Summary
Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en retfærdig og billig tilgang til indsamling af Drosophila embryoner i medium skala (0,5-1 g) og fremstilling af proteinekstrakter, der kan anvendes i nedstrøms proteomiske applikationer, såsom affinitetsrensnings-massespektrometri (AP-MS ).
Abstract
Analyse af protein-protein-interaktioner (PPI'er) er blevet en uundværlig tilgang til at studere biologiske processer og mekanismer, såsom cellesignalering, organismerudvikling og sygdom. Det er ofte ønskeligt at indhente PPI-information ved anvendelse af in vivo materiale for at opnå den mest naturlige og upartiske visning af interaktionsnetværkene. Frugtflugten Drosophila melanogaster er en glimrende platform til at studere PPI'er in vivo , og lader sig til retfærdige tilgange til isolering af materiale til biokemiske forsøg. Frugtflyveembryoner repræsenterer især en bekvem type væv til at studere PPI'er på grund af den nemme indsamling af dyr på dette udviklingsstadium og det faktum, at størstedelen af proteiner udtrykkes i embryogenese og således tilvejebringe et relevant miljø for at afsløre de fleste PPI'er. Her præsenterer vi en protokol til indsamling af Drosophila embryoner i medium skala (0,5-1 g), hvilket er en ideel mængde til et bredt udvalg afProteomiske applikationer, herunder analyse af PPI'er ved affinitetsoprensning-massespektrometri (AP-MS). Vi beskriver vores designs til 1 L og 5 L bur til embryon samlinger, der nemt og billigt kan opstilles i ethvert laboratorium. Vi leverer også en generel protokol til embryonindsamling og proteinudvinding for at frembringe lysater, som kan anvendes direkte i downstream-applikationer som AP-MS. Vores mål er at give alle forskere adgang til analyser af PPI'er in vivo .
Introduction
Genetiske skærmbilleder og mere nylig har genomiske tilgange revolutioneret undersøgelsen af biologiske funktioner. Imidlertid er vigtig cellulær information kodet i proteiner og deres ensemble af interaktive partnere. Mens traditionelle genetiske modifikationsskærme kan identificere hastighedsbegrænsende vejkomponenter og genvinde indirekte interaktioner, ligger styrken af de proteomiske fremgangsmåder i deres evne til at identificere komplette interaktive netværk af proteiner af interesse. Proteomics er således en værdifuld ortogonal metode til at studere biologiske systemer og supplerer genomics, transcriptomics og traditionelle genetiske skærme. Affinitetsrensning-massespektrometri (AP-MS) har vist sig at være en kraftfuld tilgang til undersøgelse af protein-proteininteraktioner (PPI'er) i deres naturlige miljø i celler og væv 1 , 2 . Denne metode gør det muligt at identificere direkte eller indirekte interaktioner ved specifik udviklingAl faser eller vævskontekster, og har med succes været anvendt til at identificere flere nye PPI'er i en række udviklingsveje (gennemgået i reference 1 ). På trods af PPI-studiernes ubestridte succes er de fleste af dem blevet udført i dyrkede celler, hvor de "agn" proteiner af interesse var overudtrykt. Der er to problemer med at studere PPI'er i cellekultur: For det første kan en specifik cellelinie ikke give et komplet komplement af interaktioner på grund af manglende ekspression af visse proteiner. For det andet kan høj overekspression, der normalt anvendes i sådanne analyser, føre til genstande såsom protein misfolding eller identifikation af falske positive interaktioner.
Begge disse begrænsninger kan overvindes ved at analysere PPI'er in vivo . Et begrænsende trin i sådanne eksperimenter er tilgængeligheden af udgangsmaterialet til oprensning af proteinkomplekser. Drosophila melanogaster har længe været brugt som model for funktionel analyseSis, og for nylig er det også vist sig at være et fremragende system til at studere PPI'er in vivo . Drosophila embryogenese repræsenterer en særdeles attraktiv vævstype til at studere PPI'er, fordi embryoner nemt kan indsamles i store mængder, og også fordi de fleste gener (> 88%) udtrykkes i løbet af embryogenese og således tilvejebringer et rigt in vivo miljø til detektering af relevante PPI'er 3 .
Traditionelt udnyttede biokemiske undersøgelser i fluer meget store embryonsamlinger (100-150 g), såsom dem, der var nødvendige for rensning af funktionelle transkriptionelle lysater 4 , 5 . Tidligere AP-MS- undersøgelser i Drosophila havde også brug for store mængder embryoner (5-10 g), fordi de var afhængige af en to-trins oprensning, såsom tandemaffinitetsrensning (TAP), med det tilhørende tab af materiale i hvert trin 6 . Stor amounTs udgangsmateriale nødvendiggjorde opsætning af embryoindsamlinger i store befolkningsburer, som kan være både dyre (når de købes kommercielt) og tidskrævende at vedligeholde og rense 7 , 8 , 9 .
Nylige fremskridt i udviklingen af en-trins affinitetsrensningsfremgangsmåder såvel som den voksende følsomhed af massespektrometre har reduceret den nødvendige mængde udgangsmateriale med en størrelsesorden. Ved anvendelse af tags som streptavidinbindende peptid (SBP) eller grønt fluorescerende protein (GFP) og startende fra mindre end 1 g embryoner er det muligt at isolere mængderne af agnprotein og interaktive komponenter, der ville være tilstrækkelige til identifikation af Massespektrometri 10 , 11 .
Formålet med protokollen, der præsenteres her, er at hjælpe forskerne overcoMig en opfattet barriere for biokemisk analyse af PPI'er in vivo . Til dette formål tilvejebringer vi en simpel og billig procedure til indsamling af Drosophila embryoner i medium skala (0,5-1 g) efterfulgt af en-trins forberedelse af fuldcelleproteinekstrakter, der er egnede til efterfølgende analyse af AP-MS eller andre fremgangsmåder . Vores metode er baseret på brug af specialfremstillede 1-L eller 5-L populationsbure, der let kan produceres af ethvert laboratorium. Desuden er de ovenfor beskrevne ekstraktionsbetingelser valideret i adskillige studier, både i dyrkede celler og in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af 5 L Fly Cages (Tilpas 15 cm Plader)
- Hent de nødvendige materialer: 5-kvart (4,7-L) beholder med låg ( figur 1A ), nylon mesh og et barberblad.
- Marker en 12 cm diameter cirkel og skær et hul i bunden af beholderen ved hjælp af barberbladet ( figur 1B ). Skær et hul på 15 cm i låget ( figur 1C ).
- Skær nylonsnit i 25 x 25 cm firkanter.
- Placer masken over beholderens øverste kant og tryk ned med låget ( figur 1C ). Sørg for, at masken er stram og låget ikke vippes. Buret er klar til at blive befolket med fluer (se trin 5.3).
2. Forberedelse af 1 L Fly Cages (Tilpas 10 cm Plader)
- Få de nødvendige materialer: En elektrisk boremaskine, et 3-tommer (76 mm) skæreværktøj ( Figur 1E og FIgure 1F), en lige 1 L plastikbeholder med låg, nylonnet, et barberblad, sandpapir, beskyttelsesbriller og arbejdshandsker.
- Skær 3 cm (76 mm) huller i bunden og låget på plastikburken ( Figur 1G ), med låget tæt skruet på beholderen under boring. Placer klippeværktøjet i midten af cirklen, når du begynder at lave et hul.
Forsigtig: Brug øjenværn og arbejdshandsker under dette trin. - Glat kanterne af hullerne med et knivblad og sandpapir.
- Skær nylonsnit i 18 x 18 cm firkanter.
- Placer masken over krukkets øverste kant og stram ved at skrue låget på ( Figur 1G ). Sørg for, at masken er stram og låget ikke vippes. Buret er klar til at blive befolket med fluer (se trin 5.3).
3. Tilberedning af Apple Juice (AJ) plader
- Tilsæt 19 g agar og 1 liter 18,2 MΩ · cm vand i en 2 L kolbe.Tilsæt omrøringsstang, og bland kort.
- Autoklav i 30 minutter. Tør i mellem 100% æblesaftkoncentrat fra frosset stamme og fremstill 10 ml 10% (vægt / volumen) methyl 4-hydroxybenzoatopløsning i ethanol.
- Efter autoklavering begynder man at blande agaret på en omrøringsplade og tilsæt kolbe med 80 ml 100% æblejuice og 10 ml 10% (vægt / volumen) methyl 4-hydroxybenzoatopløsning. Lad afkøle ved stuetemperatur med konstant blanding.
- Hæld 15 cm petriskål (til 5 liter bur) eller 10 cm petriskåle (til 1 liter bur), så at agarniveauet i hver skål er ca. 5 mm tykt. Tillad at størkne ved stuetemperatur og pakk i plastikposer. AJ-plader kan opbevares ved 4 ° C i to uger.
Bemærk: Petriskål kan vaskes og genanvendes. - Forbered våd gærpasta: Hæld nogle aktive tørgær i en 100 ml beholder med et låg, der muliggør let blanding og tilsæt vand i små mængder under omrøring for at opnå en tyk men grundigt blandetsæt ind. Opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger.
4. Fremstilling af lysisreagenser
- Fremstil 5x lysis buffer: 250 mM Tris pH 7,5, 25% glycerol, 1% octylphenoxy poly (ethylenoxy) ethanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl2, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na3VO4.
- For at gøre 200 ml: opløs 1 g NaF pulver og 184 mg Na 3 VO 4 pulver i 71 ml vand fuldstændigt med konstant omrøring. Tilsæt 50 ml 1 M Tris pH 7,5, 2 ml 100% IGEPAL, 1,5 ml 1 M MgCl2 og 25 ml 5 M NaCl. Derefter tilsættes 50 ml glycerol (tilsæt sidst) og fortsæt omrøring i 1 time.
- Filtrer-steriliser ved brug af 250 ml filterenheder. Dette trin kan være langsomt, men filtrering af opløsningen er vigtig for at fjerne uopløselige partikler. Aliquot med 10 ml i 50 ml rør og opbevar ved -80 ° C.
- Forbered 1 M dithiothreitol (DTT) opløsning i vand. Opbevares ved -20 ° C i 1 ml alikvoter.
- Hent proteAse inhibitor cocktail tabletter, med ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Opbevares ved 4 ° C.
- Indhent 10 ml sprøjter og sprøjtefiltre: 26 mm diameter, membran med overfladeaktivt middel celluloseacetat (SFCA), 0,45 μm porestørrelse.
5. Indsamling af flyveembryoner
- Forstærke de transgene flyvelinjer, der bærer det mærket protein af interesse i flasker (ca. 100 fluer pr. Flaske), og overfør flaskerne hver 2 dage indtil 25-30 flasker akkumuleres for hver flyve. Forstærk styrestammen ( f.eks. Yw- linjen) på lignende måde.
- Varm AJ-plader til stuetemperatur (ca. 1-2 timer, kan foretages natten over). Ved hjælp af en handskbet finger spredes nogle våde gærpasta i midten af AJ-pladerne for at gøre ca. 6 cm cirkel til en 15 cm plade og en 4 cm cirkel til en 10 cm plade.
- Bedøve fluerne med en strøm af carbondioxid ved hjælp af en standard Drosophila stage setup og overføre tilBurene (ca. 15 velvoksede flasker fluer pr. 5 liter bur, 5 flasker pr. 1 liter bur).
- Dæk burbunden med forberedte AJ-plader fra trin 5.2, og bånd AJ-pladen til buret ved hjælp af to båndstrimler ( fig. 1D og 1H ). Det er nyttigt at folde over spidsen af båndet, der går over pladen, for let skrælning, når du skifter plader.
- Når fluerne er kommet tilbage fra anæstesi, skal du holde burene med pladerne nederst og maske på toppen.
Bemærk: Det er vigtigt at vente, indtil fluerne er helt gendannede, da de ellers vil holde sig til AJ-pladen og gærpastaen. - I slutningen af forsøget, for at forberede buret til rengøring, placer buret i fryseren i flere timer. Nydning af nettet i vand i et par timer vil lette rengøringen.
- Inkuber burene med fluer ved stuetemperatur i 2-3 dage og skift AJ-plader to gange om dagen. For at skifte pladerne skal du dreje buret på hovedet,Skræl båndet fra pladen, men hold pladen til buret, tryk hele buret forsigtigt på bænken og hurtigt bytte den gamle plade til en ny, forsøger ikke at tillade fluer at flygte.
Bemærk: Fluer skal justere sig til buret og vil ligge bedst fra og med dagen 3. De vil fortsætte med at ligge på toppunkt i ca. 4-5 dage. To 5 L-bur på øverste lægekapacitet kan producere op til 1 g embryoner i en overnatningsopsamling. Brug 1 l bur til mindre forsøg. - Tillad fluer at lægge embryoner på friske AJ-plader natten over (ca. 16 timer) eller for en hvilken som helst anden ønsket længde af tiden.
- Næste morgen markere og veje maskebeholdere til embryonindsamling, en pr. Hver brugt linje.
- Forbered 1x lysisbuffer ved anvendelse af reagenser fra afsnit 4 (Bemærk: 1x lysisbuffer klar til brug skal fremstilles lige før ekstraktion): Tilsæt 40 ml vand til 10 ml 5x koncentreret lysbuffer (opbevaret ved -80 ° C) I et 50 ml rør.
- Tilsæt 50 μl 1 MDTT til en slutkoncentration på 1 mM, blandes godt og adskilles i to 50 ml rør, 25 ml i hver. Til et af rørene tilsættes en proteasehæmmende tablet og roterer ved 4 ° C i 30 minutter. Mens tabletten opløses, samles og dekarioneres embryoner (trin 5.8 til 6.6). Kontroller, at tabletten er helt opløst, og hold bufferen på is.
Bemærk: Det andet rør med 1x buffer med DTT kan opbevares ved -80 ° C og vil kun kræve tilsætning af tabletten inden næste forsøg. 25 ml lysisbuffer er tilstrækkelig til op til 2 prøver under hensyntagen til efterfølgende vaske under proteinrensningstrin.
- Tilsæt 50 μl 1 MDTT til en slutkoncentration på 1 mM, blandes godt og adskilles i to 50 ml rør, 25 ml i hver. Til et af rørene tilsættes en proteasehæmmende tablet og roterer ved 4 ° C i 30 minutter. Mens tabletten opløses, samles og dekarioneres embryoner (trin 5.8 til 6.6). Kontroller, at tabletten er helt opløst, og hold bufferen på is.
- Markér AJ-pladerne på burene med genotyperne for de anvendte flyledninger, og skift pladerne til friske.
Bemærk: Overskydende gærpasta kan skrabes af pladen på dette trin. Embryoer kan alder på pladerne ved 25 ° C eller stuetemperatur for at opnå det ønskede vindue for udviklingstiden. - Tilsæt nok vand tO dække hver AJ plade. Fjern forsigtigt embryoerne fra pladen med en blød pensel (fladt hoved ca. 10 mm bredt fungerer godt for store plader). Hæld embryonerne i den tidligere vejede og markerede maskebeholder og dræne overskydende vand.
- Hvis det er nødvendigt, udfør en anden skylning og børstning af pladen for at fjerne alle embryoer. Kombiner embryonerne fra yderligere plade (r) til den samme flyvelinie i samme maskebeholder.
- Blæk kort masken på papirhåndklæder for at fjerne overskydende vand.
6. Embryo Dechorionation
- Halvfyld en 6 cm petriskål med 50% blegemiddel (vol / vol opløsning i vand).
Bemærk: Se vigtig kommentar om blegemiddelmærke i materialebordet og reagenser.
Forsigtig: Brug handsker og undgå at få blegemiddel på tøj. - Forbered 2 større petriskåle med vand.
- Sænk meshbeholderen med embryoner i 50% blegemiddel i 90 s. Tapp masken forsigtigt under incuBation et par gange for at suspendere embryonerne i blegemiddelopløsningen.
- Ved slutningen af 90 s inkubation vasker beholderbeholderen i hver af de 2 retter med vand i ca. 10 s.
- Skyl maskebeholderen grundigt med 18,2 MΩ · cm vand ved hjælp af sprøjteflasken. Vask også siderne og ydersiden af maskebeholderen.
Bemærk: Ingen blegemiddel lugt skal opdages efter en grundig vask. - Sæt netbeholderen på papirhåndklæder. Væg netbeholderen med embryoerne og træk vægten af den tomme beholder opnået i trin 5.6. Optag den resulterende vægt af embryoerne. En god mængde embryoner at tilstræbe er 0,5 - 1 g.
7. Fremstilling af embryoekstrakt
- Tilsæt 1 ml lysisbuffer med proteaseinhibitorer (fra trin 5.7) til en dounceglashomogenisator og hold den på is. Overfør embryonerne fra meshbeholderen til homogenisatoren.
Bemærk: Embryoer kan afhentes med en flad ende oFa metal spatel eller en børste og overføres direkte i bufferen. Udfør alle trin i dette afsnit på is. - Vask de resterende embryoner ud på masken med en yderligere 1 ml lysisbuffer og tilsæt materialet i homogenisatoren. Lad embryoerne slå sig ned til bunden af homogenisatoren og aspirere forsigtigt supernatanten.
- Tilsæt lysisbuffer med proteaseinhibitorer (fra trin 5.7) til homogenisatoren med henblik på 5-6 ml lysisbuffer pr. Gram embryoner.
- Homogeniser embryoerne med 4-6 slagtilfælde med en løs monteringstempel.
Bemærk: Under de første slag er der mere modstand. Prøv at flytte pistlen i en kontinuerlig bevægelse for at undgå at sprøjte løsningen. - Homogeniser embryoerne med 8-10 slagtilfælde med en tætsluttende pestle.
- Inkuber homogenatet på is i 20 minutter.
- Overfør homogenatet i mikrocentrifugerør og centrifuger ved 4 ° C i 15 minutter ved højeste hastighed (ca. 13.000 xg).
- AvoidiNg pellets og det øverste lipidlag, overfør supernatanterne til friske mikrocentrifugerør og centrifuger ved 4 ° C i 15 minutter ved højeste hastighed (ca. 13.000 xg).
- Sug forsigtigt supernatanter med 1 ml spids og læg i kølede 10 ml sprøjter med 0,45 μm filtre fastgjort (kombinér alikvoter af samme prøve i en sprøjte). Skub al opløsningen til et mærket 15 ml rør på is. Ekstrakten kan straks anvendes til efterfølgende proteinrensningsforsøg eller snapsfrosne i flydende nitrogen og holdes ved -80 ° C til senere brug.
Bemærk: Det er bedre at fryse ekstrakterne snarere end embryoerne, fordi proteaser kan blive aktiveret under efterfølgende optøning af embryoner og føre til nedbrydning af proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at illustrere brugen af denne protokol i et proteinkompleks rensningsforsøg genererede vi en homozygot levedygtig flyve linje, arm-EGFP-ERK , der udtrykte EGFP-mærket Drosophila ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK kodet af det rullede gen) under kontrollen Af en ubiquitously udtrykt armadillo ( arm ) promotor 18 , 19 . Armpromotoren er aktiv i de fleste faser af Drosophila embryogenese 19 . Lysater blev fremstillet under anvendelse af den beskrevne protokol, og ekspressionen af protein fra arm-EGFP-ERK- transgenet blev bekræftet ved western blotting for totalt ERK-protein til samtidig detektion af niveauerne af endogent og transgent EGFP-ERK, migrerende ved 42 kDa og 69 kDa , Henholdsvis ( figur 2A ). Et enkeltbånd svarende til ikke-tagget endogent ER K (42 kDa) blev detekteret i yw kontrollinjen . Dette resultat bekræfter en vellykket udvinding af ERK og EGFP-ERK fra embryoner.
For at teste om vores ekstraktionsprotokol er egnet til efterfølgende rensning af et mærket protein, blev ekstrakter fra yw- og arm-EGFP-ERK- fluerne udsat for affinitetsoprensning under anvendelse af GFP-agarosekugler efter etablerede protokoller 10 , 11 . Sølvfarvning af prøver kørt på en gradient SDS-PAGE viste en vellykket oprensning af agnproteinet, EGFP-ERK ( figur 2B ). Foruden EGFP-ERK selv indeholdt den eksperimentelle bane yderligere bånd, som ikke blev observeret i kontrol- yw- prøven, hvilket tyder på, at rensningsfremgangsmåden udvindede potentielle ERK-interagerende proteiner.
"Src =" / files / ftp_upload / 55804 / 55804fig1.jpg "/>
Figur 1 : Fremstilling af populationsbure. ( A - D ) En 5-L bur lavet af en plastikbeholder. ( A ) En startbeholder. ( B ) Nederste billede af 5 L buret. ( C ) Set ovenfra af 5 L bur med fastgørelsesnet. ( D ) Samlet 5 L bur med en 15 cm æblejuiceplade, nederste billede. ( E og F) En 3 tommer (76 mm) borekrone, der anvendes til boring af huller i 1 L beholderen. ( G , H ) En 1 liter bur. ( G ) Set ovenfra af et 1 l bur med fastgørelsesnet. ( H ) Monteret 1 L bur med en 10 cm æblejuiceplade fastgjort nederst. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, er en simpel og generel fremgangsmåde til opstilling af Drosophila- populationskure på mellemstore skalaer og fremstilling af hele- celleproteinekstrakter fra embryoner. De resulterende ekstrakter kan anvendes i en række forskellige downstream-applikationer, såsom rensning af proteinkomplekser på affinitetsharpikser. Det er kritisk at udføre ekstraktionstrinnene på is og anvende stærk proteasehæmning for at minimere proteinforringelse. Som beskrevet er protokollen egnet til isolering af de fleste cytoplasmatiske og nogle membran og opløselige nukleare proteiner 6 , 10 , 12 , 15 . Det kan let tilpasses til en mere fokuseret oprensning af proteiner fra andre rum, såsom isolering af mindre opløselige nukleare proteiner ved anvendelse af højsaltekstraktion 5 . Som nævnt i trin 5.8 kan indsamlingstider og embryo-aldringsperioder væreOpstillet med præcise intervaller for at opnå forskellige udviklingsstadier.
Det er ofte ønskeligt at fastslå, at det mærkede protein af interesse udtrykkes på niveauer, som er tæt ved at matche de endogene ekspressionsniveauer, som vi har vist ved anvendelse af anti-totalt ERK-antistof ( figur 2A ). Hvis antistoffet mod endogent protein ikke er tilgængeligt, kan funktionaliteten af konstruktionerne verificeres ved andre analyser, fx i et genetisk redningseksperiment. I de fleste tilfælde bør en mild overekspression af det mærkede protein imidlertid stadig resultere i isolering af meningsfulde proteinkomplekser og kan faktisk lette udvindingen og rensningen af "vanskelige" proteiner.
Den største fordel ved denne protokol er dens enkelhed og en mulighed for at oprette hele proceduren til moderate omkostninger. En yderligere fordel ved at bruge mindre bur er, at flere transgene linjer kan opstilles og analyseres i paralleL, hvilket måske ikke er muligt ved brug af større bur. De flygebure, vi beskriver her, kan let rengøres og genanvendes i årevis. I stedet for at lave 1-L-bur fra Nalgene-krukker som beskrevet, er det muligt at bruge andre tilgængelige beholdere, såsom en mindre version af 5-L-beholderen.
Vi har med held anvendt denne protokol (eller dens variationer med små modifikationer) til rensning af komplekser indeholdende forskellige signalproteiner og associerede komponenter efterfulgt af analyse ved massespektrometri 6 , 10 , 15 . Disse tilgange har ført til identifikation af nye PPI'er, som blev yderligere valideret i funktionelle studier 10 , 15 . Variationer af protokollen, der præsenteres her, er tidligere blevet anvendt til at analysere phosphoproteomet i Drosophila embryogenese 20 og at studere landskabetAf ubiquitination i neurale udvikling 21 , 22 . Denne procedure repræsenterer derfor en bekvem gateway til analyse af PPI'er in vivo og kan anvendes til andre proteomiske applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmer af Veraksa laboratoriet for nyttige kommentarer om manuskriptet og forslag til protokolforbedringer. AV blev støttet af NIH tilskud GM105813 og NS096402. LY blev støttet af University of Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Ph.d.-stipendiat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
References
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
