Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הכנה בינונית של Published: May 30, 2017 doi: 10.3791/55804
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Biology Department, University of Massachusetts Boston, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

Abstract

ניתוח אינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI) הפך לגישה הכרחית לחקר תהליכים ומנגנונים ביולוגיים, כגון איתות תא, התפתחות אורגניזם ומחלות. זה רצוי לעתים קרובות להשיג מידע PPI באמצעות חומר vivo , כדי לקבל את התצוגה הטבעית ביותר ללא דעות מוקדמות של רשתות האינטראקציה. זבוב הפירות תסיסנית melanogaster היא פלטפורמה מצוינת ללמוד PPIs in vivo , וכן משאיל את עצמו גישות פשוטות לבידוד חומר ניסויים ביוכימיים. בפרט, עוברי זבוב הפירות מייצגים סוג נוח של רקמות לבדיקת PPI, בשל הקלות באיסוף בעלי חיים בשלב ההתפתחותי הזה והעובדה שרוב החלבונים באים לידי ביטוי בעובר, ובכך מספקים סביבה רלוונטית לחשוף את רוב ה- PPI. כאן אנו מציגים פרוטוקול אוסף של עוברי תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם), אשר הוא סכום אידיאלי עבור מגוון רחב שליישומי proteomic, כולל ניתוח של PPIs על ידי זיקוק טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS). אנו מתארים את העיצובים שלנו עבור כלובים 1 L ו 5 L עבור אוספים העובר כי ניתן בקלות ובזול להגדיר במעבדה כלשהי. כמו כן, אנו מספקים פרוטוקול כללי עבור אוסף העובר ואת החילוץ חלבון לייצר lysates כי ניתן להשתמש ישירות ביישומים במורד הזרם כגון AP-MS. המטרה שלנו היא לספק אמצעי נגיש לכל החוקרים לבצע את הניתוחים של PPIs in vivo .

Introduction

מסכים גנטיים, ולאחרונה, גישות גנומיות חוללו מהפכה במחקר של פונקציות ביולוגיות. עם זאת, מידע סלולרי חשוב מקודדים חלבונים האנסמבל שלהם של שותפים אינטראקציה. בעוד המסכים הגנטיים המסורתיים יכולים לזהות את רכיבי המסלול המגבילים את קצב התגובה ולהחלים אינטראקציות עקיפות, כוחן של הגישות הפרוטאומטיות טמון ביכולתן לזהות רשתות של אינטראקציה מיידית של חלבונים בעלי עניין. פרוטאומיקס היא אפוא שיטת אורתוגונלית חשובה כדי לחקור מערכות ביולוגיות, ומשלימה גנומים, תמלילי טקסטים ומסכים גנטיים מסורתיים. זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS) הוכיח להיות גישה רבת עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון חלבון (PPIs) בסביבתם הטבעית בתאים ורקמות 1 , 2 . שיטה זו מאפשרת זיהוי של אינטראקציות ישירות או עקיפות בפיתוח ספציפיאל השלבים או רקמות, והוא שימש בהצלחה לזהות PPIs רומן חדש במגוון מסלולים התפתחותיים (הנסקרת בהתייחסות 1 ). למרות ההצלחה הבלתי מעורערת של מחקרים PPI, רובם בוצעו בתאים בתרבית, שבו חלבונים "הפיתיון" של עניין היו overexpressed. ישנם שני נושאים עם חקר PPIs בתרבית תאים: הראשון, קו תא מסוים לא יכול לספק להשלים מלא של אינטראקציות בשל חוסר ביטוי של חלבונים מסוימים. שנית, overexpression גבוה בדרך כלל מועסקים ב ניתוחים כאלה עלול להוביל חפצים כגון חלבונים misfolding או זיהוי של אינטראקציות חיוביות כוזבות.

שתי המגבלות הללו ניתן להתגבר על ידי ניתוח PPIs in vivo . צעד מגביל בניסויים כאלה הוא הזמינות של חומר המוצא לטיהור קומפלקסים חלבונים. תסיסנית melanogaster מזה זמן רב שימש מודל לניתוח פונקציונליSis, ולאחרונה זה הוכח גם להיות מערכת מצוינת לחקר PPIs in vivo . תסמונת עוברים תסיסנית מייצגת סוג רקמה אטרקטיבי במיוחד כדי למדוד PPIs, כי עוברי ניתן לאסוף בקלות בכמויות גדולות, וגם בגלל שרוב הגנים (> 88%) באים לידי ביטוי במהלך embryogenesis, ובכך לספק עשיר בסביבה vivo לאיתור רלוונטי PPIs 3 .

באופן מסורתי, מחקרים ביוכימיים זבובים השתמשו מאוד בקנה מידה גדול אוספים אוספים (100-150 גרם), כגון אלה הדרושים לטהור lysates תעתיק פונקציונלי 4 , 5 . מחקרים קודמים AP-MS ב תסיסנית גם צורך כמויות גדולות של עוברים (5-10 גרם), כי הם הסתמכו על גישה טיהור שני שלבים כגון טיהור זיקה טנדם (TAP), עם אובדן הקשורים של חומר בכל שלב 6 . Amoun גדולTS של חומר המוצא הכרחי הגדרת אוספי העובר בכלובים האוכלוסייה גדול, אשר יכול להיות גם יקר (כאשר רכש מסחרית) ודורש זמן כדי לשמור ולנקות 7 , 8 , 9 .

ההתקדמות לאחרונה בפיתוח של זוויות צעד אחד טיהור זיקה, כמו גם את הרגישות הגוברת של ספקטרומטרים המונית, צמצמו את הכמות הנדרשת של חומר המוצא על ידי סדר גודל. באמצעות תגים כגון פפטיד מחייב streptavidin (SBP) או חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו החל מ 1 גרם של עוברים, ניתן לבודד את כמויות של חלבון הפיתיון רכיבים אינטראקציה זה יהיה מספיק עבור זיהוי על ידי ספקטרומטריית מסה 10 , 11 .

מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא לסייע לחוקרים overcoלי מחסום נתפס ניתוח ביוכימי של PPIs in vivo . לשם כך, אנו מספקים הליך פשוט וזול כדי לאסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם), ואחריו הכנה צעד אחד של תמציות חלבון שלם התא המתאימים לניתוח שלאחר מכן על ידי AP-MS או גישות אחרות . השיטה שלנו מסתמכת על שימוש בכלובי אוכלוסייה מותאמים אישית של 1-L או 5-L שניתן לייצר בקלות על ידי כל מעבדה. יתר על כן, תנאי החילוץ המוצגים כאן אומתו במספר מחקרים, הן בתאים בתרבית והן ב- vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת 5 L כלובי זבוב (כדי להתאים 15 ס"מ צלחות)

  1. השג את החומרים הדרושים: מיכל 5-quart (4.7-L) עם מכסה ( איור 1 א ' ), רשת ניילון, סכין גילוח.
  2. סמן מעגל בקוטר 12 ס"מ לחתוך חור בחלק התחתון של המיכל באמצעות סכין גילוח ( איור 1 ב ). חותכים חור בקוטר 15 ס"מ במכסה ( איור 1C ).
  3. גזור רשת ניילון לתוך 25 x 25 ס"מ ריבועים.
  4. מניחים את הרשת מעל השפה העליונה של המיכל ולחץ למטה עם המכסה ( איור 1 ג ). ודא את הרשת הוא הדוק ואת המכסה אינו מוטה. הכלוב מוכן להיות מאוכלס עם זבובים (ראה שלב 5.3).

2. הכנת 1 L כלובים זבוב (כדי להתאים 10 ס"מ צלחות)

  1. השג את החומרים הדרושים: מקדחה חשמלית, 3 אינץ '(76 מ"מ) כלי חיתוך ( איור 1E ו Fצורה 1F), צנצנת פלסטיק חד צדדית עם מכסה, רשת ניילון, סכין גילוח, נייר זכוכית, משקפי מגן וכפפות עבודה.
  2. חותכים 3 אינץ '(76 מ"מ) חורים בתחתית המכסה של צנצנת פלסטיק ( איור 1G ), עם מכסה דפוק בחוזקה על המיכל בעת קידוח. מקם את כלי חיתוך במרכז המעגל כאשר מתחילים לעשות חור.
    זהירות: ללבוש הגנה על העיניים וכפפות עבודה במהלך שלב זה.
  3. להחליק את הקצוות של החורים עם סכין גילוח ונייר זכוכית.
  4. גזור רשת ניילון לתוך 18 x 18 ס"מ ריבועים.
  5. מניחים את הרשת מעל השפה העליונה של הצנצנת ולהדק על ידי הברגה את המכסה על ( איור 1G ). ודא את הרשת הוא הדוק ואת המכסה אינו מוטה. הכלוב מוכן להיות מאוכלס עם זבובים (ראה שלב 5.3).

3. הכנת מיץ תפוחים (AJ) צלחות

  1. הוסף 19 גרם אגר ו 1 L של 18.2 MΩ · מים ס"מ לתוך בקבוק 2 L.מוסיפים את הסיר ומערבבים בקצרה.
  2. החיטוי למשך 30 דקות. בינתיים, להפשיר 100% מיץ תפוחים להתרכז מלאי קפוא, ולהכין 10 מ"ל של 10% (משקל / נפח) מתיל 4-hydroxybenzoate פתרון באתנול.
  3. לאחר החיטוי, להתחיל לערבב את אגר על צלחת ומערבבים, ולהוסיף 80 מ"ל של 100% מיץ התפוחים להתרכז 10 מ"ל של 10% (משקל / נפח) מתיל 4-hydroxybenzoate פתרון הבקבוק. בואו להתקרר בטמפרטורת החדר עם ערבוב מתמיד.
  4. יוצקים 15 ס"מ צלחות פטרי (עבור 5 כלובים L) או 10 ס"מ צלחות פטרי (עבור כלובים 1 L), כך רמת אגר בכל מנה הוא כ 5 מ"מ עובי. אפשר לחזק בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות ניילון. לוחות AJ ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.
    הערה: ניתן לשטוף את הכלים של פטרי ולעשות בהם שימוש חוזר.
  5. הכן להדביק שמרים רטובים: לשפוך קצת שמרים יבשים פעיל לתוך מיכל 100 מ"ל עם מכסה שיאפשר ערבוב קל, ולהוסיף מים בכמויות קטנות תוך ערבוב, כדי לקבל עבה אבל מעורבב היטבלְהַדבִּיק. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.

4. הכנת ריאגנטים תמוגה

  1. הכן חיץ 5x תמוגה: 250 מ"מ טריס pH 7.5, גליצרול 25%, 1% octylphenoxy פולי (ethyleneoxy) אתנול (IGEPAL CA-630), 7.5 מ"מ MgCl 2 , 625 מ"מ NaCl, 125 מ"מ NaF, 5 מ"מ Na 3 VO 4 .
    1. כדי להפוך 200 מ"ל: להמיס לחלוטין 1 גרם אבקת NaF ו 184 מ"ג Na 3 VO 4 אבקה ב 71 מ"ל מים עם ערבוב מתמיד. הוסף 50 מ"ל 1 M טריס pH 7.5, 2 מ"ל 100% IGEPAL, 1.5 מ"ל 1 M MgCl 2 , ו 25 מ"ל 5 M NaCl. ואז מוסיפים 50 גליצרול מ"ל (להוסיף האחרון) ולהמשיך לבחוש במשך 1 שעות.
    2. סנן לעקר באמצעות 250-מסנן יחידות מסנן. צעד זה יכול להיות איטי, אבל סינון הפתרון חשוב להסיר חלקיקים מסיסים. Aliquot ידי 10 מ"ל צינורות 50 מ"ל לחנות ב -80 מעלות צלזיוס.
  2. הכן 1 M dithiothreitol (DTT) פתרון במים. חנות ב -20 מעלות צלזיוס 1 aliquots מ"ל.
  3. השג פרוטאיןטבליות קוקטייל אסאי, עם חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA). חנות ב 4 ° C.
  4. השג 10 מזרקים מ"ל מסננים מזרק: 26 מ"מ קוטר, ללא פעילי שטח תאית אצטט (SFCA), 0.45 מיקרומטר גודל הנקבוביות.

5. אוסף של עוברי זבוב

  1. להגביר את קווי זבוב מהונדס נושא את החלבון מתויג עניין בקבוקים (כ -100 זבובים לכל בקבוק), ולהעביר את הבקבוקים כל יומיים עד 25-30 בקבוקים הם צברו עבור כל קו לעוף. להגביר את מלאי שליטה ( למשל את קו yw ) בצורה דומה.
  2. חם AJ צלחות לטמפרטורת החדר (כ 1-2 שעות, ניתן לעשות בן לילה). באמצעות אצבע כפפה, להפיץ קצת שמרים לחות להדביק במרכז צלחות AJ, כדי לעשות כ. מעגל 6 ס"מ עבור צלחת 15 ס"מ ומעגל 4 ס"מ עבור צלחת 10 ס"מ.
  3. להרדים את הזבובים עם זרימת דו תחמוצת הפחמן באמצעות תקן שלב תסיסנית שלב, ולהעביר לתוךהכלובים (כ -15 בקבוקי זבובים גדולים לכלוב 5 L, 5 בקבוקים לכלוב 1 L).
    1. מכסים את תחתית כלוב עם צלחות AJ מוכן משלב 5.2, ואת הקלטת צלחת AJ לכלוב באמצעות שתי רצועות של קלטת ( דמויות 1D ו 1H ). זה שימושי לקפל מעל קצות הקלטת כי ללכת על הצלחת לקילוף קל בעת שינוי צלחות.
    2. לאחר זבובים להתאושש הרדמה, לשמור על הכלובים עם הצלחות בתחתית רשת מעל.
      הערה: חשוב לחכות עד זבובים לחלוטין להתאושש, כפי שהם אחרת מקל על צלחת AJ ואת שמרים להדביק.
    3. בסוף הניסוי, כדי להכין את הכלוב לניקוי, במקום הכלוב במקפיא במשך כמה שעות. השריית הרשת במים למשך מספר שעות תאפשר ניקוי.
  4. דגירה הכלובים עם זבובים בטמפרטורת החדר במשך 2-3 ימים ולשנות צלחות AJ פעמיים ביום. כדי לשנות את הצלחות, להפוך את הכלוב במהופך,לקלף את הקלטת מהצלחת, אבל להחזיק את הצלחת לכלוב, להקיש את הכלוב בעדינות על הספסל, ולהחליף במהירות את הצלחת הישנה למגש חדש, בניסיון לא לאפשר לזבובים לברוח.
    הערה: זבובים צריך להתאים את הכלוב יהיה להטיל הכי טוב החל ביום 3. הם ימשיכו הנחת ברמה שיא במשך כ 4-5 ימים. שני 5 כלובים L בראש קיבולת הנחת יכול לייצר עד 1 גרם של עוברים באוסף לילה. השתמש בכלובים 1 L עבור ניסויים בקנה מידה קטן יותר.
  5. אפשר זבובים להניח עוברים על לוחות AJ טריים לילה (כ 16 שעות), או לכל אורך אחר הרצוי.
  6. למחרת בבוקר, סמן ולשקול מכולות רשת עבור אוסף העובר, אחד לכל קו לעוף בשימוש.
  7. הכן חיץ 1x תמוגה, באמצעות ריאגנטים מקטע 4 (הערה: מוכן לשימוש 1x תמוגה חיץ צריך להיות מוכן ממש לפני החילוץ): להוסיף 40 מ"ל מים ל 10 מ"ל של 5x חיץ תמוגה מרוכז (מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס) בצינור 50 מ"ל.
    1. הוסף 50 μL של 1 MDTT לריכוז סופי של 1 מ"מ, מערבבים היטב נפרדים לשני צינורות 50 מ"ל, 25 מ"ל בכל. כדי אחד הצינורות, להוסיף אחד מעכב פרוטאז מעכב לסובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעוד הטבליה הוא המסת, לאסוף עוברי dechorionate (צעדים 5.8 עד 6.6). בדוק כדי לוודא את הטבליה יש מומס לחלוטין, ולשמור את המאגר על הקרח.
      הערה: הצינור השני של חיץ 1x עם DTT ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס יהיה רק ​​דורשים תוספת של הלוח לפני הניסוי הבא. 25 מ"ל של חיץ תמוגה מספיקה עד 2 דגימות, תוך לקיחה בחשבון שוטף הבאים במהלך טיהור חלבון צעדים.
  8. סמן את לוחות AJ על הכלובים עם גנוטיפים של הקווים זבוב בשימוש, להחליף את הצלחות עבור אלה טריים.
    הערה: עודף שמרים להדביק ניתן לגרד את הצלחת בשלב זה. עוברים ניתן הזדקנות על צלחות ב 25 ° C או בטמפרטורת החדר כדי לקבל את החלון הרצוי של זמן התפתחותי.
  9. הוסף מספיק מים לאO לכסות כל צלחת AJ. בעדינות לעקור את העוברים מהצלחת עם מברשת צבע רכה (ראש שטוח כ 10 מ"מ רחב עובד היטב עבור צלחות גדולות). יוצקים את העוברים לתוך שקלול בעבר מיכל רשת מסומנים, ולנקז עודף מים.
    1. אם יש צורך, לבצע שטיפה השני צחצוח של הצלחת כדי להסיר את כל העוברים. שלב את העוברים מצלחת נוספת (ים) עבור אותו לטוס לקו לתוך מיכל רשת זהה.
  10. קצר כתם את הרשת על מגבות נייר כדי להסיר עודף מים.

6. העובר Dechorionation

  1. חצי למלא צלחת פטרי 6 ס"מ עם אקונומיקה 50% (כרך / כרך פתרון במים).
    הערה: ראה תגובה חשובה על המותג אקונומיקה בטבלה של חומרים ריאגנטים.
    זהירות: ללבוש כפפות ולהימנע אקונומיקה על בגדים.
  2. הכינו 2 מנות פטרי גדול עם מים.
  3. לטבול את מיכל רשת עם עוברים ב 50% אקונומיקה במשך 90 s. הקש את הרשת בעדינות במהלך incuBation כמה פעמים כדי להשעות את העוברים בפתרון אקונומיקה.
  4. בסוף הדגירה 90 s, לשטוף את מיכל רשת בכל אחד 2 מנות עם מים על 10 שניות.
  5. שוטפים את מיכל רשת היטב עם מים 18.2 MΩ · ס"מ באמצעות בקבוק גמירה. כמו כן, לשטוף את הצדדים ואת החיצוני של מיכל רשת.
    הערה: אין ריח אקונומיקה צריך להיות מזוהה לאחר לשטוף יסודי.
  6. כתם את מיכל הרשת על מגבות נייר. לשקול את מיכל רשת עם העוברים ואת להפחית את המשקל של מיכל ריק שהושג בשלב 5.6. רשום את המשקל המתקבל של העוברים. כמות טובה של עוברים לכוון הוא 0.5 - 1 גרם.

7. הכנת תמצית העובר

  1. הוסף 1 מ"ל של חיץ תמוגה עם מעכבי פרוטאז (משלב 5.7) כדי homogenizer זכוכית dounce ולשמור אותו על הקרח. מעבירים את העוברים מן המיכל רשת לתוך homogenizer.
    הערה: עוברים ניתן הרים עם סוף שטוח oמתכת spatula או מברשת ומועברים ישירות למאגר. בצע את כל השלבים בסעיף זה על קרח.
  2. לשטוף את העוברים הנותרים על הרשת עם חיץ נוסף 1 מ"ל תמוגה ולהוסיף חומר homogenizer. בואו העוברים להתיישב לתחתית homogenizer, בזהירות לשאוב supernatant.
  3. הוסף חיץ תמוגה עם מעכבי פרוטאז (משלב 5.7) כדי homogenizer, מכוון 5-6 מ"ל של חיץ תמוגה לגרם של עוברי.
  4. Homogenize את העוברים על ידי 4-6 משיכות עם עליון רופף.
    הערה: במהלך שבץ הראשון, תהיה התנגדות יותר. נסו להזיז את העלי בתנועה מתמשכת כדי להימנע מתיז הפתרון.
  5. Homogenize את העוברים על ידי 8-10 משיכות עם העלי הדוקה.
  6. דגירה homogenate על קרח במשך 20 דקות.
  7. מעבירים את homogenate לתוך צינורות microcentrifuge ו צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות במהירות העליון (כ 13,000 XG).
  8. AvoidiNg את כדורי ואת השכבה העליונה מאוד השומנים, להעביר supernatants לתוך צינורות microcentrifuge טריים צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות במהירות הגבוהה ביותר (כ 13,000 XG).
  9. בזהירות לשאוב supernatants עם קצה 1 מ"ל עומס לתוך מזרק 10 מ"ל מזרק עם 0.45 מיקרומטר מסננים המצורפת (לשלב aliquots של אותו מדגם לתוך מזרק אחד). דחוף את כל הפתרון לתוך צינור שכותרתו 15 מ"ל על הקרח. תמצית ניתן להשתמש באופן מיידי עבור ניסויים טיהור חלבון הבאים או הצמד קפוא בחנקן נוזלי נשמר ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
    הערה: עדיף להקפיא את תמציות ולא את העוברים, כי במהלך ההפשרה הבאים של פרוטאזות עוברי עשוי להיות מופעל ולהוביל השפלה חלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להמחיש את השימוש בפרוטוקול זה בניסוי טיהור חלבון מורכב, יצרנו קו זבוב הומוזיגואי קיימא, הזרוע EGFP-ERK , המבטא EGFP מתויג תסיסנית תאיים אותות קינאז מוסדר (ERK, מקודד על ידי הגן מגולגל ) תחת שליטה של ארמדיל לידי ביטוי בכל מקום ( זרוע ) האמרגן 18 , 19 . יוזם הזרוע פעיל במהלך רוב השלבים של תסיסנית עוברי 19 . Lysates הוכנו באמצעות פרוטוקול המתואר, ואת הביטוי של חלבון מן transfene הזרוע EGFP-ERK אושרה על ידי המערבי סופג עבור חלבון ERK הכולל בו זמנית לזהות את רמות EGFP-ERK אנדוגני מהונדס, נודדים ב 42 kDa ו 69 kDa , בהתאמה ( איור 2 א ). הלהקה אחת המתאימה ER אנדוגני ER K (42 kDa) זוהה בקו הבקרה yw . תוצאה זו מאשרת מיצוי מוצלח של ERK ו EGFP-ERK מעוברים.

כדי לבדוק אם פרוטוקול החילוץ שלנו מתאים טיהור הבאים של חלבון מתויג, תמציות מן yw וזרוע EGFP-ERK זבובים היו כפופים לטיהור זיקה באמצעות חרוזים GFP-agarose הבאים פרוטוקולים הוקמה 10 , 11 . מכתים כסף של דגימות לרוץ על שיפוע SDS-PAGE הראה טיהור מוצלח של חלבון הפיתיון, EGFP-ERK ( איור 2 ב ). מלבד EGFP-ERK עצמו, הנתיב ניסיוני הכיל להקות נוספות שלא נצפו במדגם yw שליטה, טוען כי הליך טיהור התאושש פוטנציאל ERK אינטראקציה חלבונים.

"Src =" / files / ftp_upload / 55804 / 55804fig1.jpg "/>
איור 1 : הכנת כלובי האוכלוסייה. ( A - D ) כלוב 5-L עשוי מכל פלסטיק. ( א ) מיכל מתחיל. ( ב ) מבט מלמטה של ​​כלוב 5 L. ( ג ) תצוגה למעלה של 5 L כלוב עם רשת המצורפת. ( ד ) התאספו 5 L כלוב עם צלחת מיץ תפוח 15 ס"מ, מבט מלמטה. ( E ו- F) מקדח 3 אינץ '(76 מ"מ) המשמש לחורי קידוח במיכל 1 ליטר. ( G , H ) כלוב 1 L. ( G ) תצוגה למעלה של כלוב 1 L עם רשת המצורפת. ( H ) התאספו 1 L כלוב עם 10 ס"מ צלחת מיץ תפוחים המצורפת, מבט מלמטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2 : מיצוי וטיהור של EGFP-ERK מעוברים. ( א ) כתם המערבי מראה ביטוי של EGFP-ERK ו ERK אנדוגני בתמצית מוכן מן הזרוע EGFP-ERK קו מהונדס. קו yw שימש כבקרה. ירוק, נוגדן ERK כולל; אדום, סמן משקל מולקולרי. ( ב ) כסף מוכתם ג'ל מראה מטוהרים EGFP-ERK וחלבונים הקשורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן הוא הליך פשוט כללי להקמת כלוב האוכלוסייה תסיסנית בקנה מידה בינוני ועושה תמציות חלבון התא כולו מעוברים. תמציות וכתוצאה מכך ניתן להשתמש במגוון של יישומים במורד הזרם, כגון טיהור של מתחמי חלבון על שרף זיקה. זה קריטי לבצע את שלבי החילוץ על קרח ולהשתמש עיכוב פרוטאז חזקה, כדי למזער השפלה חלבון. כמתואר, הפרוטוקול מתאים לבידוד של רוב cytoplasmic וכמה קרום חלבונים גרעיניים מסיסים 6 , 10 , 12 , 15 . זה יכול להיות מותאם בקלות עבור טיהור ממוקדת יותר של חלבונים מתאים אחרים, כגון בידוד של חלבונים גרעיניים מסיסים פחות באמצעות מיצוי מלח גבוהה 5 . כפי שהוזכר בשלב 5.8, זמני איסוף תקופות ההזדקנות העובר יכול להיותשהוקמו במרווחים מדויקים כדי להשיג שלבי התפתחות שונים.

לעתים קרובות רצוי לוודא כי חלבון מתויג של עניין באה לידי ביטוי ברמות מקרוב תואם את רמות האנדוגני של הביטוי, כפי שהראינו באמצעות נוגדן אנטי ERK סך ( איור 2 א ). אם הנוגדן נגד חלבון אנדוגני אינו זמין, את הפונקציונליות של המבנים ניתן לאמת על ידי מבחני אחרים, למשל בניסוי הצלה גנטית. ברוב המקרים עם זאת, overexpression עדין של חלבון מתויג צריך עדיין לגרום לבידוד של קומפלקסים חלבונים משמעותיים, ועלול למעשה להקל על הטיהור וטיהור של חלבונים "קשה".

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הפשטות שלה ואת האפשרות להגדיר את ההליך כולו במחיר בינוני. יתרון נוסף של שימוש בכלובים קטנים יותר היא כי מספר קווים מהונדס יכול להיות מוגדר ונותחו בקבילותL, אשר לא יכול להיות ריאלי בעת שימוש בכלובים גדולים. הכלובים זבובים אנו מתארים כאן ניתן לנקות בקלות ולעשות בה שימוש חוזר במשך שנים. במקום לעשות כלובים 1-L של צנצנות Nalgene כפי שתואר, ניתן להשתמש במיכלים זמינים אחרים, כגון גרסה קטנה יותר של מיכל 5-L.

השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה (או וריאציות שלו עם שינויים קטנים) עבור טיהור קומפלקסים המכילים חלבונים איתות שונים ומרכיבים הקשורים, ואחריו ניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה 6 , 10 , 15 . גישות אלו הובילו לזיהוי של PPIs חדשניים שאומתו גם במחקרים תפקודיים 10 , 15 . וריאציות של הפרוטוקול המוצג כאן שימשו בעבר כדי לנתח את phosphoproteome ב תסיסנית embryogenesis 20 , וכדי ללמוד את הנוףשל ubiquitination בהתפתחות העצבים 21 , 22 . הליך זה ולכן מייצג שער נוח לניתוח PPIs in vivo , והוא שמיש עבור יישומים proteomics אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לחברי המעבדה Veraksa להערות מועילות על כתב היד והצעות לשיפורים בפרוטוקול. AV נתמך על ידי NIH מענקים GM105813 ו NS096402. LY נתמך על ידי אוניברסיטת מסצ 'וסטס בוסטון סנופי Genzyme דוקטורט אחוות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) Home Depot 209330 For making 5-L cages.
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) Home Depot 209320 Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm Fisher Scientific FB0875714 Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm Fisher Scientific FB0875713A Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.
Sefar NITEX nylon mesh Sefar 03-180/44 180 micron, 44% open area, used for fly cages.
Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor Home Depot 49-56-9670 3 inch cutting tool for making 1-L cages.
Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure Fisher Scientific 11-823-33 For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.
Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch Red Star  can be purchased from Amazon.com or other suppliers.
Frozen 100% Apple Juice Concentrate  can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can.
Methyl 4-hydroxybenzoate Acros Organics AC126965000 also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.
IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml Sigma I8896 used for preparing lysis buffer.
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane  Fisher Scientific 09-740-2A 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.
Corning SFCA syringe filters  Fisher Scientific 09-754-21 SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples.
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles Fisher Scientific 14-823-2A for filtering final extract samples. BD cat # 309604.
Bleach Clorox used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.
Corning Costar Netwell Plates Fisher Scientific 07-200-213 mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well.
Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml Fisher Scientific 06-435B homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
  2. Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
  3. Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
  4. Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
  5. Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
  6. Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
  7. Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
  8. Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
  9. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
  10. Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
  11. Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).
  12. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
  13. Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
  14. Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
  15. Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).
  16. Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
  17. Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
  18. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  19. Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
  20. Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
  21. Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
  22. Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 123 לחלץ lysate חלבון, זבוב פירות עוברים proteomics בקנה מידה בינוני טיהור כלוב
הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne,… More

Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne, S., Kyriakakis, P., Veraksa, A. Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55804, doi:10.3791/55804 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter