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Developmental Biology

मध्यम स्तर की तैयारी Published: May 30, 2017 doi: 10.3791/55804
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Biology Department, University of Massachusetts Boston, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मध्यम पैमाने (0.5-1 ग्राम) पर ड्रोसोफिला भ्रूण इकट्ठा करने के लिए एक सीधा और सस्ती दृष्टिकोण प्रदान करना है और प्रोटीन अर्क तैयार करना है जो प्रथितिक प्रोटिओमिक अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे एफ़िनिटी शुद्धि-जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी-एमएस) )।

Abstract

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) का विश्लेषण जैविक प्रक्रियाओं और तंत्रों, जैसे कि सेल सिग्नलिंग, जीव विकास और रोग का अध्ययन करने के लिए एक अपरिहार्य दृष्टिकोण बन गया है। इंटरैक्शन नेटवर्क के सबसे स्वाभाविक और निष्पक्ष दृश्य प्राप्त करने के लिए, विवो सामग्री में उपयोग करके पीपीआई जानकारी प्राप्त करना अक्सर वांछनीय होता है। फल फ्लाय ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर विवो में पीपीआई का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच है, और जैव रासायनिक प्रयोगों के लिए सामग्री को अलग करने के लिए सीधा दृष्टिकोण के लिए खुद को उधार देता है। विशेष रूप से, फल मक्खी भ्रूण पीपीआई का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक प्रकार के ऊतक का प्रतिनिधित्व करते हैं, इस विकास के चरण में जानवरों को इकट्ठा करने में आसानी के कारण और तथ्य यह है कि प्रोटीन बहुसंख्यक भ्रूणजनन में व्यक्त किए जाते हैं, इस तरह से ज्यादातर पीपीआई प्रकट करने के लिए एक उपयुक्त वातावरण प्रदान करते हैं। यहां हम मध्यम पैमाने (0.5-1 ग्रा) पर ड्रोसोफिला भ्रूण के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं , जो कि एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक आदर्श राशि हैप्रोटिएमिक अनुप्रयोगों, जिसमें एपीनेट शुद्धि-जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी-एमएस) द्वारा पीपीआई के विश्लेषण शामिल हैं। हम भ्रूण संग्रहों के लिए 1 एल और 5 एल पिंजरों के लिए हमारे डिजाइन का वर्णन करते हैं जो कि किसी भी प्रयोगशाला में आसानी से और सस्ते में स्थापित हो सकते हैं। हम भ्रूण संग्रह और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं जो सीधे एलिसेट उत्पन्न करते हैं जिन्हें सीधे एपी-एमएस जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है हमारा लक्ष्य सभी शोधकर्ताओं को विवो में पीपीआई के विश्लेषण के लिए एक सुलभ माध्यम प्रदान करना है

Introduction

आनुवांशिक स्क्रीन और, हाल ही में, जीनोमिक दृष्टिकोण ने जैविक कार्यों के अध्ययन में क्रांतिकारित किया है। हालांकि, महत्वपूर्ण सेलुलर जानकारी प्रोटीन में एन्कोड की गई है और इंटरैक्टिंग पार्टनर्स के उनके टुकड़े हैं। जबकि परंपरागत आनुवंशिक संशोधक स्क्रीन दर-सीमित मार्ग घटकों की पहचान कर सकते हैं और अप्रत्यक्ष संपर्क पुनः प्राप्त कर सकते हैं, प्रोटिओमिक दृष्टिकोण की ताकत उनकी ब्याज की प्रोटीन के तत्काल संपर्क नेटवर्क की पहचान करने की क्षमता में निहित है। इस प्रकार प्रोटीओमिक्स जैविक प्रणाली का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान ओर्थोगोनल विधि है, और जीनोमिक्स, ट्रांसस्क्रिप्टमिक्स और पारंपरिक आनुवंशिक स्क्रीनों को पूरा करता है। एफ़िनिटी शुद्धि-जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी-एमएस) कोशिकाओं और ऊतकों 1 , 2 में अपने मूल परिवेश में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण साबित हुई है। यह विधि विशिष्ट विकास पर प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष बातचीत की पहचान के लिए अनुमति देता हैअल चरण या ऊतक संदर्भ, और कई तरह के विकासात्मक रास्ते (संदर्भ 1 में समीक्षा किए गए) में कई उपन्यास पीपीआई की पहचान करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। पीपीआई अध्ययनों की निर्विवाद सफलता के बावजूद, उनमें से ज्यादातर सुसंस्कृत कोशिकाओं में किए गए हैं, जिसमें ब्याज की "चारा" प्रोटीन अति व्यस्त थे। सेल संस्कृति में पीपीआई का अध्ययन करने के साथ दो मुद्दे हैं: सबसे पहले, एक विशिष्ट सेल लाइन कुछ प्रोटीनों की अभिव्यक्ति की कमी के कारण पूर्ण रूप से बातचीत नहीं कर सकती है। दूसरा, उच्च विषमता आमतौर पर इस तरह के विश्लेषण में कार्यरत है, जैसे कि प्रोटीन मैसफल्डिंग या झूठी सकारात्मक बातचीत की पहचान के रूप में कलाकृतियां हो सकती हैं।

इन दोनों सीमाओं को विवो में पीपीआई के विश्लेषण के द्वारा दूर किया जा सकता है। ऐसे प्रयोगों में एक सीमित कदम प्रोटीन परिसरों को शुद्ध करने के लिए प्रारंभिक सामग्री की उपलब्धता है। ड्रोसोफिला मेलेनोगस्टर लंबे समय से कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया हैSis, और हाल ही में यह vivo में पीपीआई का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली भी दिखाया गया है। ड्रोसोफिला भ्रूणजनन पीपीआई का अध्ययन करने के लिए एक विशेष रूप से आकर्षक ऊतक प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि भ्रूण को आसानी से बड़ी मात्रा में एकत्रित किया जा सकता है, और यह भी क्योंकि भ्रूणजनन के दौरान अधिकतर जीन (> 88%) व्यक्त की जाती हैं, इस प्रकार इस प्रकार विवो वातावरण में एक अमीर प्रदान करने के लिए संबंधित पीपीआई 3

परंपरागत रूप से, मक्खियों में जैव रासायनिक अध्ययन ने बहुत बड़े पैमाने पर भ्रूण संग्रह (100-150 ग्राम) का उपयोग किया था, जैसे कार्यात्मक ट्रांसक्रिप्शनल lysates 4 , 5 शुद्ध करने के लिए आवश्यक। ड्रोसोफिला में पिछला एपी-एमएस पढ़ाई के लिए बड़ी मात्रा में भ्रूण (5-10 ग्राम) की आवश्यकता थी, क्योंकि वे प्रत्येक चरण 6 पर सामग्रियों के संबद्ध नुकसान के साथ दो-चरणीय शुद्धिकरण दृष्टिकोण जैसे कि अग्रानुक्रमिक शुद्धीकरण (टीएपी) पर भरोसा करते थे। बड़े amounबड़ी आबादी पिंजरों में भ्रूण संग्रह स्थापित करने के लिए आवश्यक सामग्री शुरू करने के लिए, जो दोनों महंगा हो सकता है (जब वाणिज्यिक खरीदा जाता है) और 7 , 8 , 9 को बनाए रखने और साफ करने के लिए समय-उपभोक्ता।

सिंगल-चरण एफ़िनिटी शुद्धि दृष्टिकोण के विकास में हालिया प्रगति, साथ ही साथ मास स्पेक्ट्रोमीटर की बढ़ती संवेदनशीलता ने परिमाण के आदेश द्वारा सामग्री शुरू करने की आवश्यक मात्रा में कमी की है। स्ट्रेप्टिविडिन बाध्यकारी पेप्टाइड (एसबीपी) या हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) जैसे टैग्स का इस्तेमाल करते हुए और 1 ग्राम भ्रूण के कम से शुरू करने से, बैट प्रोटीन और इंटरेक्टिंग घटकों की मात्रा को अलग करना संभव है जो पहचान के लिए पर्याप्त होगा जन स्पेक्ट्रोमेट्री 10 , 11

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लक्ष्य शोधकर्ताओं को ओवरको में मदद करना हैमुझे विवो में पीपीआई के जैवरासायनिक विश्लेषण के लिए एक कथित बाधा है इसके लिए, हम मध्यम पैमाने पर (0.5-1 ग्रा) ड्रोसोफिला भ्रूण इकट्ठा करने के लिए एक सरल और सस्ती प्रक्रिया प्रदान करते हैं, इसके बाद एक-चरण की तैयारी पूरे सेल प्रोटीन अर्क की है जो एपी-एमएस या अन्य तरीकों के बाद के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं । हमारी पद्धति कस्टम-निर्मित 1-एल या 5-एल आबादी के पिंजरों के उपयोग पर निर्भर करती है जो कि किसी भी प्रयोगशाला द्वारा आसानी से तैयार की जा सकती है। इसके अलावा, यहां प्रस्तुत निकासी स्थितियों को कई अध्ययनों में सत्यापित किया गया है, दोनों सुसंस्कृत कोशिकाओं में और 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 में विवो में ।

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Protocol

1. 5 एल मक्खी पिंजरों की तैयारी (15 सेमी प्लेट्स फ़िट करने के लिए)

  1. आवश्यक सामग्री प्राप्त करें: ढक्कन के साथ 5-चौथाई (4.7-एल) कंटेनर ( चित्रा 1 ए ), नायलॉन जाल, और एक रेजर ब्लेड।
  2. 12 सेंटीमीटर व्यास वाले चक्र को चिह्नित करें और रेज़र ब्लेड ( चित्रा 1 बी ) का उपयोग करके कंटेनर के नीचे एक छेद काट लें। ढक्कन में एक 15 सेमी व्यास का छेद कट ( चित्रा -1 सी )।
  3. 25 x 25 सेमी वर्गों में नायलॉन जाल कट करें।
  4. कंटेनर के शीर्ष रिम पर जाल रखें और ढक्कन के साथ नीचे दबाएं ( चित्रा -1 सी )। सुनिश्चित करें कि मेष तंग है और ढक्कन झुका हुआ नहीं है पिंजरे मक्खियों के साथ आबाद होने के लिए तैयार है (कदम 5.3 देखें)।

2. 1 एल मक्खी पिंजरों की तैयारी (10 सेमी प्लेट्स फिट करने के लिए)

  1. आवश्यक सामग्री प्राप्त करें: एक बिजली ड्रिल, एक 3 इंच (76 मिमी) काटने के उपकरण ( चित्रा 1 ई और एफIigure 1F), ढक्कन, नायलॉन जाल, एक रेजर ब्लेड, सैंडपेपर, चश्मे, और काम दस्ताने के साथ एक सीधे तरफा 1 एल प्लास्टिक जार।
  2. ड्रिलिंग के दौरान कटे हुए कंटेनर पर ढककर ढक्कन के साथ नीचे 3 इंच (76 मिमी) के छेद और प्लास्टिक की जार ( चित्रा 1 जी ) के ढक्कन काट लें। एक छेद करने के लिए शुरू करते समय सर्कल के केंद्र में काटने के उपकरण की स्थिति।
    सावधानी: इस चरण के दौरान आँख संरक्षण और काम के दस्ताने पहनें
  3. एक रेजर ब्लेड और सैंडपेपर के साथ छेद के किनारों को सुखा लें।
  4. नायलॉन जाल को 18 x 18 सेमी वर्ग में कट करें।
  5. जार के शीर्ष रिम पर जाल रखें और ढक्कन को स्किइंग करके ( चित्रा 1 जी ) कस लें। सुनिश्चित करें कि मेष तंग है और ढक्कन झुका हुआ नहीं है पिंजरे मक्खियों के साथ आबाद होने के लिए तैयार है (कदम 5.3 देखें)।

3. ऐप्पल जूस (ए जे) प्लेट्स की तैयारी

  1. 1 9 ग्राम अदर और 1 एल 18.2 एमएम · सेंटीमीटर पानी को 2 एल फ्लास्क में जोड़ें।एक हलचल बार जोड़ें, और संक्षेप में मिश्रण करें
  2. आटोक्लेव 30 मिनट के लिए इस बीच, जमे हुए स्टॉक से 100% सेब का रस ध्यान केंद्रित करता है, और इथेनॉल में 10% (वजन / मात्रा) मिथाइल 4-हाइड्रोक्सीबेंजोएट समाधान के 10 एमएल तैयार करता है।
  3. आटोक्लेविंग के बाद, एक हलचल प्लेट पर अगर का मिश्रण करना शुरू करें, और फ्लास्क के लिए 100 एमएल का सेब रस का ध्यान केंद्रित करें और 10 एमएल (वजन / मात्रा) मिथाइल 4-हाइड्रोक्सीबेंजोएट समाधान जोड़ें। लगातार मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर शांत रहें।
  4. पेटी डिश (5 एल पिंजरों के लिए) या 10 सेमी पेट्री डिश (1 एल पिंजरों के लिए) डालो ताकि प्रत्येक डिश में अगर का स्तर लगभग 5 मिमी मोटी हो। कमरे के तापमान पर जमने की अनुमति दें, और प्लास्टिक के थैलियों में लपेटें। एजे प्लेटें दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की जा सकती हैं।
    नोट: पेट्री डिश धोया जा सकता है और फिर से उपयोग किया जा सकता है।
  5. गीले खमीर पेस्ट तैयार करें: एक ढक्कन के साथ एक 100 एमएल कंटेनर में कुछ सक्रिय सूखी खमीर डालना, जो आसान मिश्रण की अनुमति दे, और थोड़ी मात्रा में पानी जोड़ने के दौरान सरगर्मी, एक मोटी लेकिन पूरी तरह मिश्रितपेस्ट करें। 4 डिग्री सेल्सियस तक 2 सप्ताह तक स्टोर करें

4. लैसिस अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 5x lysis बफर तैयार करें: 250 मिमी ट्राइस पीएच 7.5, 25% ग्लिसरॉल, 1% ऑक्टाइलफेंको पॉली (एथिलीनैनी) एथेनॉल (आईजेईपीएल सीए -630), 7.5 मिमी एमजीसी 2 , 625 एमएम नाक्ल, 125 एमएम एनएफ़, 5 एमएम ना 3 वीओ 4 ।
    1. 200 एमएल बनाने के लिए: लगातार सरगर्मी के साथ 71 मिलीलीटर पानी में 1 ग्राम NaF पाउडर और 184 मिलीग्राम ना 3 वीओ 4 पाउडर भंग कर दें। 50 एमएल 1 एम ट्रिस पीएच 7.5, 2 एमएल 100% इएजीपीएएल, 1.5 एमएल 1 एम एमजीसीएल 2 और 25 एमएल 5 एम एनएएल जोड़ें। फिर 50 एमएल ग्लिसरॉल (आखिरी जोड़ें) जोड़ें और 1 घंटे के लिए सरगर्मी जारी रखें।
    2. 250-एमएल फिल्टर इकाइयों का उपयोग कर फिल्टर-बाँझ। यह कदम धीमा हो सकता है, लेकिन असुविधाजनक कणों को दूर करने के लिए समाधान फिल्टर करना महत्वपूर्ण है। 50 मिलीलीटर ट्यूबों में 10 एमएल के द्वारा विभाज्य और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. पानी में 1 एम डीथियोथरेइटोल (डीटीटी) समाधान तैयार करें। 1 एमएल अलिक्ट्स में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
  3. प्रोटी प्राप्त करेंएसे अवरोधक कॉकटेल गोलियां, एथिलएंडियमिनेटेट्रैसिसेटिक एसिड (ईडीटीए) के साथ। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
  4. 10 मिलीलीटर सीरिंज और सिरिंज फिल्टर प्राप्त करें: 26 मिमी व्यास, सर्फटैंट से मुक्त सेल्यूलोज एसीटेट (एसएफसीए) झिल्ली, 0.45 माइक्रोन के आकार का आकार।

5. मक्खी भ्रूण का संग्रह

  1. बोतल में टैग की गई प्रोटीन की बोतल (लगभग 100 मक्खियों प्रति बोतल) ले जाने वाली ट्रांसजेनिक फ़्लाई लाइनों को बढ़ाएं और हर 2 दिनों में बोतलें प्रत्येक फ़्लाई लाइन के लिए 25-30 बोतलें जमा हो जाएंगी। इसी तरह से नियंत्रण स्टॉक ( जैसे yw लाइन) को बढ़ाएं ।
  2. कमरे के तापमान पर गर्म ऐजे प्लेट्स (लगभग 1-2 घंटे, रात भर किया जा सकता है) एक चमकी हुई उंगली का प्रयोग करके, एजे प्लेट्स के केंद्र में कुछ गीली खमीर पेस्ट फैल गया, लगभग एक बनाने के लिए। एक 15 सेमी प्लेट के लिए 6 सेमी चौड़ाई और एक 10 सेमी प्लेट के लिए एक 4 सेमी सर्कल।
  3. एक मानक ड्रोसोफिला स्टेज सेटअप का उपयोग करके मक्खियों को कार्बन डाइऑक्साइड के प्रवाह के साथ एन्सेस्टेट करें , और में स्थानांतरित करेंपिंजरों (5 एल पिंजरे प्रति मक्खियों की लगभग 15 अच्छी तरह से बोतलें, 1 एल पिंजरे पर 5 बोतलें)।
    1. चरण 5.2 से तैयार ए जे प्लेट्स के साथ पिंजरे का तल कवर करें, और टेप के एजे प्लेट को टेप के दो स्ट्रिप्स ( आंकड़े 1 डी और 1 एच ) का उपयोग कर रखें। प्लेटों को बदलते समय आसान छीलने के लिए प्लेट पर जाने वाले टेप के सुझावों पर गुना करना उपयोगी होता है
    2. मस्तिष्क संज्ञाहरण से ठीक होने के बाद, पिंजरों को नीचे के प्लेटों के साथ रखें और शीर्ष पर जाल रखें।
      नोट: मक्खियों को पूरी तरह से ठीक होने तक इंतजार करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे अन्यथा एजे प्लेट और खमीर पेस्ट से छड़ी करेंगे।
    3. प्रयोग के अंत में, पिंजरे को सफाई के लिए तैयार करने के लिए, पिंजरे को फ्रीजर में कई घंटों के लिए रखें। कुछ घंटों के लिए पानी में मेष भिगोने से सफाई की सुविधा होगी
  4. 2-3 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर मक्खियों के साथ पिंजरों सेते हैं और दिन में दो बार ऐजे प्लेट्स बदलते हैं। प्लेटों को बदलने के लिए, पिंजरे को उल्टा कर दें,प्लेट से टेप को छील कर दें लेकिन पिंजरे को प्लेट रखें, पूरे पिंजरे को बेंच पर धीरे से टैप करें, और एक नए के लिए जल्दी से पुराने प्लेट को स्वैप करें, मक्खियों को बचने की कोशिश न करें।
    नोट: मक्खियों को पिंजरे में समायोजित करने की आवश्यकता है और दिन में सबसे अच्छा शुरू करना होगा। वे लगभग 4-5 दिनों के लिए पीक स्तर पर बिछाते रहेंगे। शीर्ष बिछाने की क्षमता में दो 5 एल पिंजरे रातोंरात संग्रह में 1 ग्राम भ्रूण पैदा कर सकते हैं। छोटे पैमाने के प्रयोगों के लिए 1 एल पिंजरों का उपयोग करें।
  5. मक्खियों को रात भर (लगभग 16 घंटे) ताजा एजे प्लेट्स पर भ्रूण रखने की अनुमति दें, या समय के किसी भी अन्य इच्छित लंबाई के लिए।
  6. अगली सुबह, भ्रूण संग्रह के लिए जाल कंटेनर का चिह्न और तौलना, प्रति प्रत्येक एक उड़ान लाइन का इस्तेमाल किया।
  7. 1x lysis बफर तैयार करें, धारा 4 से अभिकर्मकों का उपयोग करें (नोट: तैयार करने के लिए उपयोग 1x lysis बफर निष्कर्षण से पहले तैयार किया जाना है): 40 एमएल पानी को 10 एमएल 5x केंद्रित lysis बफर (-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) एक 50 एमएल ट्यूब में
    1. 1 एमडी के 50 μL जोड़ें1 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए टीटी, अच्छी तरह से मिलाएं और दो 50 एमएल ट्यूबों में विभाजित करें, प्रत्येक में 25 एमएल। एक ट्यूब के लिए, एक प्रोटीज अवरोधक टैबलेट जोड़ें और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं जबकि गोली भंग कर रहा है, इकट्ठा और भ्रूण भ्रूण (5.8 से 6.6 कदम)। सुनिश्चित करें कि टेबलेट पूरी तरह से भंग कर दिया गया है, और बफर को बर्फ पर रखें।
      नोट: डीटीटी के साथ 1x बफर की दूसरी ट्यूब -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की जा सकती है और अगली प्रयोग से पहले केवल टेबलेट के अतिरिक्त आवश्यकता होगी। प्रोटीन शुद्धि चरण के दौरान बाद में धोने के बाद खाते में 2 नमूनों के लिए 25 मिलीलीटर lysis बफर पर्याप्त होता है।
  8. मक्खी की लाइनों के जीनोटाइप के साथ पिंजरों पर ए जे प्लेट्स को चिह्नित करें, और ताजा लोगों के लिए प्लेटें स्वैप करें।
    नोट: अतिरिक्त खमीर पेस्ट को इस कदम पर प्लेट से हटाया जा सकता है। विकास समय की वांछित खिड़की प्राप्त करने के लिए भ्रूण 25 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर प्लेटों पर वृद्ध हो सकते हैं।
  9. पर्याप्त पानी टी जोड़ेंओ प्रत्येक ए जे प्लेट कवर नरम पेंट ब्रश (फ्लैट सिर लगभग 10 मिमी चौड़ी बड़े प्लेटों के लिए अच्छी तरह काम करता है) के साथ प्लेट से भ्रूण को हटा दें। पहले से तौला गया और चिह्नित जाल कंटेनर में भ्रूण डालो और अतिरिक्त पानी निकालें।
    1. यदि आवश्यक हो, तो सभी भ्रूण को हटाने के लिए प्लेट के एक दूसरे रिन्सिंग और ब्रशिंग करें। एक ही जाल कंटेनर में एक ही फ्लाई लाइन के लिए अतिरिक्त प्लेट (ओं) से भ्रूण को मिलाएं।
  10. अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए कागज तौलिये पर जाल को संक्षेप में हटा दें।

6. भ्रूण विकिरण

  1. 50% ब्लीच (पानी में वॉल्यूम / वॉल्यूम समाधान) के साथ 6 सेमी पेट्री डिश में अर्ध-भरें।
    नोट: सामग्रियों और अभिकर्मकों की तालिका में ब्लीच ब्रांड के बारे में महत्वपूर्ण टिप्पणी देखें
    सावधानी: दस्ताने पहनें और कपड़े पर ब्लीच होने से बचें।
  2. पानी के साथ 2 बड़े पेट्री डिश तैयार करें
  3. 90% के लिए 50% ब्लीच में भ्रूण के साथ जाल कंटेनर को विसर्जित करें Incu के दौरान मेष को धीरे से टैप करेंब्लीच समाधान में भ्रूण को निलंबित करने के लिए कुछ समय ब्योरा।
  4. 90 के ऊष्मायन के अंत में, लगभग 10 एस के लिए पानी के साथ 2 व्यंजनों में से प्रत्येक में जाल कंटेनर धो लें
  5. जाल कंटेनर को अच्छी तरह से 18.2 एमएम · सेंटीमीटर पानी से धो लें ताकि सीधा बोतल का उपयोग किया जा सके। इसके अलावा, पक्षों और जाल कंटेनर के बाहर धो लें
    नोट: पूरी तरह से धोने के बाद ब्लीच की गंध का पता नहीं होना चाहिए।
  6. पेपर टॉवेल पर जाल कन्टेनर को धब्बा। भ्रूण के साथ जाल कंटेनर का वजन और चरण 5.6 में प्राप्त खाली कंटेनर के वजन को घटाना। भ्रूण के परिणामस्वरूप वजन रिकॉर्ड करें। उद्देश्य के लिए भ्रूण का एक अच्छा हिस्सा 0.5 - 1 ग्राम है।

7. भ्रूण निकालने की तैयारी

  1. प्रोटीज इनहिबिटर (चरण 5.7 से) के साथ 1 एमएल का लिसेफेशन बफर डाइज गिलास होमोजिनेजर में जोड़ें और इसे बर्फ पर रखें। गर्भ कंटेनर से भ्रूण को होमोजिनायझर में स्थानांतरित करें।
    नोट: भ्रूण को एक फ्लैट एंड ओ के साथ उठाया जा सकता हैएफए धातु के रंग या एक ब्रश और बफर में सीधे स्थानांतरित। बर्फ पर इस खंड में सभी चरणों को पूरा करें
  2. एक अतिरिक्त 1 एमएल lysis बफर के साथ मेष पर शेष भ्रूण को धो लें और होमोजिनायझर में सामग्री में जोड़ें। भ्रूण homogenizer के नीचे करने के लिए नीचे बैठते हैं, और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  3. प्रोसेजेस इनहिबिटर (चरण 5.7 से) होमोजिनायझर के साथ लिसन बफर जोड़ें, भ्रूण के प्रति ग्राम में 5-6 एमएल का लिसेशन बफर लक्ष्य करना।
  4. ढीले फिटिंग मूसल के साथ भ्रूण को 4-6 स्ट्रोक से होमोजेनइज़ करें।
    नोट: पहले स्ट्रोक के दौरान, अधिक प्रतिरोध हो जाएगा। समाधान को छिड़कने से बचने के लिए एक सतत गति में मूसल को स्थानांतरित करने का प्रयास करें।
  5. एक तंग फिटिंग मूसल के साथ भ्रूण को 8-10 स्ट्रोक से होमोजेनइज़ करें।
  6. 20 मिनट के लिए बर्फ पर homogenate सेते हैं
  7. होमोजेनेट को सूक्ष्मदर्शी ट्यूबों और 4 डिग्री सेल्सियस पर उच्च गति (लगभग 13,000 xg) पर 15 मिनट के लिए स्थानांतरण करें।
  8. Avoidiछर्रों और बहुत ऊपर लिपिड परत एनजी, शीर्ष गति (लगभग 13,000 XG) पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सूक्ष्मदर्शी ताजे सूक्ष्मदर्शी ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरण करें।
  9. 1 एमएल टिप और 0.45 माइक्रोन फिल्टर संलग्न के साथ ठंडा 10 एमएल सिरिंज में लोड के साथ supernatants ध्यान से महाप्राण (एक सिरिंज में एक ही नमूना के aliquots गठबंधन)। सभी समाधान को एक लेबल में 15 एमएल ट्यूब पर बर्फ पर दबाएं। तत्काल प्रोटीन शुद्धि प्रयोगों के लिए तुरंत उपयोग किया जा सकता है या तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रोजन और भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है।
    नोट: भ्रूण के बजाय अर्क को फ्रीज करना बेहतर होता है, क्योंकि बाद में भ्रूण के प्रोटीजेस का पिघलना सक्रिय हो सकता है और प्रोटीन डिग्रेडेशन का कारण बन सकता है।

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Representative Results

प्रोटीन जटिल शुद्धि प्रयोग में इस प्रोटोकॉल के उपयोग को स्पष्ट करने के लिए, हमने नियंत्रण के तहत ईजीएफपी टैग ड्रोसोफिला कोशिकीय संकेत-विनियमित किनेज (ईआरके, लुढ़का जीन द्वारा एन्कोडेड) व्यक्त करते हुए एक समयुग्मित व्यवहार्य फ्लाई लाइन, बांह- ईजीएफपी-ईआरके उत्पन्न किया। एक सर्वव्यापी व्यक्त बांदादिलो ( बांह ) प्रमोटर 18 , 1 9 हाथ प्रमोटर ड्रोसोफिला भ्रूणजनन 1 9 के अधिकांश चरणों के दौरान सक्रिय है। Lysates वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार किया गया था, और एआरजी-एजीएफपी-ईआरके ट्रांसजेन से प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि की गई थी, कुल ईआरके प्रोटीन के लिए पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा एक साथ अंतर्जात और ट्रांसजेनिक EGFP-ERK के स्तर को 42 केडीए और 69 केडीए , क्रमशः ( चित्रा 2 ए )। एक एकल बैंड अनटैगड् अंतर्जात ईआर के अनुरूप है कश्मीर (42 केडीए) वाई डब्ल्यू नियंत्रण रेखा में पाया गया यह परिणाम भ्रूण से ERK और EGFP-ERK का एक सफल निकासी की पुष्टि करता है।

यह जांचने के लिए कि हमारे निष्कर्षण प्रोटोकॉल टैग प्रोटीन के बाद के शुद्धि के लिए उपयुक्त है, यौ और हाथ- ईजीएफपी - ईआरके मक्खियों से निकाले जाने वाले प्रकोष्ठों को 10 , 11 की स्थापना के बाद GFP-agarose मोतियों का उपयोग करते हुए आत्मीयता शुद्धि के अधीन किया गया था। ग्रेडियेंट एसडीएस पृष्ठ पर चलने वाले नमूनों की रजत धुंधला हो जाना, बैंग प्रोटीन, ईजीएफपी-ईआरके ( चित्रा 2 बी ) का सफल शुद्धि दिखाया। ईजीएफपी-ईआरके के अलावा, प्रयोगात्मक लेन में अतिरिक्त बैंड शामिल थे, जो कि नियंत्रण के नमूने में नहीं देखा गया था, यह सुझाव देते हुए कि शुद्धिकरण प्रक्रिया में संभावित ईआरके-इंटरैक्टिंग प्रोटीन प्राप्त हुए थे।

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चित्रा 1 : जनसंख्या पिंजरों की तैयारी। ( ए - डी ) एक 5-एल पिंजरे एक प्लास्टिक कंटेनर से बना है। ( ए ) एक प्रारंभिक कंटेनर ( बी ) 5 एल पिंजरे के नीचे का दृश्य ( सी ) जाल के साथ 5 एल पिंजरे के शीर्ष दृश्य संलग्न ( डी ) एक 15 सेमी सेब के रस प्लेट के साथ 5 एल पिंजरे इकट्ठे, नीचे दृश्य। ( ई और एफ) ए 3 इंच (76 मिमी) ड्रिल बिट 1 एल कंटेनर में ड्रिलिंग छेद के लिए इस्तेमाल किया। ( जी , एच ) ए 1 एल पिंजरे ( जी ) जाल के साथ एक 1 एल पिंजरे के शीर्ष दृश्य संलग्न। ( एच ) 10 सेमी सेब के रस प्लेट संलग्न, नीचे दृश्य के साथ 1 एल पिंजरे इकट्ठे। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 2 : भ्रूण से ईजीएफपी-ईआरके का निष्कर्षण और शुद्धि। ए एजीएफपी - ईआरके ट्रांसजेनिक लाइन से तैयार किए गए एक उद्धरण में एजीएफपी-ईआरके और अंतर्जात ईआरके की अभिव्यक्ति दिखा रहा है ( ए ) पश्चिमी धब्बा। Yw लाइन को एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था ग्रीन, कुल ईआरके एंटीबॉडी; लाल, आणविक वजन मार्कर ( बी ) रजत दाग जेल शुद्ध EGFP-ERK और जुड़े प्रोटीन दिखा रहा है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मध्यम पैमाने पर ड्रोसोफिला जनसंख्या पिंजरों की स्थापना और भ्रूण से पूरे सेल प्रोटीन अर्क बनाने के लिए एक सरल और सामान्य प्रक्रिया है। परिणामी अर्क का उपयोग विभिन्न प्रकार के डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशंस में किया जा सकता है, जैसे कि एफ़िनिटी रेजिन पर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की शुद्धि। यह बर्फ पर निष्कर्षण कदम प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है और प्रोटीन गिरावट को कम करने के लिए मजबूत प्रोटीज निषेध का उपयोग करता है। जैसा कि वर्णित है, प्रोटोकॉल सबसे अधिक cytoplasmic और कुछ झिल्ली और घुलनशील परमाणु प्रोटीन 6 , 10 , 12 , 15 के अलगाव के लिए उपयुक्त है। इसे अन्य डिब्बों से प्रोटीन की अधिक केंद्रित शुद्धि के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि उच्च नमक निष्कर्षण 5 का उपयोग करने वाले कम घुलनशील परमाणु प्रोटीनों के अलगाव। जैसा चरण 5.8 में बताया गया है, संग्रह समय और भ्रूण की उम्र बढ़ने की अवधि भी हो सकती हैविभिन्न विकास चरण प्राप्त करने के लिए सटीक अंतराल में स्थापित।

यह पता लगाने के लिए अक्सर वांछनीय है कि टैग प्रोटीन ब्याज अभिव्यक्ति के अंतर्जात स्तर से मिलकर स्तर पर व्यक्त किया गया है, जैसा कि हमने एआरएम-कुल ईआरके एंटीबॉडी ( चित्रा 2 ए ) का उपयोग किया है। यदि अंतर्जात प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं है, तो संरचनाओं की कार्यक्षमता अन्य assays द्वारा सत्यापित की जा सकती है, जैसे आनुवंशिक बचाव प्रयोग में। हालांकि अधिकांश मामलों में, टैग की गई प्रोटीन के एक हल्के overexpression को अभी भी सार्थक प्रोटीन परिसरों के अलगाव का परिणाम होना चाहिए, और वास्तव में "मुश्किल" प्रोटीन का निष्कर्षण और शुद्धि की सुविधा हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ इसकी सादगी है और एक सामान्य लागत पर पूरी प्रक्रिया को स्थापित करने की संभावना है। छोटे पिंजरों का उपयोग करने का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि कई ट्रांसजेनिक लाइनों को समानांतर में स्थापित और विश्लेषण किया जा सकता हैएल, जो बड़े पिंजरों का उपयोग करते समय संभव नहीं हो सकता। हम यहां वर्णन किए गए मक्खी के पिंजरों को आसानी से साफ कर सकते हैं और साल के लिए पुन: उपयोग कर सकते हैं। वर्णित के अनुसार नालगीन जार से 1-एल पिंजरे बनाने के बजाय, अन्य उपलब्ध कंटेनरों का उपयोग करना संभव है, जैसे कि 5-एल कंटेनर का छोटा संस्करण

हमने बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री 6 , 10 , 15 द्वारा विश्लेषण किए गए विभिन्न सिग्नल प्रोटीनों और जुड़े घटकों वाले परिसरों को शुद्ध करने के लिए इस प्रोटोकॉल (या इसके छोटे बदलावों के साथ भिन्नताएं) का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। इन तरीकों ने उपन्यास पीपीआई की पहचान करने के लिए प्रेरित किया है जो कार्यात्मक अध्ययन 10 , 15 में आगे मान्य थे। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की विविधता को पहले ड्रोसोफिला भ्रूणजनन 20 में phosphoproteome का विश्लेषण करने के लिए, और परिदृश्य का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया हैन्यूरल विकास 21 , 22 में सर्वव्यापीकरण का इसलिए यह प्रक्रिया विवो में पीपीआई का विश्लेषण करने के लिए एक सुविधाजनक प्रवेश द्वार का प्रतिनिधित्व करती है, और अन्य प्रोटिओमिक्स अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग करने योग्य है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणियों और प्रोटोकॉल सुधारों के लिए सुझावों के लिए Veraksa प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद किया है। एवी एनआईएच अनुदान जीएम105813 और एनएस096402 द्वारा समर्थित था एलई को मैसाचुसेट्स बोस्टन सैनोफी जेनजीम डॉक्टरेटल फैलोशिप विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) Home Depot 209330 For making 5-L cages.
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) Home Depot 209320 Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm Fisher Scientific FB0875714 Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm Fisher Scientific FB0875713A Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.
Sefar NITEX nylon mesh Sefar 03-180/44 180 micron, 44% open area, used for fly cages.
Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor Home Depot 49-56-9670 3 inch cutting tool for making 1-L cages.
Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure Fisher Scientific 11-823-33 For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.
Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch Red Star  can be purchased from Amazon.com or other suppliers.
Frozen 100% Apple Juice Concentrate  can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can.
Methyl 4-hydroxybenzoate Acros Organics AC126965000 also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.
IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml Sigma I8896 used for preparing lysis buffer.
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane  Fisher Scientific 09-740-2A 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.
Corning SFCA syringe filters  Fisher Scientific 09-754-21 SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples.
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles Fisher Scientific 14-823-2A for filtering final extract samples. BD cat # 309604.
Bleach Clorox used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.
Corning Costar Netwell Plates Fisher Scientific 07-200-213 mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well.
Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml Fisher Scientific 06-435B homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.

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References

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Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne, S., Kyriakakis, P., Veraksa, A. Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55804, doi:10.3791/55804 (2017).

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