Summary
El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque sencillo y barato para recolectar embriones de Drosophila a escala media (0,5-1 g) y preparar extractos de proteínas que pueden ser utilizados en aplicaciones proteómicas aguas abajo, tales como la purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS ).
Abstract
El análisis de las interacciones proteína-proteína (IPP) se ha convertido en un enfoque indispensable para estudiar los procesos y mecanismos biológicos, como la señalización celular, el desarrollo del organismo y las enfermedades. A menudo es deseable obtener información PPI utilizando material in vivo , para obtener la visión más natural e imparcial de las redes de interacción. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es una excelente plataforma para estudiar PPIs in vivo , y se presta a enfoques sencillos para aislar material para experimentos bioquímicos. En particular, los embriones de mosca de la fruta representan un tipo conveniente de tejido para estudiar los IBP, debido a la facilidad de recolección de animales en esta etapa de desarrollo y el hecho de que la mayoría de las proteínas se expresan en embriogénesis, proporcionando un entorno relevante para revelar la mayoría de los IBP. Aquí presentamos un protocolo para la recogida de embriones Drosophila a escala media (0,5-1 g), que es una cantidad ideal para una amplia gama deAplicaciones proteómicas, incluyendo análisis de PPIs por purificación por afinidad-espectrometría de masas (AP-MS). Describimos nuestros diseños para jaulas de 1 L y 5 L para colecciones de embriones que pueden ser instaladas fácil y económicamente en cualquier laboratorio. También proporcionamos un protocolo general para la recolección de embriones y la extracción de proteínas para generar lisados que pueden ser utilizados directamente en aplicaciones descendentes como AP-MS. Nuestro objetivo es proporcionar un medio accesible para que todos los investigadores lleven a cabo los análisis de los IPP in vivo .
Introduction
Las pantallas genéticas y, más recientemente, los enfoques genómicos han revolucionado el estudio de las funciones biológicas. Sin embargo, la información celular importante se codifica en proteínas y su conjunto de socios que interactúan. Mientras que las pantallas modificadoras genéticas tradicionales pueden identificar componentes de vías limitantes y recuperar interacciones indirectas, la fortaleza de los enfoques proteómicos reside en su capacidad para identificar redes de interacción inmediata completas de proteínas de interés. La proteómica es, pues, un valioso método ortogonal para estudiar los sistemas biológicos y complementa la genómica, la transcriptómica y las pantallas genéticas tradicionales. La purificación de afinidad-espectrometría de masas (AP-MS) ha demostrado ser un poderoso enfoque para estudiar las interacciones proteína-proteína (IPP) en su entorno nativo en las células y tejidos [ 1 , 2] . Este método permite la identificación de interacciones directas o indirectas en un desarrollo específicoAl estadios o contextos de tejido, y se ha utilizado con éxito para identificar múltiples nuevos PPIs en una variedad de vías de desarrollo (revisado en la referencia 1 ). A pesar del éxito indiscutible de los estudios de PPI, la mayoría de ellos se han llevado a cabo en células cultivadas, en las que se sobreexpresaron las proteínas de "cebo" de interés. Hay dos problemas con el estudio de los IBP en el cultivo de células: en primer lugar, una línea celular específica puede no proporcionar un complemento completo de interacciones debido a la falta de expresión de ciertas proteínas. En segundo lugar, la sobreexpresión alta normalmente empleada en tales análisis podría conducir a artefactos tales como el replanteo de proteínas o la identificación de interacciones positivas falsas.
Ambas limitaciones pueden ser superadas analizando PPI in vivo . Un paso limitante en tales experimentos es la disponibilidad del material de partida para purificar complejos de proteínas. Drosophila melanogaster se ha utilizado durante mucho tiempo como un modelo para el análisis funcionalSis, y recientemente también se ha demostrado ser un excelente sistema para el estudio de PPIs in vivo . La embriogénesis de Drosophila representa un tipo de tejido particularmente atractivo para estudiar los IBP, ya que los embriones pueden ser fácilmente recolectados en grandes cantidades, y también porque la mayoría de los genes (> 88%) se expresan durante la embriogénesis, proporcionando así un rico entorno in vivo para detectar IPP 3 .
Tradicionalmente, los estudios bioquímicos en moscas utilizaron colecciones de embriones a gran escala (100-150 g), como las necesarias para purificar los lisados transcripcionales funcionales [ 4 , 5] . Estudios previos de AP-MS en Drosophila también requerían grandes cantidades de embriones (5-10 g), porque dependían de un enfoque de purificación en dos etapas como la purificación de afinidad en tándem (TAP), con la consiguiente pérdida de material en cada paso 6 . Gran cantidadSt de material de partida requirió la creación de colecciones de embriones en grandes jaulas de población, que pueden ser costosas (cuando se compran comercialmente) y consumir mucho tiempo para mantener y limpiar 7 , 8 , 9 .
Los avances recientes en el desarrollo de enfoques de purificación por afinidad de un solo paso, así como la sensibilidad creciente de espectrómetros de masas, han reducido la cantidad necesaria de material de partida en un orden de magnitud. Usando etiquetas tales como el péptido de unión a la estreptavidina (SBP) o la proteína fluorescente verde (GFP) y partiendo de menos de 1 g de embriones, es posible aislar las cantidades de la proteína cebo y los componentes interactivos que serían suficientes para la identificación por Espectrometría de masas 10 , 11 .
El objetivo del protocolo presentado aquí es ayudar a los investigadores aMe una barrera percibida para el análisis bioquímico de PPIs in vivo . Con este fin, proporcionamos un procedimiento sencillo y económico para recoger embriones de Drosophila a escala media (0,5-1 g), seguido de una etapa de preparación de extractos de proteínas de células enteras que son adecuados para el análisis posterior por AP-MS u otros enfoques . Nuestro método se basa en el uso de jaulas personalizadas de 1-L o 5-L que pueden ser producidas fácilmente por cualquier laboratorio. Además, las condiciones de extracción presentadas aquí han sido validadas en varios estudios, tanto en células cultivadas como in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de jaulas para moscas de 5 litros (para colocar placas de 15 cm)
- Obtenga los materiales necesarios: recipiente de 5 cuartos de galón (4.7-L) con tapa ( Figura 1A ), malla de nylon y una cuchilla de afeitar.
- Marque un círculo de 12 cm de diámetro y corte un agujero en la parte inferior del recipiente usando la cuchilla de afeitar ( Figura 1B ). Corte un agujero de 15 cm de diámetro en la tapa ( Figura 1C ).
- Corte la malla de nylon en cuadrados de 25 x 25 cm.
- Coloque la malla sobre el borde superior del recipiente y presione hacia abajo con la tapa ( Figura 1C ). Asegúrese de que la malla esté apretada y la tapa no esté inclinada. La jaula está lista para ser poblada con moscas (vea el paso 5.3).
2. Preparación de jaulas de mosca de 1 L (para colocar placas de 10 cm)
- Obtenga los materiales necesarios: un taladro eléctrico, una herramienta de corte de 3 pulgadas (76 mm) ( Figura 1E y FFigura 1F), una jarra de plástico de 1 L de recto con tapa, malla de nylon, una hoja de afeitar, papel de lija, gafas y guantes de trabajo.
- Corte los agujeros de 3 pulgadas (76 mm) en el fondo y la tapa del frasco de plástico ( Figura 1G ), con la tapa firmemente atornillada en el recipiente mientras se perfora. Coloque la herramienta de corte en el centro del círculo al comenzar a hacer un agujero.
Precaución: Use protección para los ojos y guantes de trabajo durante este paso. - Suavizar los bordes de los agujeros con una hoja de afeitar y papel de lija.
- Corte la malla de nylon en cuadrados de 18 x 18 cm.
- Coloque la malla sobre el borde superior de la jarra y apriete atornillando la tapa ( Figura 1G ). Asegúrese de que la malla esté apretada y la tapa no esté inclinada. La jaula está lista para ser poblada con moscas (vea el paso 5.3).
3. Preparación de placas de jugo de manzana (AJ)
- Añadir 19 g de agar y 1 L de 18,2 MΩ · cm de agua en un matraz de 2 l.Añadir una barra de agitación, y mezclar brevemente.
- Autoclave durante 30 min. Mientras tanto, descongelar el concentrado de jugo de manzana al 100% a partir de caldo congelado y preparar 10 ml de solución de 4-hidroxibenzoato de metilo al 10% (peso / volumen) en etanol.
- Después de la esterilización en autoclave, comenzar a mezclar el agar sobre una placa de agitación, y agregar 80 ml de concentrado de jugo de manzana al 100% y 10 ml de solución de 4-hidroxibenzoato de metilo al 10% (peso / volumen) al matraz. Dejar enfriar a temperatura ambiente con mezcla constante.
- Vierta platos de Petri de 15 cm (para jaulas de 5 L) o de Petri de 10 cm (para jaulas de 1 L) de manera que el nivel de agar en cada plato sea de aproximadamente 5 mm de espesor. Dejar solidificar a temperatura ambiente, y envolver en bolsas de plástico. Las placas AJ se pueden almacenar a 4 ° C durante dos semanas.
Nota: Las placas de Petri se pueden lavar y reutilizar. - Preparar la pasta de levadura húmeda: verter una levadura seca activa en un recipiente de 100 ml con una tapa que permita una fácil mezcla y añadir agua en pequeñas cantidades mientras se agita, para obtener una mezcla gruesa pero bien mezcladapegar. Conservar a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
4. Preparación de reactivos de lisis
- Preparar 5x tampón de lisis: 250 mM Tris pH 7,5, 25% glicerol, 1% octilfenoxi poli (etilenoxi) etanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl2, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na3VO4.
- Para hacer 200 mL: disolver completamente 1 g de polvo de NaF y 184 mg de Na3VO4 en polvo en 71 mL de agua con agitación constante. Añadir 50 ml de Tris 1 M a pH 7,5, 2 ml de IGEPAL al 100%, 1,5 ml de MgCl $ ₂ $ 1 M y 25 ml de NaCl 5 M. A continuación, añadir 50 ml de glicerol (añadir en último lugar) y seguir agitando durante 1 h.
- Filtrar-esterilizar utilizando unidades de filtro de 250 ml. Este paso puede ser lento, pero la filtración de la solución es importante para eliminar las partículas insolubles. Alícuota de 10 ml en tubos de 50 ml y almacenar a -80 ° C.
- Preparar 1 M de ditiotreitol (DTT) en agua. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 1 ml.
- Obtener proteAse, con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Almacenar a 4 ° C.
- Obtenga jeringas y filtros de jeringa de 10 ml: diámetro de 26 mm, membrana de acetato de celulosa libre de tensioactivos (SFCA), tamaño de poro de 0,45 μm.
5. Recolección de embriones mosca
- Ampliar las líneas de moscas transgénicas que llevan la proteína marcada de interés en botellas (aproximadamente 100 moscas por botella), y transferir las botellas cada 2 días hasta que se acumulen 25-30 botellas por cada línea de mosca. Ampliar el stock de control ( por ejemplo, la línea yw ) de una manera similar.
- Se calientan las placas de AJ a temperatura ambiente (aproximadamente 1-2 h, se pueden hacer durante la noche). Utilizando un dedo enguantado, esparza una pasta de levadura húmeda en el centro de las placas de AJ, para hacer un aprox. Círculo de 6 cm para una placa de 15 cm y un círculo de 4 cm para una placa de 10 cm.
- Anestesiar las moscas con un flujo de dióxido de carbono usando una configuración estándar de Drosophila y transferirlas aLas jaulas (aproximadamente 15 botellas bien cultivadas de moscas por jaula de 5 litros, 5 botellas por jaula de 1 litro).
- Cubra el fondo de la jaula con las placas AJ preparadas de la etapa 5.2 y tape la placa AJ en la jaula usando dos tiras de cinta ( Figuras 1D e 1H ). Es útil doblar sobre las puntas de la cinta que van sobre la placa para pelar fácil al cambiar las placas.
- Después de que las moscas se recuperen de la anestesia, mantener las jaulas con las placas en la parte inferior y la malla en la parte superior.
Nota: Es importante esperar hasta que las moscas se recuperen completamente, ya que de lo contrario se pegarán a la placa de AJ y pasta de levadura. - Al final del experimento, para preparar la jaula para la limpieza, coloque la jaula en el congelador durante varias horas. El remojo de la malla en agua durante unas horas facilitará la limpieza.
- Incubar las jaulas con moscas a temperatura ambiente durante 2-3 días y cambiar las placas AJ dos veces al día. Para cambiar las placas, gire la jaula boca abajo,Pelar la cinta de la placa, pero sostener el plato a la jaula, toque la jaula entera suavemente en el banco, y rápidamente cambiar el plato viejo por uno nuevo, tratando de no permitir que las moscas para escapar.
Nota: Las moscas necesitan ajustarse a la jaula y pondrán mejor a partir del día 3. Seguirán poniéndose en el nivel máximo durante unos 4-5 días. Dos jaulas de 5 litros en capacidad máxima de colocación pueden producir hasta 1 g de embriones en una colección durante la noche. Utilizar jaulas de 1 L para experimentos de menor escala. - Permita que las moscas depositen embriones en placas frescas de AJ durante la noche (aproximadamente 16 horas), o para cualquier otro período de tiempo deseado.
- A la mañana siguiente, marcar y pesar los contenedores de malla para la recolección de embriones, uno por cada línea de mosca utilizada.
- Preparar un tampón de lisis 1x, utilizando los reactivos de la sección 4 (Nota: antes de la extracción se debe preparar un tampón de lisis listo para su uso): añadir 40 ml de agua a 10 ml de tampón de lisis concentrado 5x (almacenado a -80 ° C) En un tubo de 50 ml.
- Añadir 50 μl de 1 MDTT hasta una concentración final de 1 mM, mezclar bien y separar en dos tubos de 50 mL, 25 mL en cada uno. A uno de los tubos, añadir un comprimido de inhibidor de la proteasa y girar a 4 ° C durante 30 min. Mientras la tableta se está disolviendo, recoja y decocine los embriones (pasos 5.8 a 6.6). Compruebe que la tableta se haya disuelto completamente y mantenga el buffer en hielo.
Nota: El segundo tubo de tampón 1x con DTT puede almacenarse a -80 ° C y sólo requerirá la adición de la tableta antes del siguiente experimento. 25 ml de tampón de lisis es suficiente para hasta 2 muestras, teniendo en cuenta los lavados posteriores durante las etapas de purificación de proteínas.
- Añadir 50 μl de 1 MDTT hasta una concentración final de 1 mM, mezclar bien y separar en dos tubos de 50 mL, 25 mL en cada uno. A uno de los tubos, añadir un comprimido de inhibidor de la proteasa y girar a 4 ° C durante 30 min. Mientras la tableta se está disolviendo, recoja y decocine los embriones (pasos 5.8 a 6.6). Compruebe que la tableta se haya disuelto completamente y mantenga el buffer en hielo.
- Marque las placas de AJ en las jaulas con los genotipos de las líneas de mosca utilizadas, y cambie las placas por otras nuevas.
Nota: El exceso de pasta de levadura se puede raspar de la placa en este paso. Los embriones se pueden envejecer en las placas a 25 ° C oa temperatura ambiente para obtener la ventana deseada de tiempo de desarrollo. - Añadir suficiente agua tO cubrir cada placa de AJ. Suavemente desalojar los embriones de la placa con un cepillo de pintura suave (cabeza plana de aproximadamente 10 mm de ancho funciona bien para placas grandes). Verter los embriones en el recipiente de malla previamente pesado y marcado, y drenar el exceso de agua.
- Si es necesario, realice un segundo enjuague y cepillado de la placa para eliminar todos los embriones. Combine los embriones de placas adicionales para la misma línea de mosca en el mismo recipiente de malla.
- Baje brevemente la malla sobre toallas de papel para eliminar el exceso de agua.
6. Dechorionation del embrión
- Llenar a medias una placa de Petri de 6 cm con un 50% de lejía (solución vol / vol en agua).
Nota: Véase un comentario importante sobre la marca de blanqueador en la Tabla de Materiales y Reactivos.
Precaución: Use guantes y evite que se leque la ropa. - Prepare 2 platos Petri más grandes con agua.
- Sumerja el contenedor de malla con embriones en lejía al 50% durante 90 s. Toque suavemente la malla durante el incuUn par de veces para suspender los embriones en la solución de lejía.
- Al final de la incubación de los 90 s, lavar el recipiente de malla en cada uno de los 2 platos con agua durante aproximadamente 10 s.
- Enjuague bien el recipiente de malla con 18,2 MΩ · cm de agua usando la botella de chorros. También, lave los lados y el exterior del contenedor de malla.
Nota: No se debe detectar ningún olor a blanqueo después de un lavado cuidadoso. - Seque el recipiente de malla sobre toallas de papel. Pesar el recipiente de malla con los embriones y restar el peso del recipiente vacío obtenido en el paso 5.6. Registre el peso resultante de los embriones. Una buena cantidad de embriones para apuntar es 0.5 - 1 g.
7. Preparación del extracto de embrión
- Añadir 1 ml de tampón de lisis con inhibidores de proteasa (del paso 5.7) a un homogeneizador de vidrio dounce y mantenerlo sobre hielo. Transferir los embriones del contenedor de malla al homogeneizador.
Nota: Los embriones pueden ser recogidos con un extremo plano.Fa espátula de metal o un cepillo y se transfiere directamente en el buffer. Realice todos los pasos de esta sección en hielo. - Lavar los embriones restantes en la malla con un tampón de lisis adicional de 1 ml y agregar al material en el homogeneizador. Deje que los embriones se establezcan hasta el fondo del homogeneizador, y aspiren cuidadosamente el sobrenadante.
- Añadir tampón de lisis con inhibidores de proteasa (del paso 5.7) al homogeneizador, con el objetivo de 5-6 ml de tampón de lisis por gramo de embriones.
- Homogeneizar los embriones por 4-6 golpes con un pilón de ajuste holgado.
Nota: Durante los primeros golpes, habrá más resistencia. Trate de mover el mazo en un movimiento continuo para evitar salpicar la solución. - Homogeneizar los embriones de 8-10 golpes con un mazo de ajuste apretado.
- Incubar el homogeneizado en hielo durante 20 min.
- Transferir el homogeneizado en tubos de microcentrífuga y centrifugar a 4 ° C durante 15 minutos a velocidad máxima (aproximadamente 13.000 xg).
- EvitaLos gránulos y la capa lipídica superior, transferir los sobrenadantes a tubos de microcentrífuga frescos y centrifugar a 4 ° C durante 15 minutos a velocidad máxima (aproximadamente 13.000 xg).
- Aspirar cuidadosamente los sobrenadantes con una punta de 1 ml y cargarlos en jeringas refrigeradas de 10 ml con filtros de 0,45 μm unidos (combinar alícuotas de la misma muestra en una jeringa). Empuje toda la solución en un tubo de 15 ml marcado sobre hielo. El extracto puede utilizarse inmediatamente para experimentos subsiguientes de purificación de proteínas o congelarse instantáneamente en nitrógeno líquido y mantenerse a -80 ° C para uso futuro.
Nota: Es mejor congelar los extractos en lugar de los embriones, porque durante la descongelación posterior de los embriones las proteasas pueden activarse y provocar la degradación de las proteínas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para ilustrar el uso de este protocolo en un experimento de purificación de complejos de proteínas, se generó una línea de mosca viable homocigótica, brazo-EGFP-ERK , que expresa EGFP marcado con Drosophila extracelular señal regulada quinasa (ERK, codificado por el rollo de genes) bajo el control De un promotor de armadillo ( brazo ) expresado de forma ubicua 18 , 19 . El promotor del brazo es activo durante la mayoría de los estadios de la embriogénesis de Drosophila [ 19] . Los lisados se prepararon usando el protocolo descrito y la expresión de la proteína del transgén EGFP-ERK de brazo fue confirmada por Western blotting para la proteína ERK total para detectar simultáneamente los niveles de EGFP-ERK endógeno y transgénico, migrando a 42 kDa y 69 kDa , Respectivamente ( Figura 2A ). Una única banda correspondiente a ER endógeno no marcado Se detectó K (42 kDa) en la línea de control yw . Este resultado confirma una exitosa extracción de ERK y EGFP-ERK de embriones.
Para probar si nuestro protocolo de extracción es adecuado para la posterior purificación de una proteína marcada, los extractos de la yw y el brazo-EGFP-ERK moscas fueron sometidos a la purificación por afinidad utilizando GFP-agarosa cuentas siguiendo los protocolos establecidos 10 , 11 . La tinción con plata de muestras corrientes en un gradiente SDS-PAGE mostró una purificación exitosa de la proteína cebo, EGFP-ERK ( Figura 2B ). Además del EGFP-ERK, el carril experimental contenía bandas adicionales que no se observaron en la muestra de control yw , lo que sugiere que el procedimiento de purificación recuperó proteínas potenciales que interactuaban con ERK.
"Src =" / files / ftp_upload / 55804 / 55804fig1.jpg "/>
Figura 1 : Preparación de jaulas de población. ( A - D ) Una jaula de 5 L hecha de un recipiente de plástico. ( A ) Un recipiente de partida. ( B ) Vista inferior de la jaula de 5 l. ( C ) Vista superior de la jaula de 5 L con malla adjunta. ( D ) Cuna ensamblada de 5 L con una placa de jugo de manzana de 15 cm, vista inferior. ( E y F) Una broca de 3 pulgadas (76 mm) usada para perforar agujeros en el contenedor de 1 L. ( G , H ) Una jaula de 1 l. ( G ) Vista superior de una jaula de 1 L con malla adherida. ( H ) Cuna ensamblada de 1 L con una placa de jugo de manzana de 10 cm unida, vista inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El protocolo presentado aquí es un procedimiento simple y general para establecer jaulas de población de Drosophila a escala media y hacer extractos de proteína de células enteras de embriones. Los extractos resultantes pueden usarse en una variedad de aplicaciones aguas abajo, tales como la purificación de complejos de proteínas sobre resinas de afinidad. Es crítico realizar los pasos de extracción en hielo y utilizar una fuerte inhibición de la proteasa, para minimizar la degradación de la proteína. Tal como se ha descrito, el protocolo es adecuado para el aislamiento de la mayoría de las proteínas nucleares citoplasmáticas y algunas membranas y solubles 6 , 10 , 12 , 15 . Puede adaptarse fácilmente para una purificación más enfocada de las proteínas de otros compartimentos, como el aislamiento de proteínas nucleares menos solubles usando una alta extracción de sales 5 . Como se mencionó en el paso 5.8, los tiempos de recolección y los períodos deEstablecidos en intervalos precisos para obtener diferentes etapas de desarrollo.
A menudo es deseable comprobar que la proteína marcada de interés se expresa en niveles que se corresponden estrechamente con los niveles endógenos de expresión, como se ha mostrado utilizando el anticuerpo anti-ERK total ( Figura 2A ). Si el anticuerpo contra la proteína endógena no está disponible, la funcionalidad de los constructos puede ser verificada por otros ensayos, por ejemplo , en un experimento de rescate genético. Sin embargo, en la mayoría de los casos, una sobreexpresión leve de la proteína marcada debe resultar en el aislamiento de complejos proteínicos significativos, y de hecho puede facilitar la extracción y purificación de proteínas "difíciles".
La principal ventaja de este protocolo es su simplicidad y la posibilidad de configurar todo el procedimiento a un costo moderado. Una ventaja adicional de utilizar jaulas más pequeñas es que se pueden establecer múltiples líneas transgénicas y analizarlas en paraleloL, lo que puede no ser factible cuando se utilizan jaulas de mayor tamaño. Las jaulas de moscas que describimos aquí se pueden limpiar y reutilizar fácilmente durante años. En lugar de hacer jaulas de 1-L de jarras Nalgene como se describe, es posible utilizar otros contenedores disponibles, como una versión más pequeña del contenedor de 5-L.
Hemos utilizado con éxito este protocolo (o sus variaciones con pequeñas modificaciones) para purificar complejos que contienen varias proteínas de señalización y componentes asociados, seguido de análisis por espectrometría de masas [ 6 , 10 , 15] . Estos enfoques han llevado a la identificación de nuevos PPIs que fueron más validados en estudios funcionales [ 10 , 15] . Las variaciones del protocolo presentado aquí se han utilizado previamente para analizar el fosfoproteoma en la embriogénesis Drosophila 20 , y para estudiar el paisajeDe la ubiquitinación en el desarrollo neuronal 21 , 22 . Por lo tanto, este procedimiento representa una puerta de enlace conveniente para analizar PPI in vivo , y es utilizable para otras aplicaciones de proteómica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de Veraksa comentarios útiles sobre el manuscrito y sugerencias para mejorar el protocolo. AV fue apoyado por el NIH subvenciones GM105813 y NS096402. LY recibió el apoyo de la Universidad de Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
References
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
