Summary
Bu protokolün amacı , orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması ve afinite saflaştırması-kütle spektrometresi (AP-MS) gibi protein proteini uygulamalarında kullanılabilen protein ekstraktlarının hazırlanması için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır ).
Abstract
Protein-protein etkileşimlerinin analizi (PPI'ler) hücre sinyalleri, organizma gelişimi ve hastalık gibi biyolojik süreçleri ve mekanizmaları incelemek için vazgeçilmez bir yaklaşım haline geldi. Etkileşim ağlarının en doğal ve yansız görüntüsünü elde etmek için genellikle in vivo materyal kullanılarak PPI bilgisini elde etmek istenir. Meyve sinekleri Drosophila melanogaster , PPI'ları in vivo olarak incelemek için mükemmel bir platformdur ve kendisini biyokimyasal deneyler için materyali izole etmek için doğrudan yaklaşımlara borç verir. Özellikle, meyve sineği embriyoları, hayvanları bu gelişim aşamasında toplama kolaylığı ve proteinlerin çoğunluğunun embriyogenezde eksprese edilmesi nedeniyle PPI'ları incelemek için uygun bir doku türü temsil eder ve böylece çoğu PPI'yı ortaya çıkaracak uygun bir ortam sağlar. Burada orta büyüklükte (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması için bir protokol sunmaktayız ki bu geniş bir aralık için ideal bir miktardırAfinite saflaştırma-kütle spektrometresi (AP-MS) ile PPI'lerin analizi de dahil olmak üzere proteomik uygulamalar. Herhangi bir laboratuarda kolaylıkla ve ucuza kurulabilen embriyo koleksiyonları için 1 L ve 5 L kafesler için tasarımlarımızı açıklıyoruz. Ayrıca, AP-MS gibi aşağı akışlı uygulamalarda doğrudan kullanılabilen lizat üretmek için embriyo toplama ve protein ekstraksiyonu için genel bir protokol de sunuyoruz. Hedefimiz, tüm araştırmacılar için PPI analizlerini in vivo gerçekleştirmek için erişilebilir bir araç sağlamaktır.
Introduction
Genetik ekranlar ve daha yakın zamanda genomik yaklaşımlar biyolojik fonksiyonların incelenmesinde devrim yarattı. Bununla birlikte, önemli hücresel bilgiler, proteinlerde ve etkileşen ortakların topluluğunda kodlanır. Geleneksel genetik modifikatör ekranlar hız sınırlayıcı yol bileşenlerini belirleyebilir ve dolaylı etkileşimleri geri kazanabilirken, proteomik yaklaşımların gücü, ilgilenilen proteinlerin tam derhal etkileşim ağı tanımlama yeteneğinde yatar. Proteomik biyolojik sistemleri incelemek için dolayısıyla değerli ortogonal bir yöntemdir ve genomik, transkriptomikler ve geleneksel genetik ekranları tamamlar. Afinite saflaştırma-kütle spektrometresi (AP-MS), protein-protein etkileşimlerini (PPI'ler) kendi doğal ortamlarındaki hücreler ve dokularda 1 , 2 çalışmak için güçlü bir yaklaşım olarak kanıtlanmıştır. Bu yöntem, spesifik gelişimde doğrudan veya dolaylı etkileşimlerin tanımlanmasına izin verir.Çeşitli aşamalardaki çeşitli PPI'leri tanımlamak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır (referans 1'de gözden geçirilmiştir). ÜFE çalışmalarının tartışılmaz bir başarıya rağmen, çoğu ilginç "yem" proteinlerinin aşırı eksprese edildiği kültür hücrelerinde gerçekleştirildi. Hücre kültüründe ÜFE'nin incelenmesi ile ilgili iki konu vardır: Birincisi, belirli bir hücre hattı, belirli proteinlerin ekspresyon eksikliği nedeniyle etkileşimleri tam olarak tamamlayamayabilir. İkincisi, bu tür analizlerde genellikle yüksek aşırı ifade, protein hatalı katlama veya sahte pozitif etkileşimlerin belirlenmesi gibi artefaktlara yol açabilir.
Bu sınırlamaların her ikisi de PPI'ları in vivo olarak analiz ederek üstesinden gelinebilir. Bu deneylerde sınırlayıcı bir adım, protein komplekslerinin saflaştırılması için başlangıç materyalinin bulunmasıdır. Drosophila melanogaster uzun zamandır fonksiyonel analize yönelik bir model olarak kullanılmıştırSis ve son zamanlarda in vivo PPI'ları incelemek için mükemmel bir sistem olduğu da gösterildi. Drosophila embriyogenezi, PPI'ları incelemek için özellikle cazip bir doku türünü temsil eder, çünkü embriyolar büyük miktarlarda kolayca toplanabilir ve ayrıca çoğu gen (>% 88) embriyogenesis boyunca eksprese edilir, bu nedenle alakalı algılama için zengin bir in vivo ortam sağlar ÜFE 3 .
Geleneksel olarak, sineklerdeki biyokimyasal çalışmalar, işlevsel transkripsiyonel lizatları 4 , 5'in saflaştırılması için gerekli olanlar gibi çok büyük ölçekli embriyo koleksiyonlarını (100-150 g) kullandı. Drosophila'daki önceki AP-MS çalışmalarında tandem afinite saflaştırması (TAP) gibi iki aşamalı bir saflaştırma yaklaşımına dayanan ve her adımda ilişkili malzeme kaybıyla 6 büyük miktarda embriyoya ihtiyaç duyulmuştur (5-10 g). Geniş amounBaşlangıçtaki materyalin ts'ı, (ticari olarak satın alındığında) hem pahalı, hem de 7 , 8 , 9'un bakım ve temizlenmesi için zaman alıcı olan büyük popülasyon kafeslerinde embriyo koleksiyonlarının kurulmasını gerektiriyordu.
Tek aşamalı afiniteli saflaştırma yaklaşımlarının geliştirilmesindeki son gelişmelerin yanı sıra, kütle spektrometrelerinin artan duyarlılığı, gerekli miktardaki başlangıç maddesini büyüklük sırasıyla azaltmıştır. Streptavidin-bağlayıcı peptit (SBP) veya yeşil floresan protein (GFP) gibi etiketleri kullanarak ve 1 g'dan daha az embriyondan başlayarak, yem proteininin miktarlarını ve tanımlama için yeterli olacak şekilde etkileşen bileşenleri izole etmek mümkündür. Kütle spektrometresi 10 , 11 .
Burada sunulan protokolün amacı, araştırmacılara aşırı derecede yardımcı olmaktır.Bana in vivo PPI'ların biyokimyasal analizine algılanan bir engel. Bu amaçla, orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarını toplamak için basit ve ucuz bir prosedürü takiben AP-MS veya başka yaklaşımlarla daha sonraki analizler için uygun tam hücre proteini özütlerinin bir aşamalı hazırlanması izlenmektedir . Metodumuz, herhangi bir laboratuvar tarafından kolayca üretilebilen, özel olarak hazırlanmış 1-L veya 5-L popülasyon kafeslerinin kullanımına dayanır. Ayrıca burada sunulan ekstraksiyon koşulları hem kültürlenmiş hücreler hem de in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17'de yapılan birçok çalışmada doğrulanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 5 L Fly Kafes Hazırlığı (15 cm Tabaklara Sığdırmak İçin)
- Gerekli malzemeleri elde edin: 5-quart (4.7-L) kapaklı kap ( Şekil 1A ), naylon örgü ve traş bıçağı.
- 12 cm çapında bir daire işaretleyin ve tıraş bıçağı kullanarak kabın altındaki bir deliği kesin ( Şekil 1B ). Kapakta 15 cm çapında bir delik açın ( Şekil 1C ).
- Naylon ağları 25 x 25 cm karelere kesin.
- Örgüyü kabın üst kenarına yerleştirin ve kapakla aşağı bastırın ( Şekil 1C ). Örgü sıkı olduğundan ve kapağın eğik olmadığından emin olun. Kafes sineklerle doldurulmaya hazırdır (5.3. Adıma bakınız).
2. 1 L Sinekli Kafesin Hazırlanması (10 cm Tabaklara Sığdırmak İçin)
- Gerekli malzemeleri elde edin: Elektrikli bir matkap, 76 mm (3 inç) bir kesici alet ( Şekil 1E ve FŞekil 1F), düz kenarlı 1 L kapaklı bir plastik kavanoz, naylon örgü, traş makinesi bıçağı, zımpara kağıdı, gözlük ve iş eldivenleri.
- Alttaki 3 inç (76 mm) delik ve plastik kavanozun kapağını ( Şekil 1G ) kesin ve delik açarken kapağı sıkıca vidalanarak kullanın. Bir delik açmaya başladığınızda kesme aletini çemberin ortasına yerleştirin.
Dikkat: Bu adım esnasında gözlerin korunması ve eldiven kullanın. - Deliklerin kenarlarını tıraş bıçağı ve zımpara kağıdı ile pürüzsüzleştirin.
- Naylon ağları 18 x 18 cm karelere kesin.
- Örgüyü kavanozun üst kenarı üzerine yerleştirin ve kapağı vidalayarak sıkın ( Şekil 1G ). Örgü sıkı olduğundan ve kapağın eğik olmadığından emin olun. Kafes sineklerle doldurulmaya hazırdır (5.3. Adıma bakınız).
3. Elma Suyu (AJ) Tabaklarının Hazırlanması
- 2 L'lik bir şişeye 19 g agar ve 1 L 18.2 MΩ · cm su ekleyin.Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve kısaca karıştırın.
- Otoklavda 30 dakika süreyle. Bu arada,% 100 elma suyu konsantresini dondurulmuş stoktan özün ve etanolde 10 mL% 10 (ağırlık / hacim) metil 4-hidroksibenzoat çözeltisi hazırlayın.
- Otoklavdan sonra agarı bir karıştırma plakasında karıştırmaya başlayın ve 80 mL% 100 elma suyu konsantresi ve 10 mL% 10 (ağırlık / hacim) metil 4-hidroksibenzoat çözeltisini şişeye ekleyin. Sabit karıştırma ile oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
- Her çanakta bulunan agar seviyesinin yaklaşık 5 mm kalınlığında olması için 15 cm petri kaplarını (5 L kafesler için) veya 10 cm petri kaplarını (1 L kafesler için) boşaltın. Oda sıcaklığında katılaşmaya ve plastik torbalara sarılmaya bırakın. AJ plakaları 4 ° C'de iki hafta saklanabilir.
Not: Petri tabakları yıkanabilir ve tekrar kullanılabilir. - Islak maya yapıştırın hazırlayın: Kolayca karıştırılmasını sağlayacak bir kapaklı, 100 mL'lik bir kap içine bir miktar aktif kuru maya dökün ve karıştırırken az miktarda su ilave edin, ancak kalın ama iyice karıştırılmışyapıştırmak. 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
4. Liziz Reaktiflerinin Hazırlanması
- 5x liziz tamponu hazırlayın: 250 mM Tris pH 7.5,% 25 gliserol,% 1 oktilfenoksi poli (etilenoksi) etanol (IGEPAL CA-630), 7.5 mM MgCl2, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na3V04.
- 200 mL yapmak için: 1 mL NaF tozu ve 184 mg Na3VO4 tozu sürekli olarak karıştırılarak 71 mL suda tamamen çözünür. 50 mL 1 M Tris pH 7.5, 2 mL% 100 IGEPAL, 1.5 mL 1 M MgCI2 ve 25 mL 5 M NaCl ilave edin. Daha sonra 50 mL gliserol ilave edin (son ekleyin) ve 1 saat karıştırmaya devam edin.
- Filtre-250 mL'lik filtre üniteleri kullanarak sterilize edin. Bu adım yavaş olabilir, ancak çözeltinin filtrelenmesi çözülmeyen parçacıkların giderilmesi için önemlidir. 50 mL'lik tüpler içinde 10 mL'ye bölün ve -80 ° C'de saklayın.
- Su içinde 1 M dithiothreitol (DTT) çözeltisi hazırlayın. -20 ° C'de 1 mL'lik alikotlarda saklayın.
- Proteini elde etAse inhibitörü kokteyl tabletleri, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile. 4 ° C'de saklayın.
- 10 mL şırınga ve şırınga filtreleri alın: 26 mm çapında yüzey aktif madde içermeyen selüloz asetat (SFCA) membran, 0.45 μm gözenek boyutu.
5. Sinek Embriyolarının Toplanması
- Şişelerde ilginç protein etiketini taşıyan transgenik sinek çizgilerini (şişe başına yaklaşık 100 sinek) genişletin ve her bir sinek hattı için 25-30 şişe birikene kadar her 2 günde bir şişeleri aktarın. Kontrol stokunu ( örneğin , yw hattı) benzer şekilde genişletin .
- Sıcak AJ levhalarını oda sıcaklığına getirir (yaklaşık 1-2 saat boyunca gece boyunca yapılabilir). Eldivenli bir parmak kullanarak AJ plakalarının ortasına biraz ıslak maya yapıştırın. 15 cm'lik bir plaka için 6 cm'lik daire ve 10 cm'lik bir plaka için 4 cm'lik bir daire.
- Standart bir Drosophila aşamasını kullanarak karbondioksit akışı ile sinekleri anestezi edin veKafesler (5 L kafes başına yaklaşık 15 yetişkin şişesi, 1 L kafese 5 şişe).
- Adım 5.2'den hazırlanmış AJ plakaları ile kafes altını örtün ve iki şerit şerit kullanarak AJ plakasını kafese bantlayın ( Şekil 1D ve 1H ). Plakları değiştirirken kolay soyulması için plakanın üzerinden geçen bandın uçlarını katlamak yararlı olacaktır.
- Sinekler anesteziden kurtulduktan sonra, kafesleri tabaklarla altta tutun ve üst sıraya yerleştirin.
Not: Sinekler tam olarak iyileşinceye kadar beklemek önemlidir, aksi takdirde AJ plakasına ve maya yapıştırmasına yapışacaklardır. - Deneyin sonunda, kafesi temizleme için hazırlamak için, birkaç saat boyunca kafesi dondurucuya yerleştirin. Örgüyü birkaç saat suya batırmak temizlemeyi kolaylaştıracaktır.
- Kafeleri 2-3 gün oda sıcaklığında sineklerle inkübe edin ve AJ plakalarını günde iki kez değiştirin. Tabakları değiştirmek için kafesi ters çevirin,Bandı plakadan soyup kafese tutun, kafesin tezgahın üzerine yavaşça dokunduğunuzda ve yeni plakayı hızlıca değiştirerek sineklerin kaçmasına izin vermeyin.
Not: Sineklerin kafese göre ayarlanması gerekir ve 3. günden başlayarak en iyisi kalır. Yaklaşık 4-5 gün boyunca zirveye çıkmaya devam edeceklerdir. Üst döşeme kapasitesinde iki 5 L kafes, bir gecelik koleksiyonda 1 g embriyo üretebilir. Daha küçük ölçekli deneyler için 1 L kafes kullanın. - Sineklerin taze AJ plakalarına bir gece embriyo yerleştirmesine izin verin (yaklaşık 16 saat) veya istenilen herhangi bir süre bekleyin.
- Ertesi sabah, kullanılan her bir sinek çizgisine bir tane olmak üzere, hasır kaplarını embriyo toplama için işaretleyin ve tartın.
- Bölüm 4'teki reaktifleri kullanarak 1x lizis tamponu hazırlayın (Not: kullanıma hazır 1x lizis tamponu ekstraksiyondan hemen önce hazırlanmalıdır): 10 mL 5x konsantre lizis tamponuna 40 mL su ekleyin (-80 ° C'de saklanır) 50 mL tüp içinde.
- 50 uL 1 MD ekleyinTT'yi son konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde iyice karıştırın ve her biri 25 mL olmak üzere iki 50 mL tübe bölün. Tüplerden birine bir proteaz inhibitörü tablet ekleyin ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de döndürün. Tablet çözünürken, toplar ve dechorionate embriyolar (5.8 - 6.6 arası adımlar). Tabletin tamamen çözülmüş olduğundan emin olmak için kontrol edin ve tamponu buzda tutun.
Not: DTT içeren 1x tamponun ikinci tüpü -80 ° C'de saklanabilir ve bir sonraki deneyden önce tabletin eklenmesi gerekecektir. 25 mL lik eritme tamponu, protein saflaştırma aşamaları boyunca müteakip yıkamalar dikkate alınarak, 2 numuneye kadar kadar yeterlidir.
- 50 uL 1 MD ekleyinTT'yi son konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde iyice karıştırın ve her biri 25 mL olmak üzere iki 50 mL tübe bölün. Tüplerden birine bir proteaz inhibitörü tablet ekleyin ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de döndürün. Tablet çözünürken, toplar ve dechorionate embriyolar (5.8 - 6.6 arası adımlar). Tabletin tamamen çözülmüş olduğundan emin olmak için kontrol edin ve tamponu buzda tutun.
- Kullanılan sinek çizgilerinin genotipleri ile AJ plakalarını kafeslere işaretleyin ve plakaları yenileri için değiştirin.
Not: Aşırı maya macunu bu aşamada plakadan kazınabilir. Embriyolar plakalar üzerinde 25 ° C'de veya oda sıcaklığında yaşlandırılarak istenilen gelişimsel zaman penceresi elde edilebilir. - Yeterli su ekleyin tO her AJ plakasını örtün. Embriyoları yumuşak bir boya fırçasıyla plakadan yavaşça çıkarın (yaklaşık 10 mm genişliğinde düz kafa geniş plakalar için iyi iş görür). Embriyoları daha önce tartılmış ve işaretlenmiş ağ konteynırına boşaltın ve fazla su boşaltın.
- Gerekirse, tüm embriyoları çıkarmak için ikinci bir durulama ve plakanın fırçalanması gerçekleştirin. Aynı sinek çizgisi için ek plak (lar) daki embriyoları aynı ağ konteyneri içine birleştirin.
- Fazla suyunu çıkarmak için ağdaki kağıt havluları kısaca lekeleyin.
6. Embriyo Deşarjı
- % 50 çamaşır suyu (hacimce hacim / su çözeltisi) ile 6 cm'lik bir Petri kabına yarım dolgu doldurun.
Not: Malzemelerin ve Reaktiflerin Tablosunda çamaşır suyu markası ile ilgili önemli açıklamaya bakın.
Dikkat: Eldiven takın ve giysilere ağartma önleyin. - Su ile 2 büyük Petri kabı hazırlayın.
- Örgü kabını embriyolarla 90 s boyunca% 50 ağartma maddesine daldırın. İnkübasyon sırasında hafifçe dokununÇamaşır suyu çözeltisindeki embriyoları askıya almak için birkaç kez karıştırın.
- 90 saniyelik kuluçka işleminin sonunda, 2 yemek tabağının her birinde bulunan ağ gözü su ile yaklaşık 10 saniye yıkanır.
- Kabuk kutusunu, 18.2 MΩ · cm su ile püskürtme şişesini kullanarak iyice yıkayın. Ayrıca, gözlü kabın kenarlarını ve dışını yıkayın.
Not: Yıkamadan sonra ağartma kokusu algılanmamalıdır. - Örgü kabını kağıt havlular üzerine lekeleyin. Örgü kabını embriyolarla tartın ve adım 5.6'da elde edilen boş kabın ağırlığını çıkarın. Oluşan embriyoların ağırlığını kaydedin. Amacıyla hedeflenecek embriyoların miktarı 0.5 - 1 g arasındadır.
7. Embriyo özütünün hazırlanması
- Proteaz inhibitörleri (adım 5.7'den) ile birlikte 1 mL liziz tamponunu bir buzağı camı homojenleştiricisine ilave edin ve buz üzerinde saklayın. Embriyoları mesh kabından homojenleştiriciye aktarın.
Not: Embriyolar düz uçla alınabilirFa metal spatula veya fırça ile doğrudan tampona aktarılır. Bu bölümdeki buz üzerindeki tüm adımları uygulayın. - Geriye kalan 1 ml'lik liziz tamponu ile mesh üzerindeki kalan embriyoları yıkayın ve homojenizatördeki maddeye ekleyin. Embriyoların homojenleştiricinin tabanına oturmasına ve süpernatanın dikkatlice aspiremesine izin verin.
- Proteaz inhibitörleri (adım 5.7'den) ile liziz tamponunu, homojenleştiriciye ekleyin, embriyoların her gramı için 5-6 mL liziz tamponunu hedefleyin.
- Embriyoları gevşek bir fitil ile 4-6 vuruşla homojenize edin.
Not: İlk vuruş sırasında daha fazla direnç olacaktır. Çözeltinin sıçramasını önlemek için havanızı sürekli hareket ettirin. - Embriyoları sıkı bir şekilde uygun bir havyar ile 8-10 vuruşla homojenize edin.
- Homojenatı buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
- Homojenat mikrosantrifüj tüplerine aktarılır ve en yüksek hızda 15 dakika 4 ° C'de santrifüj edilir (yaklaşık 13.000 xg).
- AvoidiPeletler ve çok üst lipid katmanı, süpernatantları taze mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve en üst devirde 15 dakika 4 ° C'de santrifüjleyin (yaklaşık 13.000 xg).
- Dikkatle süpernatantları 1 mL ucu ile aspire edin ve 0.45 μm filtreler eklenmiş soğutulmuş 10 mL şırıngalaya yükleyin (aynı numuneyi alikotları bir şırınga içine birleştirin). Çözeltiyi, buz üzerinde etiketli 15 mL'lik bir tüpe koyun. Özüt, müteakip protein saflaştırma deneyleri için hemen kullanılabilir veya sıvı nitrojende derhal dondurulur ve ileride kullanılmak üzere -80 ° C'de tutulur.
Not: Embriyoların çözülmesi sırasında proteazlar aktive edilebilir ve protein bozulmasına neden olabilir, çünkü embriyolar yerine özleri dondurmak daha iyidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir protein kompleksi saflaştırma deneyinde bu protokolün kullanılmasını göstermek için, kontrol altında EGFP etiketli Drosophila hücre dışı sinyal regüle kinazı (ERK, haddelenmiş gen tarafından kodlanmış) ifade eden homozigot canlı bir sinek çizgisi arm-EGFP-ERK ürettik. Her yerde eksprese edilen armadillo ( kol ) promotörü 18 , 19'dur . Kol promotörü , Drosophila embriyogenezi 19'un çoğu aşamasında etkindir. Lizatlar tarif edilen protokol kullanılarak hazırlandı ve kol-EGFP-ERK transgeninden protein ekspresyonu, 42 kDa ve 69 kDa'da göç eden endojen ve transjenik EGFP-ERK seviyelerini aynı anda saptamak için toplam ERK proteini için western blotlama ile teyit edildi , Sırasıyla ( Şekil 2A ). Etiketsiz endojen ER'ye karşılık gelen tek bir bant Yw kontrol hattında K (42 kDa) tespit edildi. Bu sonuç, embriyoldan ERK ve EGFP-ERK'nin başarılı bir şekilde alındığını doğrulamaktadır.
Ekstraksiyon protokolümüzün, etiketlenmiş bir proteinin daha sonraki saflaştırılması için uygun olup olmadığını test etmek için, yw ve kol-EGFP-ERK sinüslerinden elde edilen ekstraktlar, belirlenmiş protokoller 10 , 11'i takiben GFP agaroz boncuklar kullanılarak afinite saflaştırmasına tabi tutuldu. Bir degrade SDS-PAGE üzerinde çalışan örneklerin gümüş renginde boyama, yem proteini EGFP-ERK'nin başarılı bir şekilde saflaştırılmasını gösterdi ( Şekil 2B ). Deney şeridi, EGFP-ERK'nin kendisinin yanı sıra kontrol yw örneğinde gözlenmeyen ek bantlar içermektedir ve bu da saflaştırma prosedürünün potansiyel ERK etkileşen proteinleri geri kazandığını düşündürmektedir.
"Src =" / files / ftp_upload / 55804 / 55804fig1.jpg "/>
Şekil 1 : Nüfus kafeslerinin hazırlanması. ( A - D ) Plastik kaptan yapılmış 5 L'lik bir kafes. ( A ) Başlangıç kabı. ( B ) 5 L kafesin alttan görüntüsü. ( C ) Örgü takılı 5 L kafesin üst görünüşü. ( D ) 15 cm elma suyu plakası, alttan görünümlü 5 L'lik kafes monte edilmiştir. ( E ve F) 1 L'lik kapta delik delmek için kullanılan 3 inç (76 mm) matkap ucu. ( G , H ) 1 L kafes. ( G ) Örgü takılı 1 L kafesin üst görünümü. ( H ) 10 cm'lik elma suyu plakası takılı, alttan görünüşte 1 L'lik kafes monte edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol Drosophila popülasyon kafeslerini orta ölçekte kurmak ve embriyolardan tam hücreli protein ekstraktı yapmak için basit ve genel bir prosedürdür. Elde edilen ekstraktlar, afinite reçineleri üzerindeki protein komplekslerinin saflaştırılması gibi çeşitli aşağı akım uygulamaları içinde kullanılabilir. Buz üzerinde ekstraksiyon aşamalarını gerçekleştirmek ve protein bozunumunu en aza indirmek için güçlü proteaz inhibisyonu kullanmak kritik önem taşır. Tarif edildiği gibi, protokol çoğu sitoplazmik ve bazı membran ve çözünür nükleer proteinlerin 6 , 10 , 12 , 15 izolasyonu için uygundur. Yüksek tuz ekstraksiyonu 5 kullanarak daha az çözünen nükleer proteinlerin izolasyonu gibi diğer bölmelerdeki proteinlerin daha odaklı bir şekilde saflaştırılması için kolayca adapte edilebilir. Adım 5.8'de belirtildiği gibi, toplama zamanları ve embriyo yaşlanma periyotlarıFarklı gelişim evreleri elde etmek için kesin aralıklarla kurulmuşlardır.
Anti-toplam ERK antikoru kullanarak gösterdiğimiz gibi ( Şekil 2A ), etiketli proteinin endojen ifade seviyelerini yakından eşleyen seviyelerde eksprese edildiğini tespit etmek arzu edilir. Endojen protein karşı antikor mevcut değilse, yapıların işlevselliği, örneğin genetik kurtarma deneyinde başka tahliller ile teyit edilebilir. Bununla birlikte, çoğu durumda, etiketlenmiş proteinin hafifçe aşın ifadesi anlamlı protein komplekslerinin izolasyonuna neden olmalı ve aslında "zor" proteinlerin ekstraksiyonunu ve saflaştırılmasını kolaylaştırabilir.
Bu protokolün en büyük avantajı basitliği ve bütün prosedürü makul maliyetle kurma imkânı. Daha küçük kafeslerin kullanılmasının ek bir avantajı, çoklu transgenik hatların ayarlanabilmesi ve paralel olarak analiz edilebilmesidirL, daha büyük kafes kullanıldığında uygulanabilir olmayabilir. Burada tarif ettiğimiz sinek kafesleri, kolayca temizlenebilir ve yıllarca tekrar kullanılabilir. Nalgene kavanozlarından açıklandığı gibi 1-L kafes yapmak yerine, 5-L konteynırın daha küçük bir versiyonu gibi mevcut diğer konteynırları kullanmak mümkündür.
Çeşitli sinyal proteinleri ve ilgili bileşenleri içeren kompleksleri saflaştırmak için kütle spektrometrisi 6 , 10 , 15'e göre izleyen bu protokolü (veya küçük değişikliklerle varyasyonlarını) başarıyla kullandık. Bu yaklaşımlar, fonksiyonel çalışmalar 10,15'te daha da doğrulanmış yeni ÜFE'lerin tanımlanmasına yol açmıştır. Burada sunulan protokolün çeşitlemeleri Drosophila embriyogenezi 20'deki fosfooproteomu analiz etmek ve manzara incelemek için daha önce kullanılmıştırSinirsel gelişimde ubikitasyonun 21 , 22 . Dolayısıyla bu prosedür, PPI'ları in vivo olarak analiz etmek için uygun bir ağ geçidi temsil eder ve diğer proteomik uygulamalar için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Veressa laboratuvarının üyelerine, el yazması üzerine faydalı yorumlar ve protokol iyileştirmeleri için öneriler yaptıkları için teşekkür ederler. AV, NIH hibeleri GM105813 ve NS096402 tarafından desteklendi. LY, Massachusetts Üniversitesi Boston Sanofi Genzyme Doktora Bursu tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
References
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
