Summary
Målet med detta protokoll är att tillhandahålla ett enkelt och billigt tillvägagångssätt för att samla Drosophila embryon i medium skala (0,5-1 g) och förbereda proteinextrakt som kan användas i nedströms proteomiska applikationer, såsom affinitetsrenings-masspektrometri (AP-MS ).
Abstract
Analys av protein-protein-interaktioner (PPI) har blivit ett oumbärligt tillvägagångssätt för att studera biologiska processer och mekanismer, såsom cellsignalisering, organismutveckling och sjukdom. Det är ofta önskvärt att erhålla PPI-information med in vivo- material, för att få den mest naturliga och opartiska syn på interaktionsnätverk. Fruktflugan Drosophila melanogaster är en utmärkt plattform för att studera PPIs in vivo och lutar sig till enkla metoder för isolering av material för biokemiska experiment. I synnerhet fruktfruktembryon representerar en lämplig typ av vävnad för att studera PPI, på grund av att det är enkelt att samla djur i detta utvecklingsstadium och det faktum att majoriteten av proteiner uttrycks i embryogenes, vilket ger en relevant miljö för att avslöja de flesta PPI. Här presenterar vi ett protokoll för insamling av Drosophila- embryon i medelstorlek (0,5-1 g), vilket är en idealisk mängd för ett brett spektrum avProteomiska applikationer, inklusive analys av PPI med affinitetsrenings-masspektrometri (AP-MS). Vi beskriver våra mönster för 1 liter och 5 liter burar för embryonsamlingar som enkelt och billigt kan ställas in i ett laboratorium. Vi tillhandahåller också ett generellt protokoll för embryoinsamling och proteinutvinning för att generera lysater som kan användas direkt i applikationer i senare led, såsom AP-MS. Vårt mål är att tillhandahålla ett tillgängligt medel för alla forskare att genomföra analyserna av PPI in vivo .
Introduction
Genetiska skärmar och, mer nyligen, genomiska tillvägagångssätt har revolutionerat studien av biologiska funktioner. Emellertid kodas viktig cellinformation i proteiner och deras ensemble av interaktiva partner. Medan traditionella genetiska modifieringsskärmar kan identifiera hastighetsbegränsande bankkomponenter och återhämta indirekta interaktioner ligger styrkan hos de proteomiska tillvägagångssätten i deras förmåga att identifiera kompletta interaktiva nätverk av proteiner av intresse. Proteomik är således en värdefull ortogonal metod för att studera biologiska system, och kompletterar genomik, transkriptomik och traditionella genetiska skärmar. Affinitetsrenings-masspektrometri (AP-MS) har visat sig vara ett kraftfullt sätt att studera protein-protein-interaktioner (PPI) i sin naturliga miljö i celler och vävnader 1 , 2 . Denna metod möjliggör identifiering av direkta eller indirekta interaktioner vid specifik utvecklingAlsteg eller vävnadskontext, och har framgångsrikt använts för att identifiera flera nya PPI i en rad utvecklingsvägar (granskad i referens 1 ). Trots PPI-studiernas obestridda framgång har de flesta utförts i odlade celler, där "betet" -proteiner av intresse var överuttryckta. Det finns två problem med att studera PPI: er i cellodling: För det första kan en specifik celllinje inte ge ett komplett komplement av interaktioner på grund av brist på uttryck av vissa proteiner. För det andra kan hög överuttryck som vanligen används vid sådana analyser leda till artefakter som proteinfyllnad eller identifiering av falska positiva interaktioner.
Båda dessa begränsningar kan övervinnas genom att analysera PPI i vivo . Ett begränsningssteg i sådana experiment är tillgängligheten av utgångsmaterialet för rening av proteinkomplex. Drosophila melanogaster har länge använts som en modell för funktionell analysSis, och nyligen har det också visat sig vara ett utmärkt system för att studera PPI i vivo . Drosophila embryogenes representerar en särskilt attraktiv vävnadstyp för att studera PPI, eftersom embryon enkelt kan samlas in i stora mängder, och också eftersom de flesta gener (> 88%) uttrycks under embryogenesen och ger en rik in vivo- miljö för detektering av relevanta PPI 3 .
Traditionellt utnyttjade biokemiska studier i flugor mycket stora embryonsamlingar (100-150 g), såsom de som är nödvändiga för att rena funktionella transkriptionslysat 4 , 5 . Tidigare AP-MS-studier i Drosophila behövde också stora mängder embryon (5-10 g), eftersom de förlitade sig på ett tvåstegsreningsförfarande, såsom tandemaffinitetsrening (TAP), med tillhörande förlust av material vid varje steg 6 . Stora amounTs utgångsmaterial nödvändiggjorde upprättande av embryonsamlingar i stora befolkningsburar, som kan vara både dyra (när de köps kommersiellt) och tidskrävande för att upprätthålla och rengöra 7 , 8 , 9 .
Nya framsteg i utvecklingen av enkelstegsaffinitetsreningsmetoder, liksom den ökande känsligheten hos masspektrometrar har reducerat den nödvändiga mängden utgångsmaterial med en storleksordning. Med hjälp av taggar såsom streptavidinbindande peptid (SBP) eller grönt fluorescerande protein (GFP) och från mindre än 1 g embryon är det möjligt att isolera mängderna av beteproteinet och interaktiva komponenter som skulle vara tillräckliga för identifiering av Masspektrometri 10 , 11 .
Målet med protokollet som presenteras här är att hjälpa forskarna övercoMig ett uppfattat hinder för biokemisk analys av PPI i vivo . För detta ändamål tillhandahåller vi ett enkelt och billigt förfarande för att samla Drosophila- embryon i medelstorlek (0,5-1 g), följt av enstegsberedning av helcellsproteinekstrakter som är lämpliga för efterföljande analys av AP-MS eller andra metoder . Vår metod är beroende av användningen av skräddarsydda 1-L eller 5-L-burar som enkelt kan produceras av något laboratorium. Vidare har de extraktionsbetingelser som presenteras här validerats i flera studier, både i odlade celler och in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av 5 L Fly Cages (för att passa 15 cm Plates)
- Hämta de material som behövs: 5-kvart (4,7-L) behållare med lock ( Figur 1A ), nylonnät och ett rakblad.
- Markera en cirkel med 12 cm diameter och skär ett hål i botten av behållaren med rakbladet ( Figur 1B ). Skär ett hål på 15 cm i locket ( Figur 1C ).
- Klipp nylonnät i 25 x 25 cm rutor.
- Placera nätet över behållarens övre kant och tryck ned med locket ( Figur 1C ). Se till att nätet är tätt och locket är inte lutat. Buret är klart att befolkade med flugor (se steg 5.3).
2. Förberedelse av 1 L Fly Cages (för att passa 10 cm Plates)
- Hämta det material som behövs: en elektrisk borr, ett 3 tum (76 mm) skärverktyg ( Figur 1E och FIgure 1F), en raksidig 1 L plastburk med lock, nylonnät, ett rakblad, sandpapper, skyddsglasögon och arbetshandskar.
- Klipp 3 tum (76 mm) hål i botten och locket på plastburken ( Figur 1G ), med locket hårt skruvas på behållaren under borrningen. Placera skärverktyget i mitten av cirkeln när du börjar göra ett hål.
Varning: Använd ögonskydd och arbetshandskar under detta steg. - Leda kanterna på hålen med ett rakblad och sandpapper.
- Skär nylonnät i 18 x 18 cm rutor.
- Placera nätet över burkets övre kant och dra åt det genom att skruva på locket ( Figur 1G ). Se till att nätet är tätt och locket är inte lutat. Buret är klart att befolkade med flugor (se steg 5.3).
3. Framställning av äppeljuice (AJ) tallrikar
- Tillsätt 19 g agar och 1 liter 18,2 MΩ · cm vatten i en 2 liter kolv.Tillsätt en omrörningsbar och blanda kort.
- Autoklav i 30 min. Tina 100% äppeljuicekoncentrat från fryst lager och förbered 10 ml 10% (vikt / volym) metyl 4-hydroxibensoatlösning i etanol.
- Efter autoklavering börjar du blanda agaret på en omröringsplatta och tillsätt 80 ml 100% äppeljuice-koncentrat och 10 ml 10% (vikt / volym) metyl 4-hydroxibensoatlösning till kolven. Låt svalna vid rumstemperatur med konstant blandning.
- Häll 15 cm petriskålar (för 5 liter burar) eller 10 cm petriskålar (för 1 liter burar) så att agarhalten i varje maträtt är ca 5 mm tjock. Låt stelna vid rumstemperatur och linda i plastpåse. AJ-plattorna kan förvaras vid 4 ° C i två veckor.
Obs! Petriskålar kan tvättas och återanvändas. - Förbered våt jästpasta: Häll lite aktiv torrjäst i en 100 ml behållare med ett lock som möjliggör enkel blandning och tillsätt vatten i små mängder under omröring för att erhålla en tjock men grundligt blandadklistra. Förvara vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
4. Framställning av lysisreagenser
- Bered 5x lysisbuffert: 250 mM Tris pH 7,5, 25% glycerol, 1% oktylfenoxipoly (etylenoxi) etanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl2, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na3VO4.
- För att göra 200 ml: lösa upp 1 g NaF-pulver och 184 mg Na 3 VO 4- pulver i 71 ml vatten fullständigt med konstant omrörning. Tillsätt 50 ml 1 M Tris pH 7,5, 2 ml 100% IGEPAL, 1,5 ml 1 M MgCl2 och 25 ml 5 M NaCl. Tillsätt sedan 50 ml glycerol (tillsätt sist) och fortsätt omröring i 1 timme.
- Filtrera-sterilisera med 250 ml filterenheter. Detta steg kan vara långsamt, men filtrering av lösningen är viktigt för att avlägsna olösliga partiklar. Aliquot med 10 ml i 50 ml rör och förvara vid -80 ° C.
- Förbered 1 M ditiotreitol (DTT) lösning i vatten. Förvaras vid -20 ° C i 1 ml alikvoter.
- Hämta proteAseinhibitor cocktail tabletter, med etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Förvara vid 4 ° C.
- Skaffa 10 ml sprutor och sprutfilter: 26 mm diameter, surfaktantfritt cellulosaacetat (SFCA) membran, 0,45 μm porstorlek.
5. Insamling av flygembryon
- Förstärka de transgena flyglinjerna som bär det märkta proteinet av intresse i flaskor (cirka 100 flugor per flaska) och överför flaskorna varannan dag till 25-30 flaskor ackumuleras för varje flyglinje. Förstärka styrlager ( t.ex. yw- linjen) på ett liknande sätt.
- Varm AJ-plattor till rumstemperatur (ca 1-2 h, kan göras över natten). Använd ett handskent finger, sprid lite våt jästpasta i AJ-plattans centrum, för att göra ca. 6 cm cirkel för en 15 cm tallrik och en 4 cm cirkel för en 10 cm tallrik.
- Bedöda flugorna med ett koldioxidflöde med hjälp av en standard Drosophila-scenuppsättning och överföra tillBurarna (ca 15 välvuxna flaskflaskor per 5 liter bur, 5 flaskor per 1 liter bur).
- Täck korgens botten med beredda AJ-plattor från steg 5.2 och tejpa AJ-plattan i buret med två bandremsor ( figurerna 1D och 1H ). Det är användbart att vikla över spetsarna på tejpen som går över plattan för att enkelt skala vid byte av plattor.
- När flugorna återhämtar sig från anestesi, behåll burarna med plattorna i botten och maska på toppen.
Obs! Det är viktigt att vänta tills flugorna helt återställs, eftersom de annars kommer att hålla fast vid AJ-plattan och jästpasta. - I slutet av försöket, förbereda buret för rengöring, placera buret i frysen i flera timmar. Att suga nätet i vatten i några timmar kommer att underlätta rengöringen.
- Inkubera burar med flugor vid rumstemperatur i 2-3 dagar och byt AJ-plattor två gånger om dagen. För att byta plattor, vrid burgen upp och ner,Skala tejpen från plattan men håll tallriken i buret, tryck hela buret försiktigt på bänken och byt snabbt den gamla plattan till en ny, försök att inte låta flugor fly.
Obs! Flyger behöver justera sig på buret och kommer att ligga bäst från och med dag 3. De fortsätter att ligga på toppnivå i ca 4-5 dagar. Två 5 liter burar på överlagringskapaciteten kan producera upp till 1 g embryon i en övernattning över natten. Använd 1 liter burar för mindre skala experiment. - Tillåt flugor att lägga embryon på färska AJ-plattor över natten (ca 16 h), eller för någon annan önskad tidsperiod.
- Nästa morgon markera och väga nätbehållare för embryonuppsamling, en per varje flyglinje som används.
- Förbered 1x lysisbuffert med användning av reagens från avsnitt 4 (Anm .: Klar för användning 1x lysisbuffert måste framställas strax före extraktion): tillsätt 40 ml vatten till 10 ml 5x koncentrerad lysbuffert (lagrad vid -80 ° C) I ett 50 ml rör.
- Tillsätt 50 μl 1 MDTT till en slutlig koncentration av 1 mM, blanda väl och separera i två 50 ml rör, 25 ml i vardera. Till ett av rören tillsättes en proteashämmare och roterar vid 4 ° C i 30 minuter. Medan tabletten löser upp, samlar och dekargerar embryon (steg 5,8 till 6,6). Kontrollera att tabletten är helt upplöst och håll bufferten på is.
Obs! Det andra röret med 1x buffert med DTT kan lagras vid -80 ° C och behöver bara tillsättas tabletten före nästa experiment. 25 ml lysbuffert är tillräcklig för upp till 2 prover, med beaktande av efterföljande tvättar under proteinreningssteg.
- Tillsätt 50 μl 1 MDTT till en slutlig koncentration av 1 mM, blanda väl och separera i två 50 ml rör, 25 ml i vardera. Till ett av rören tillsättes en proteashämmare och roterar vid 4 ° C i 30 minuter. Medan tabletten löser upp, samlar och dekargerar embryon (steg 5,8 till 6,6). Kontrollera att tabletten är helt upplöst och håll bufferten på is.
- Markera AJ-plattorna på burarna med genotyperna för de använda flyglinjerna och byt plattorna för färska.
Obs! Överflödig jästpasta kan skrapas av plattan vid detta steg. Embryon kan åldras på plattorna vid 25 ° C eller rumstemperatur för att erhålla det önskade fönstret för utvecklingstiden. - Lägg till tillräckligt med vatten tO täcka varje AJ-platta. Lossa försiktigt embryonerna från plattan med en mjuk pensel (platta ca 10 mm breda fungerar bra för stora plattor). Häll embryonerna i den tidigare vägda och märkta nätbehållaren och dränera överskott av vatten.
- Vid behov, utför en andra sköljning och borstning av plattan för att ta bort alla embryon. Kombinera embryonerna från ytterligare tallrik (er) för samma flygledning i samma nätbehållare.
- Torka kort på nätet på pappershanddukar för att avlägsna överskott av vatten.
6. Embryo Dechorionation
- Halva fyll en 6 cm petriskål med 50% blekmedel (vol / vol lösning i vatten).
Anmärkning: Se viktig kommentar om blekmedel i materialet och reagenserna.
Varning: Använd handskar och undvik blekmedel på kläder. - Förbered 2 större petriskålar med vatten.
- Sänk nätbehållaren med embryon i 50% blekmedel i 90 s. Tryck lätt på nätet under inkuBation ett par gånger för att suspendera embryon i blekmedelslösningen.
- Vid slutet av 90 s inkubation tvätta nätbehållaren i var och en av de två diskarna med vatten i ca 10 s.
- Skölj behållaren ordentligt med 18,2 MΩ · cm vatten med sprutflaskan. Tvätta även sidorna och utsidan av nätbehållaren.
Obs! Ingen blekmedel lukt ska upptäckas efter en noggrann tvätt. - Ta bort behållaren på pappershanddukar. Väg nätbehållaren med embryonerna och dra av vikten av den tomma behållaren som erhållits i steg 5.6. Anteckna den resulterande vikten av embryonerna. En bra mängd embryon att sikta på är 0,5-1 g.
7. Framställning av embryoxtrakt
- Tillsätt 1 ml lysisbuffert med proteashämmare (från steg 5.7) till en dounce glasshomogenisator och håll den på is. Överför embryonerna från nätbehållaren till homogenisatorn.
Obs! Embryon kan plockas upp med en platt ände oFa metallspatel eller en borste och överförs direkt till bufferten. Utför alla steg i detta avsnitt på is. - Tvätta de återstående embryon på nätet med en ytterligare 1 ml lysisbuffert och sätt till materialet i homogenisatorn. Låt embryonna sätta sig ner till botten av homogenisatorn och aspirera försiktigt supernatanten.
- Tillsätt lysisbuffert med proteashämmare (från steg 5.7) till homogenisatorn med sikte på 5-6 ml lysbuffert per gram embryon.
- Homogenisera embryon med 4-6 slag med en lös monteringstempel.
Obs! Under de första slagmen kommer det att finnas mer motstånd. Försök flytta stammen i kontinuerlig rörelse för att undvika att stänk lösningen. - Homogenisera embryon med 8-10 slag med en tätt passande pestel.
- Inkubera homogenatet på is under 20 minuter.
- Överför homogenatet till mikrocentrifugrör och centrifugera vid 4 ° C i 15 minuter med högsta hastighet (ca 13 000 xg).
- AvoidiNg pellets och topplipidskiktet, överför supernatanterna till färskt mikrocentrifugrör och centrifugera vid 4 ° C i 15 minuter med högsta hastighet (ca 13 000 xg).
- Försiktigt aspirera supernatanter med 1 ml spets och laddas i kylda 10 ml sprutor med 0,45 μm filter bifogade (kombinera alikvoter av samma prov i en spruta). Tryck in hela lösningen i ett märkt 15 ml rör på is. Extraktet kan omedelbart användas för efterföljande proteinreningsexperiment eller snapsfrysas i flytande kväve och hålls vid -80 ° C för framtida användning.
Obs! Det är bättre att frysa extrakten i stället för embryon, eftersom proteaser kan bli aktiverade vid efterföljande upptining av embryon och leda till proteinnedbrytning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera användningen av detta protokoll i ett proteinkomplexa reningsexperiment genererade vi en homozygot livskraftig flyglinje, arm-EGFP-ERK , som uttrycker EGFP-märkt Drosophila extracellulärt signalreglerat kinas (ERK, kodat av den rullade genen) under kontrollen Av en ubiquitously uttryckt armadillo ( arm ) promotor 18 , 19 . Armpromotorn är aktiv under de flesta stadier av Drosophila embryogenes 19 . Lysater framställdes med användning av det beskrivna protokollet och uttrycket av protein från armen-EGFP-ERK- transgen bekräftades genom western blotting för totalt ERK-protein för att samtidigt detektera nivåerna av endogent och transgena EGFP-ERK, migrera vid 42 kDa och 69 kDa , Respektive ( figur 2A ). Ett enda band som motsvarar ej taggad endogen ER K (42 kDa) detekterades i yw styrledningen . Detta resultat bekräftar en framgångsrik extraktion av ERK och EGFP-ERK från embryon.
För att testa om vårt extraheringsprotokoll är lämpligt för efterföljande rening av ett märkt protein, utsattes extrakt från yw- och arm-EGFP-ERK- flugorna genom affinitetsrening med användning av GFP-agaros-pärlor enligt fastställda protokoll 10 , 11 . Silverfärgning av prover som kördes på en gradient SDS-PAGE visade en framgångsrik rening av beteproteinet, EGFP-ERK ( Figur 2B ). Förutom EGFP-ERK själv innehöll det experimentella fältet ytterligare band som inte observerades i kontroll- yw- provet, vilket antyder att reningsförfarandet återhämtade potentiella ERK-interagerande proteiner.
"Src =" / files / ftp_upload / 55804 / 55804fig1.jpg "/>
Figur 1 : Framställning av befolkningsburar. ( A - D ) En 5-L-bur tillverkad av en plastbehållare. ( A ) En startbehållare. ( B ) Bottenvy av 5 L-buret. ( C ) Uppifrån av 5 l bur med nätfäste. ( D ) Sammansatt 5 liter bur med en 15 cm äppeljuiceplatta, bottenvy. ( E och F) En 3 tum (76 mm) borr som används för borrning av hål i 1 L-behållaren. ( G , H ) En 1 liter bur. ( G ) Uppifrån av en 1 liter bur med nätfäste. ( H ) Monterad 1 liter bur med en 10 cm äppeljuiceplatta fäst, bottenvyn. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras här är ett enkelt och allmänt förfarande för att bygga upp Drosophila- populationburar i medelstora skala och göra helcells-proteinextrakt från embryon. De resulterande extrakten kan användas i en mängd olika efterföljande applikationer, såsom rening av proteinkomplex på affinitetshartser. Det är kritiskt att utföra extraktionsstegen på is och använd stark proteasehämning för att minimera proteinnedbrytning. Som beskrivet är protokollet lämpligt för isolering av de flesta cytoplasmatiska och vissa membran och lösliga kärnproteiner 6 , 10 , 12 , 15 . Det kan lätt anpassas för en mer fokuserad rening av proteiner från andra fack, såsom isolering av mindre lösliga kärnproteiner med användning av högsaltekstraktion 5 . Som nämnts i steg 5.8 kan insamlingstider och embryo-åldringsperioder varaInrättas med exakta mellanrum för att få olika utvecklingsstadier.
Det är ofta önskvärt att fastställa att det märkta proteinet av intresse uttrycks vid nivåer som nära matchar de endogena uttrycksnivåerna, vilket vi har visat med användning av anti-totalt ERK-antikropp ( Figur 2A ). Om antikroppen mot endogent protein inte är tillgängligt kan funktionaliteten hos konstruktionerna verifieras med andra analyser, t ex i ett genetiskt räddningsexperiment. I de flesta fall skulle emellertid en mild överuttryckning av det märkta proteinet fortfarande resultera i isolering av meningsfulla proteinkomplex, och kan i själva verket underlätta extraktion och rening av "svåra" proteiner.
Den största fördelen med detta protokoll är dess enkelhet och möjlighet att ställa in hela proceduren till måttlig kostnad. En ytterligare fördel med att använda mindre burar är att flera transgena linjer kan sättas upp och analyseras i paralleL, vilket kanske inte är möjligt vid användning av större burar. De flygburar vi beskriver här kan enkelt rengöras och återanvändas i flera år. I stället för att göra 1-L burar från Nalgene burkar som beskrivits, är det möjligt att använda andra tillgängliga behållare, till exempel en mindre version av 5-L-behållaren.
Vi har framgångsrikt använt detta protokoll (eller dess variationer med små modifieringar) för rening av komplex som innehåller olika signalproteiner och associerade komponenter, följt av analys med masspektrometri 6 , 10 , 15 . Dessa tillvägagångssätt har lett till identifiering av nya PPI som validerades ytterligare i funktionella studier 10 , 15 . Variationer av protokollet som presenteras här har tidigare använts för att analysera fosfoproteomen i Drosophila embryogenes 20 och att studera landskapetAv ubiquitination i neural utveckling 21 , 22 . Denna procedur representerar därför en lämplig gateway för att analysera PPIs in vivo och kan användas för andra proteomikapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar medlemmarna i Veraksa-laboratoriet för användbara kommentarer om manuskriptet och förslag till förbättringar av protokollet. AV stöddes av NIH-stipendierna GM105813 och NS096402. LY stöddes av University of Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
References
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
