨가) 1 시간 동안 계속 저어 준다.
- 250 mL 필터 장치를 사용하여 필터 멸균하십시오. 이 단계는 느려질 수 있지만 용액을 여과하는 것은 불용성 미립자를 제거하는 것이 중요합니다. 50 mL 튜브에 10 mL 씩 분주하고 -80 ° C에서 보관하십시오.
- 물에 1M DTT (dithiothreitol) 용액을 준비한다. -20 ℃에서 1 mL 분량으로 보관하십시오.
- 단백질을 얻는다.에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)과 함께 ase 억제제 칵테일 정제. 4 ° C에서 보관하십시오.
- 10 mL 주사기 및 주사기 필터를 얻습니다 : 26 mm 직경, 계면 활성제가없는 셀룰로오스 아세테이트 (SFCA) 멤브레인, 0.45 μm 공극 크기.
5. 파리 태아 수집
- 파리에있는 태그가있는 단백질을 운반하는 트랜스 제닉 플라이 라인 (병당 약 100 파리)을 증폭시키고 각 플라이 라인마다 25-30 병이 축적 될 때까지 2 일마다 병을 옮깁니다. 유사한 방법으로 제어 재고 ( 예 : yw 라인)를 증폭하십시오.
- 온난 한 AJ 플레이트를 상온으로 (약 1-2 시간, 밤새도록 할 수 있음). 장갑을 낀 손가락을 사용하여 AJ 플레이트의 중앙에 약간의 젖은 효모 페이스트를 펼쳐서 약을 만듭니다. 15cm 플레이트의 경우 6cm 원, 10cm 플레이트의 경우 4cm 원입니다.
- 표준 Drosophila 단계 설정을 사용하여 이산화탄소의 흐름으로 파리를 마취하고케이지 (약 5L 케이지 당 약 15 마리의 잘 자란 병, 1L 케이지 당 5 병).
- 케이지 바닥을 단계 5.2에서 준비된 AJ 플레이트로 덮고 두 개의 테이프 스트립을 사용하여 케이지에 테이프로 붙입니다 ( 그림 1D 및 1H ). 판을 교체 할 때 쉽게 벗겨 지도록 판 위에있는 테이프의 끝을 접을 때 유용합니다.
- 파리가 마취에서 회복 된 후, 바닥에 접시와 케이지를 유지하고 맨 위에 메쉬.
참고 : 파리가 완전히 회복 될 때까지 기다리는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 AJ 플레이트와 효모 페이스트에 달라 붙을 것입니다. - 실험이 끝나면 새장을 준비하기 위해 새장을 냉동실에 몇 시간 동안 두십시오. 메쉬를 물에 몇 시간 동안 담그면 청소가 용이 해집니다.
- 새장을 파리와 함께 상온에서 2-3 일간 배양하고 하루에 두 번 AJ 플레이트를 교체하십시오. 번호판을 바꾸려면 새장을 거꾸로 뒤집고,접시에서 테이프를 떼어 내고 접시를 케이지에 붙이고 벤치에서 부드럽게 전체 케이지를 가볍게 두 드리며 파리를 빠져 나오지 않으려 고 새 접시를 빨리 교환하십시오.
참고 : 파리는 새장에 맞게 조정해야하며 3 일에 가장 잘 눕습니다. 약 4-5 일 동안 최고 수준으로 계속 누워 있습니다. 최고 산란 능력의 2 개 5 개 케이지는 야간 수집에서 1 g의 배아를 생산할 수 있습니다. 소규모 실험에는 1 개의 케이지를 사용하십시오. - 새 파리가 밤새 (약 16 시간) 또는 원하는 다른 시간 동안 배아를 낳도록하십시오.
- 다음날 아침, 배아 채취를위한 메쉬 용기를 표시하고 계량하십시오 (사용 된 각 플라이 라인 당 하나씩).
- 섹션 4의 시약을 사용하여 1x lysis buffer를 준비한다. (주의 : 즉시 사용할 수있는 1x lysis buffer는 추출 직전에 준비해야한다.) 5x 농축 lysis buffer (-80oC에서 저장 됨) 10mL에 물 40mL를 넣는다. 50 mL 튜브에 넣었다.
- 1 MD 50 μL 추가TT로 1 mM의 최종 농도로 만들고, 잘 섞어서 두 개의 50 mL 튜브, 각각 25 mL로 분리한다. 튜브 중 하나에 하나의 프로 테아 제 억제제 타블렛을 넣고 30 분 동안 4 ° C에서 회전하십시오. 타블렛이 용해되는 동안 태아를 모으고 dechorionate (5.8-6.6 단계). 정제가 완전히 용해되었는지 확인하고 완충액을 얼음에 보관하십시오.
참고 : DTT가있는 1x 버퍼의 두 번째 튜브는 -80 ° C에서 보관할 수 있으며 다음 실험 전에 태블릿을 추가하기 만하면됩니다. 25 mL의 용해 완충액으로 단백질 정제 단계에서의 세척을 고려하여 2 개 시료까지 충분합니다.
- 1 MD 50 μL 추가TT로 1 mM의 최종 농도로 만들고, 잘 섞어서 두 개의 50 mL 튜브, 각각 25 mL로 분리한다. 튜브 중 하나에 하나의 프로 테아 제 억제제 타블렛을 넣고 30 분 동안 4 ° C에서 회전하십시오. 타블렛이 용해되는 동안 태아를 모으고 dechorionate (5.8-6.6 단계). 정제가 완전히 용해되었는지 확인하고 완충액을 얼음에 보관하십시오.
- 사용 된 플라이 라인의 유전자형으로 새장에 AJ 플레이트를 표시하고 신선한 플레이트로 교환하십시오.
참고 :이 단계에서 여분의 효모 페이스트를 플레이트에서 긁어 낼 수 있습니다. 태아는 25 ° C 또는 상온에서 원하는 발육 시간 창을 얻기 위해 플레이트에서 노화 될 수 있습니다. - 충분한 물을 넣으십시오.각 AJ 플레이트를 덮으십시오. 부드럽게 페인트 브러시 (약 10mm 너비의 플랫 헤드가 대형 플레이트에서 잘 작동 함)로 플레이트에서 태아를 부드럽게 제거합니다. 배아를 이전에 무게를 측정하고 표시된 메시 용기에 부어 과량의 물을 배출하십시오.
- 필요한 경우 모든 배아를 제거하기 위해 두 번째 헹굼과 닦기를 수행하십시오. 동일한 플라이 라인에 대한 추가 플레이트의 배아를 동일한 메쉬 컨테이너에 결합하십시오.
- 종이 수건에 메쉬를 간단히 묻혀 과도한 물을 제거하십시오.
6. 태아 Dechorionation
- 50 % 표백제 (물에 vol / vol 솔루션)와 6cm 페트리 접시를 절반 채워.
참고 : Table of Materials 및 Reagents에서 표백제 브랜드에 대한 중요한 설명을보십시오.
주의 사항 : 장갑을 끼고 옷에 표백제가 묻지 않도록주의하십시오. - 물로 2 큰 페트리 접시를 준비합니다.
- 90 % 50 % 표백제로 배아와 함께 메쉬 컨테이너를 담그십시오. incu 도중 메쉬를 가볍게 두 드리십시오.표백제 용액에 배아를 정지시키기 위해 두 번에 걸쳐 번식하십시오.
- 90 초 배양이 끝나면 2 가지 접시의 메쉬 컨테이너를 약 10 초 동안 물로 씻어냅니다.
- 물병을 사용하여 메쉬 컨테이너를 18.2 MΩ · cm의 물로 완전히 헹굽니다. 또한, 메쉬 컨테이너의 측면과 외부를 씻으십시오.
참고 : 철저히 씻은 후에는 표백제 냄새가 없어야합니다. - 메쉬 컨테이너를 종이 타월로 닦으십시오. 배아와 함께 메쉬 컨테이너의 무게를 측정하고 5.6에서 얻은 빈 용기의 무게를 뺍니다. 배아의 결과 무게를 기록하십시오. 목표로하는 배아의 양은 0.5 ~ 1 g입니다.
7. 배아 추출물의 제조
- 프로 테아 제 억제제 (단계 5.7의 것)가 포함 된 용해 완충액 1 mL를 dounce 유리 호 모지 나이저에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 배아를 메쉬 컨테이너에서 호모 제 나이저로 옮긴다.
참고 : 배아는 편평한 끝으로 집어 올릴 수 있습니다.fa metal spatula 또는 brush로 옮기고 완충액에 직접 옮긴다. 이 섹션의 모든 단계를 얼음 위에서 수행하십시오. - 추가 1 ML의 용해 버퍼와 메쉬에 남아있는 배아를 씻어하고 호모 제 나이저에있는 자료에 추가합니다. 배아가 균질 기의 바닥에 내려 앉게하고 조심스럽게 상층을 흡인하십시오.
- 배아의 그램 당 용해 버퍼 5-6 ML을 목표로 호모 제 나이저에 프로 테아 제 억제제 (단계 5.7에서)와 용해 버퍼를 추가합니다.
- 느슨한 피팅 유봉과 4-6 스트로크로 배아를 homogenize.
참고 : 첫 번째 스트로크 중에 더 많은 저항이 있습니다. 유분이 튀지 않도록 연속 동작으로 유모를 움직여보십시오. - 꽉 끼는 유봉으로 8-10 스트로크로 배아를 균질하십시오.
- 얼음에서 호모 제 네이트를 20 분 동안 품어 낸다.
- 최대 속도 (약 13,000 xg)에서 15 분 동안 4 ℃에서 마이크로 원심 분리 관 및 원심 분리기로 균질 액을 옮긴다.
- 피하는알약과 맨 위에있는 지질 층을 옮기고 상층 액을 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮겨 4 ℃에서 15 분간 최고 속도 (약 13,000 xg)로 원심 분리하십시오.
- 1 mL 팁으로 조심스럽게 상층 액을 흡인하고 0.45 μm 필터가 부착 된 냉장 10 mL 주사기에 넣으십시오 (하나의 주사기에 같은 시료의 분취 량을 합치십시오). 모든 용액을 얼음에 표시된 15 mL 튜브에 넣으십시오. 추출물은 후속 단백질 정제 실험을 위해 즉시 사용되거나 액체 질소에서 급속 동결되며 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.
주 : 이후 배아 해동 중에 프로테아제가 활성화되어 단백질 분해를 일으킬 수 있기 때문에 배아보다 추출물을 동결하는 것이 좋습니다.
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Representative Results
단백질 복합체 정제 실험에서이 프로토콜의 사용을 설명하기 위해, 우리는 동형 접합 된 생존 가능한 파리 라인, 팔 -EGFP -ERK를 생성 하고, 조절 하에 EGFP- 표지 된 초파리 신호 조절 키나아제 (말단 유전자에 의해 코딩되는 ERK)를 발현시켰다 유비쿼터스로 표현 된 armadillo ( 팔 ) 프로모터 18 , 19 . 팔 프로모터는 Drosophila embryogenesis의 대부분 단계에서 활성화 됩니다 19 . Lysate는 설명 된 프로토콜을 사용하여 준비되었으며 팔 -EGFP -ERK 도입 유전자의 단백질 발현은 전체 ERK 단백질에 대한 웨스턴 블 랏팅으로 확인되어 내인성 및 형질 전환 EGFP-ERK의 수준을 동시에 검출하여 42 kDa 및 69 kDa로 이동했다 , 각각 ( 그림 2A ). 태그없는 내인성 ER에 해당하는 단일 밴드 K (42 kDa)가 yw 제어 선에서 검출되었다. 이 결과는 배아에서 ERK와 EGFP-ERK의 성공적인 추출을 확인합니다.
우리의 추출 프로토콜이 태그 단백질의 후속 정제에 적합 여부를 테스트하기 위해, yw 와 팔 EGFP - ERK 파리의 추출물은 설립 프로토콜 10 , 11 다음 GFP - 아가로 오스 비즈를 사용하여 친화력 정화에 적용되었습니다. 그라디언트 SDS-PAGE에서 수행 된 시료의은 염색은 미끼 단백질 인 EGFP-ERK ( 그림 2B )의 성공적인 정제를 보여주었습니다. 실험 레인은 EGFP-ERK 자체 이외에도 control yw 샘플에서 관찰되지 않은 추가적인 밴드를 포함하고있어 정제 절차가 잠재적 인 ERK 상호 작용 단백질을 회수 함을 시사한다.
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그림 1 : 개체 케이지의 준비. ( A - D ) 플라스틱 용기로 만든 5L 케이지. ( A ) 출발 컨테이너. ( B ) 5 개 케이지 바닥면. ( C ) 메쉬가 부착 된 5 개 케이지의 윗면. ( D ) 15cm 사과 주스 플레이트가있는 5L 케이지 조립, 밑면. ( E 및 F) 1 L 컨테이너의 드릴링 구멍에 사용되는 76 mm (3 인치) 드릴 비트. ( G , H ) 1 개 케이지. ( G ) 메쉬가 부착 된 1 L 케이지의 윗면. ( H ) 10cm 사과 주스 판이 부착 된 1 개의 케이지가 조립 된 밑면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 중간 규모의 Drosophila 인구 케이지를 설정하고 배아에서 전체 세포 단백질 추출물을 만들기위한 간단하고 일반적인 절차입니다. 생성 된 추출물은 친 화성 수지상의 단백질 복합체의 정제와 같은 다양한 다운 스트림 적용에 사용될 수있다. 얼음에서 추출 단계를 수행하고 단백질 분해를 최소화하기 위해 강력한 프로 테아 제 억제제를 사용하는 것이 중요합니다. 설명한 바와 같이, 프로토콜은 대부분의 세포질 및 일부 막 및 가용성 핵 단백질 6 , 10 , 12 , 15의 분리에 적합합니다. 그것은 높은 소금 추출 5 를 사용하여 덜 용해 핵 단백질의 분리와 같은 다른 구획에서 단백질의보다 집중 정제를 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 단계 5.8에서 언급했듯이, 수집 시간과 배아 노화 기간은서로 다른 발달 단계를 얻기 위해 정확한 간격으로 설정하십시오.
우리가 항 - 총 ERK 항체 ( 그림 2A )를 사용하여 보여준 바와 같이, 관심있는 표식 단백질이 내인성 발현 수준과 밀접한 수준으로 발현되는 것이 확인되는 것이 종종있다. 내인성 단백질에 대한 항체가 이용 가능하지 않은 경우, 구조의 기능성은 다른 분석법, 예 를 들어 유전 구조 실험에 의해 입증 될 수있다. 그러나 대부분의 경우, tagged protein의 가벼운 과발현은 여전히 의미있는 단백질 복합체의 분리를 가져와야하고 실제로 "어려운"단백질의 추출 및 정제를 촉진 할 수 있습니다.
이 프로토콜의 가장 큰 장점은 단순성과 적당한 비용으로 전체 절차를 설정할 수 있다는 것입니다. 더 작은 케이지를 사용하는 또 다른 장점은 다중 형질 전환 계통을 병렬로 설치하고 분석 할 수 있다는 것입니다l, 더 큰 케이지를 사용할 때 가능하지 않을 수도 있습니다. 여기에 설명 된 새장은 수년간 쉽게 청소하고 재사용 할 수 있습니다. 설명 된대로 Nalgene 병에서 1L 케이지를 만드는 대신 5L 컨테이너의 더 작은 버전과 같은 다른 사용 가능한 컨테이너를 사용할 수 있습니다.
우리는 다양한 시그널링 단백질과 관련 성분을 포함하는 복합체를 정제하고 질량 분석기 (Mass Spectrometry) 6 , 10 , 15 로 분석 한 다음이 프로토콜 (또는 작은 변형으로 변형 된 것)을 성공적으로 사용했습니다. 이러한 접근법은 기능적 연구에서 더 검증 된 새로운 PPI의 확인을 유도했다 10,15. 여기에 제시된 프로토콜의 변형은 이전에 Drosophila embryogenesis 20 에서 phosphoproteome 을 분석하고 풍경을 연구하기 위해 사용되었습니다신경 발달에서 ubiquitination의 21 , 22 . 따라서이 절차는 생체 내 에서 PPI를 분석하기위한 편리한 출입구를 나타내며 다른 프로테오믹스 응용 분야에도 유용합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 원고에 대한 도움이되는 의견과 프로토콜 개선을위한 제안에 대해 Veraksa 연구소 구성원에게 감사드립니다. AV는 NIH 보조금 GM105813 및 NS096402에 의해 지원되었습니다. LY는 University of Massachusetts Boston Sanofi Genzyme 박사 과정 동우회 (Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship)에서 후원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
References
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
