Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Medium-skala forberedelse av Published: May 30, 2017 doi: 10.3791/55804
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Biology Department, University of Massachusetts Boston, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego

Summary

Målet med denne protokollen er å gi en enkel og billig tilnærming til å samle Drosophila- embryoer i medium skala (0,5-1 g) og forberede proteinekstrakter som kan brukes i nedstrøms proteomiske applikasjoner, slik som affinitetsrensings-massespektrometri (AP-MS ).

Abstract

Analyse av protein-protein-interaksjoner (PPI) har blitt en uunnværlig tilnærming til å studere biologiske prosesser og mekanismer, som celle-signalering, organisasjonsutvikling og sykdom. Det er ofte ønskelig å skaffe PPI-informasjon ved bruk av in vivo materiale, for å få mest naturlig og upartisk syn på samhandlingsnettene. Fruktfluen Drosophila melanogaster er en utmerket plattform for å studere PPIer in vivo , og gir seg til rette tilnærminger til isolerende materiale for biokjemiske eksperimenter. Spesielt fruktfruktembryoer representerer en praktisk type vev for å studere PPI, på grunn av enkel samling av dyr i denne utviklingsstadiet og det faktum at flertallet av proteiner uttrykkes i embryogenese, og derved gir et relevant miljø for å avsløre de fleste PPI. Her presenterer vi en protokoll for samling av Drosophila- embryoer i medium skala (0,5-1 g), som er et ideelt beløp for et bredt spekter avProteomiske applikasjoner, inkludert analyse av PPI ved affinitetsrensing-massespektrometri (AP-MS). Vi beskriver våre design for 1 L og 5 L bur for embryo samlinger som kan enkelt og billig settes opp i et hvilket som helst laboratorium. Vi gir også en generell protokoll for embryoinnsamling og proteinutvinning for å generere lysater som kan brukes direkte i nedstrømsapplikasjoner som AP-MS. Vårt mål er å gi en tilgjengelig måte for alle forskere å utføre analysene av PPI i in vivo .

Introduction

Genetiske skjermbilder, og mer nylig har genomiske tilnærminger revolusjonert studiet av biologiske funksjoner. Imidlertid er viktig cellular informasjon kodet i proteiner og deres ensemble av samspillende partnere. Mens tradisjonelle genetiske modifiseringsskjermbilder kan identifisere hastighetsbegrensende banekomponenter og gjenopprette indirekte interaksjoner, ligger styrken av de proteomiske tilnærmingene i deres evne til å identifisere komplette interaktive nettverk av proteiner av interesse. Proteomikk er således en verdifull ortogonal metode for å studere biologiske systemer, og utfyller genomics, transkriptomics og tradisjonelle genetiske skjermbilder. Affinitetsrensnings-massespektrometri (AP-MS) har vist seg å være en kraftig tilnærming til å studere protein-protein-interaksjoner (PPI) i deres opprinnelige miljø i celler og vev 1 , 2 . Denne metoden gjør det mulig å identifisere direkte eller indirekte interaksjoner ved spesifikk utviklingAl-stadier eller vevskontekster, og har med hell blitt brukt til å identifisere flere nye PPIer i en rekke utviklingsveier (vurdert i referanse 1 ). Til tross for den ubestridte suksessen til PPI-studier, har de fleste blitt utført i dyrkede celler, hvor "agn" -proteiner av interesse var overuttrykt. Det er to problemer med å studere PPIer i cellekultur: For det første kan en bestemt cellelinje ikke gi et komplett komplement av interaksjoner på grunn av mangel på ekspresjon av visse proteiner. For det andre kan høy overekspresjon som vanligvis brukes i slike analyser føre til gjenstander som protein misfolding eller identifisering av falske positive interaksjoner.

Begge disse begrensningene kan overvindes ved å analysere PPIer in vivo . Et begrensende trinn i slike eksperimenter er tilgjengeligheten av utgangsmaterialet for rensing av proteinkomplekser. Drosophila melanogaster har lenge vært brukt som en modell for funksjonell analyseSis, og nylig har det også vist seg å være et utmerket system for å studere PPIer in vivo . Drosophila- embryogenese representerer en spesielt attraktiv vevstype for å studere PPI, fordi embryoer lett kan samles i store mengder, og også fordi de fleste gener (> 88%) uttrykkes i løpet av embryogenese, og derved gir et rikt in vivo miljø for å oppdage relevant PPI 3 .

Tradisjonelt benyttet biokjemiske studier i fluer svært store embryo samlinger (100-150 g), slik som de som er nødvendige for rensing av funksjonelle transkriptionelle lysater 4 , 5 . Tidligere AP-MS-studier i Drosophila trengte også store mengder embryoer (5-10 g), fordi de var avhengige av en to-trinns rensingstilnærming som tandemaffinitetsrensing (TAP), med tilhørende tap av materiale i hvert trinn 6 . Stor amounTs av startmateriale nødvendiggjorde oppsett av embryo samlinger i store befolkning bur, som kan være både dyrt (når kjøpt kommersielt) og tidkrevende å vedlikeholde og rense 7 , 8 , 9 .

Nylige fremskritt i utviklingen av en-trinns affinitetsrensingsmetoder, samt den økende følsomheten til massespektrometre, har redusert den nødvendige mengde utgangsmateriale med en størrelsesorden. Ved å bruke merker som streptavidinbindende peptid (SBP) eller grønt fluorescerende protein (GFP) og starter fra mindre enn 1 g embryoer, er det mulig å isolere mengder av agnprotein og interaksjonskomponenter som ville være tilstrekkelige for identifisering av Massespektrometri 10 , 11 .

Målet med protokollen som presenteres her er å hjelpe forskerne overcoMeg en oppfattet barriere for biokjemisk analyse av PPIer in vivo . Til dette formål gir vi en enkel og billig prosedyre for å samle Drosophila- embryoer i medium skala (0,5-1 g), etterfulgt av en-trinns fremstilling av helcelleproteinekstrakter som er egnet for etterfølgende analyse av AP-MS eller andre tilnærminger . Vår metode er avhengig av bruk av skreddersydde 1-L eller 5-L populasjonsbur som enkelt kan produseres av ethvert laboratorium. Videre er de ekstraksjonsbetingelsene som er presentert her, validert i flere studier, både i dyrkede celler og in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av 5 L Fly Cages (å passe 15 cm Plates)

  1. Hent nødvendige materialer: 5-kvarts (4,7-L) beholder med lokk ( figur 1A ), nylon nett og et knivblad.
  2. Marker en 12 cm diameter sirkel og kutt et hull i bunnen av beholderen ved hjelp av knivbladet ( Figur 1B ). Klipp et hul på 15 cm i lokket ( figur 1C ).
  3. Klipp nylonnett i 25 x 25 cm firkanter.
  4. Plasser nettverket over beholderens øverste kant og trykk ned med lokket ( figur 1C ). Pass på at masken er tett og lokket ikke vippes. Buren er klar til å bli befolket med fluer (se trinn 5.3).

2. Forberedelse av 1 L Fly Cages (for å passe 10 cm Plates)

  1. Hent nødvendige materialer: en elektrisk borer, et 3-tommers (76 mm) skjæreverktøy ( Figur 1E og FIgure 1F), en 1-sidig plastkanne med lokk, nylonmaske, et knivblad, sandpapir, beskyttelsesbriller og arbeidshansker.
  2. Klipp 3 tommer (76 mm) hull i bunnen og lokket på plastkrukken ( figur 1G ), med lokket tett skrudd på beholderen under boring. Plasser skjæreverktøyet midt i sirkelen når du begynner å lage et hull.
    Forsiktig: Bruk øyevern og arbeidshansker under dette trinnet.
  3. Glatt kantene på hullene med et knivblad og sandpapir.
  4. Klipp nylonnett i 18 x 18 cm firkanter.
  5. Plasser masken over den øvre kanten av krukken og stram ved å skru på lokket på ( Figur 1G ). Pass på at masken er tett og lokket ikke vippes. Buren er klar til å bli befolket med fluer (se trinn 5.3).

3. Tilberedning av appelsinjuice (AJ) plater

  1. Tilsett 19 g agar og 1 liter 18,2 MΩ · cm vann i en 2 L-kolbe.Legg til en omrøringsbjelke, og bland kort.
  2. Autoklav i 30 min. I mellomtiden tine 100% eplejuice konsentrat fra frosset lager, og lag 10 ml 10% (vekt / volum) metyl 4-hydroksybenzoatoppløsning i etanol.
  3. Etter autoklavering begynner du å blande agaret på en omrøringsplate og tilsett kolben med 80 ml 100% eplejuice konsentrat og 10 ml 10% (vekt / volum) metyl 4-hydroksybenzoatoppløsning. La avkjøles ved romtemperatur med konstant blanding.
  4. Hell 15 cm petriskål (til 5 liter bur) eller 10 cm petriskål (for 1 liter bur) slik at agarnivået i hver tallerken er ca 5 mm tykt. Tillat å størkne ved romtemperatur, og pakk i plastposer. AJ-plater kan lagres ved 4 ° C i to uker.
    Merk: Petriskålene kan vaskes og gjenbrukes.
  5. Forbered våt gjærpasta: Hell litt aktiv tørr gjær i en 100 ml beholder med et lokk som muliggjør enkel blanding og tilsett vann i små mengder under omrøring for å oppnå en tykk, men grundig blandetlim inn. Oppbevares ved 4 ° C i opptil 2 uker.

4. Fremstilling av lysisreagenser

  1. Forbered 5x lysisbuffer: 250 mM Tris pH 7,5, 25% glycerol, 1% oktylfenoksypoly (etylenoksy) etanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl2, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na3VO4.
    1. For å gjøre 200 ml: oppløs 1 g NaF pulver og 184 mg Na 3 VO 4 pulver i 71 ml vann med konstant omrøring. Tilsett 50 ml 1 M Tris pH 7,5, 2 ml 100% IGEPAL, 1,5 ml 1 M MgCl2 og 25 ml 5 M NaCl. Deretter tilsettes 50 ml glycerol (tilsettes sist) og fortsett omrøring i 1 time.
    2. Filtrer-steriliser ved bruk av 250 ml filterenheter. Dette trinnet kan være sakte, men filtrering av løsningen er viktig for å fjerne uoppløselige partikler. Aliquot med 10 ml i 50 ml rør og lagre ved -80 ° C.
  2. Tilbered 1 M ditiotreitol (DTT) oppløsning i vann. Oppbevares ved -20 ° C i 1 ml alikvoter.
  3. Skaff proteAse inhibitor cocktail tabletter, med etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Oppbevares ved 4 ° C.
  4. Skaff 10 ml sprøyter og sprøytefiltre: 26 mm diameter, overflateaktivt-fri celluloseacetat (SFCA) -membran, 0,45 μm porestørrelse.

5. Innsamling av Fly Embryoer

  1. Forsterk transgene flygelinjer som bærer det merkede proteinet av interesse for flasker (ca. 100 fluer per flaske), og overfør flasker hver 2 dager til 25-30 flasker akkumuleres for hver flygelinje. Forsterk styrestammen ( f.eks . Yw- linjen) på lignende måte.
  2. Varm AJ-plater til romtemperatur (ca. 1-2 timer, kan gjøres over natten). Bruk en skinnfinger, spred litt våt gjærpasta i midten av AJ-platene, for å lage en ca. 6-cm sirkel for en 15 cm plate og en 4 cm sirkel for en 10 cm plate.
  3. Bedøve fluene med en flyt av karbondioksid ved å bruke en standard Drosophila-faseoppsett , og overfør tilBurene (ca. 15 velvoksede flasker fluer per 5 liter bur, 5 flasker per 1 liter bur).
    1. Dekk bunnbunnen med forberedte AJ-plater fra trinn 5.2, og fest AJ-platen til buret ved å bruke to båndbånd ( fig. 1D og 1H ). Det er nyttig å brette seg over spissene på båndet som går over platen for lett peeling når du bytter plater.
    2. Etter at fluene kommer fra narkose, behold burene med platene på bunnen og maske på toppen.
      Merk: Det er viktig å vente til flyene helt gjenoppretter, da de ellers vil holde seg til AJ-platen og gjærpastaen.
    3. På slutten av forsøket, for å forberede buret for rengjøring, plasser buret i fryseren i flere timer. Soaking nettverket i vann i noen timer vil lette rengjøring.
  4. Inkuber burene med fluer ved romtemperatur i 2-3 dager og bytt AJ-plater to ganger om dagen. For å bytte platene, vri buret opp ned,Skal båndet fra platen, men hold platen til buret, trykk hele buret forsiktig på benken, og bytt den gamle platen raskt til en ny, og prøv å ikke tillate fluer å unnslippe.
    Merk: Fluer må justeres til buret og vil ligge best fra dag 3. De vil fortsette å ligge på toppnivå i ca 4-5 dager. To 5 l bur på topplagringskapasitet kan produsere opptil 1 g embryoer i en overnattingssamling. Bruk 1 liter bur for mindreforsøk.
  5. Tillat fluer å legge embryoer på friske AJ-plater over natten (ca. 16 timer), eller for en hvilken som helst annen ønsket tid.
  6. Neste morgen markere og veie maskebeholdere for embryoinnsamling, en per hver flylinje som brukes.
  7. Forbered 1x lysisbuffer ved bruk av reagenser fra seksjon 4 (Merk: 1x lysisbuffer som er klar til bruk, må fremstilles like før ekstraksjon): Tilsett 40 ml vann til 10 ml 5x konsentrert lysisbuffer (lagret ved -80 ° C) I et 50 ml rør.
    1. Tilsett 50 μl 1 MDTT til en endelig konsentrasjon på 1 mM, bland godt og separer i to 50 ml rør, 25 ml i hver. Til ett av rørene, tilsett en proteasehemmertablett og roter ved 4 ° C i 30 minutter. Mens tabletten løser opp, samler og dekargerer embryoer (trinn 5.8 til 6.6). Kontroller at tabletten er fullstendig oppløst, og hold bufferen på isen.
      Merk: Det andre røret med 1x buffer med DTT kan lagres ved -80 ° C og vil bare kreve tillegg av tabletten før neste forsøk. 25 ml lysisbuffer er tilstrekkelig for opptil 2 prøver, med tanke på etterfølgende vasker under proteinrensingstrinn.
  8. Merk AJ-platene på burene med genotyper av de brukte flygelinjene, og bytt platene til friske.
    Merk: Overskridende gjærpasta kan skrapes av platen på dette trinnet. Embryoer kan bli alderen på platene ved 25 ° C eller romtemperatur for å oppnå det ønskede vindusvinduet.
  9. Legg til nok vann tO dekk hver AJ plate Fjern forsiktig embryoerene fra platen med en myk pensel (flat hode ca 10 mm brede fungerer godt for store plater). Hell embryoene i den tidligere veide og merkede nettbeholderen, og tøm overflødig vann.
    1. Hvis nødvendig, utfør en ny skylning og børsting av platen for å fjerne alle embryoer. Kombiner embryoer fra ytterligere tallerkener for samme flygelinje i samme maskebeholder.
  10. Slett nettverket på papirhåndklær for å fjerne overflødig vann.

6. Embryo Dekkerionering

  1. Halvfyll en 6 cm petriskål med 50% blekemiddel (vol / vol oppløsning i vann).
    Merk: Se viktig kommentar om blekemerket i materialet og reagensene.
    Forsiktig: Bruk hansker og unngå å få blekemiddel på klær.
  2. Forbered 2 større petriskål med vann.
  3. Demp nettbeholderen med embryoer i 50% blekemiddel i 90 s. Tapp nettverket forsiktig under inkuBation et par ganger for å suspendere embryoene i blekemiddelløsningen.
  4. På slutten av 90 s inkubering, vask masken beholderen i hver av de 2 servantene med vann i ca 10 s.
  5. Skyll nettbeholderen grundig med 18,2 MΩ · cm vann ved hjelp av sprøyteflasken. Vask også sidene og utsiden av maskebeholderen.
    Merk: Ingen blekluft bør oppdages etter grundig vask.
  6. Ta av nettbeholderen på papirhåndklær. Veie nettbeholderen med embryoene og trekk vekten av den tomme beholderen oppnådd i trinn 5.6. Registrer den resulterende vekten av embryoer. En god mengde embryoer å sikte på er 0,5 - 1 g.

7. Fremstilling av embryoekstrakt

  1. Tilsett 1 ml lysisbuffer med proteasehemmere (fra trinn 5.7) til en dounce glasshomogenisator og hold den på is. Overfør embryoene fra maskebeholderen inn i homogenisatoren.
    Merk: Embryoer kan plukkes opp med en flat ende oFa metallspatel eller en børste og overføres direkte inn i bufferen. Utfør alle trinnene i denne delen på is.
  2. Vask de resterende embryoene på masken med en ytterligere 1 ml lysisbuffer og legg til materialet i homogenisatoren. La embryoene slå seg ned til bunnen av homogenisatoren og aspirer forsiktig opp supernatanten.
  3. Tilsett lysisbuffer med proteaseinhibitorer (fra trinn 5.7) til homogenisatoren, med sikte på 5-6 ml lysisbuffer pr. Gram embryoer.
  4. Homogeniser embryoene med 4-6 slag med en løs monteringstempel.
    Merk: Under de første slagene vil det være mer motstand. Prøv å flytte pestelen i en kontinuerlig bevegelse for å unngå å sprute løsningen.
  5. Homogeniser embryoer med 8-10 slag med en tett monteringstempel.
  6. Inkubér homogenatet på is i 20 minutter.
  7. Overfør homogenatet i mikrocentrifugerør og sentrifuger ved 4 ° C i 15 minutter ved topphastighet (ca. 13.000 xg).
  8. AvoidiNg pellets og topplipidlaget, overfør supernatantene til friske mikrocentrifugerør og centrifuger ved 4 ° C i 15 minutter ved topphastighet (ca. 13.000 xg).
  9. Sug forsiktig opp supernatanter med 1 ml spiss og legg i kule 10 ml sprøyter med 0,45 μm filtre festet (kombinere alikvoter av samme prøve i en sprøyte). Skyv all oppløsning i et merket 15 ml rør på is. Ekstrakten kan umiddelbart brukes til etterfølgende proteinrensningseksperimenter eller snapsfrosses i flytende nitrogen og holdes ved -80 ° C til senere bruk.
    Merk: Det er bedre å fryse ekstraktene i stedet for embryoene, fordi proteaser kan bli aktivert under etterfølgende tining av embryoer og føre til nedbrytning av protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å illustrere bruken av denne protokollen i et proteinkompleksrensingseksperiment, genererte vi en homozygot levedyktig flygel, arm-EGFP-ERK , som uttrykte EGFP-merket Drosophila ekstracellulær signalregulert kinase (ERK, kodet av det rullede gen) under kontrollen Av en ubiquitously uttrykt armadillo ( arm ) promotor 18 , 19 . Armpromotoren er aktiv i de fleste stadier av Drosophila- embryogenese 19 . Lysater ble fremstilt under anvendelse av den beskrevne protokoll, og ekspresjonen av armen fra EGFP-ERK- transgenet fra armen ble bekreftet ved western blotting for totalt ERK-protein for samtidig å detektere nivåene av endogen og transgen EGFP-ERK, migrerende ved 42 kDa og 69 kDa , Henholdsvis ( figur 2A ). Et enkeltbånd som svarer til untagged endogen ER K (42 kDa) ble detektert i yw kontrolllinjen . Dette resultatet bekrefter en vellykket utvinning av ERK og EGFP-ERK fra embryoer.

For å teste om utvinningsprotokollen er egnet for etterfølgende rensing av et merket protein, ble ekstrakter fra yw- og arm-EGFP-ERK- fluene utsatt for affinitetsrensing ved anvendelse av GFP-agarosekuler etter etablerte protokoller 10 , 11 . Sølvfarging av prøver som kjøres på en gradient SDS-PAGE viste en vellykket rensing av agnproteinet, EGFP-ERK ( figur 2B ). Foruten EGFP-ERK selv inneholdt den eksperimentelle bane ytterligere bånd som ikke ble observert i kontroll- yw- prøven, og antyder at rensingsprosedyren gjenvunnet potensielle ERK-interaksjonsproteiner.

"Src =" / files / ftp_upload / 55804 / 55804fig1.jpg "/>
Figur 1 : Fremstilling av populasjonsburger. ( A - D ) En 5-L-bur laget av en plastbeholder. ( A ) En startbeholder. ( B ) Nederst i 5 l-buret. ( C ) Sett ovenfra på 5 l bur med mesh festet. ( D ) Montert 5 liter bur med en 15 cm eplejuiceplate, bunnutsikt. ( E og F) En 3-tommers (76 mm) borekrone som brukes til boring av hull i 1 L-beholderen. ( G , H ) En 1 liter bur. ( G ) Sett ovenfra på et 1 l-bur med mesh festet. ( H ) Montert 1 L bur med en 10 cm eplejuiceplate festet, bunnutsikt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2 : Ekstraksjon og rensing av EGFP-ERK fra embryoer. ( A ) Western blot som viser uttrykk for EGFP-ERK og endogen ERK i et ekstrakt fremstilt fra den arm-EGFP-ERK transgene linjen. Yw- linjen ble brukt som en kontroll. Grønn, totalt ERK antistoff; Rød, molekylvektmarkør. ( B ) Sølvfarget gel som viser renset EGFP-ERK og tilhørende proteiner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som presenteres her er en enkel og generell prosedyre for å sette opp Drosophila- populasjonsbur på medium skala og lage helcelleproteinekstrakter fra embryoer. De resulterende ekstraktene kan anvendes i en rekke nedstrømsapplikasjoner, slik som rensing av proteinkomplekser på affinitetsharpikser. Det er kritisk å utføre ekstraksjonstrinnene på is og bruk sterk proteaseinhibering for å minimere proteinforringelse. Som beskrevet er protokollen egnet for isolering av de fleste cytoplasmatiske og noen membran og oppløselige nukleære proteiner 6 , 10 , 12 , 15 . Det kan lett tilpasses for en mer fokusert rensing av proteiner fra andre rom, slik som isolering av mindre oppløselige nukleære proteiner ved bruk av høysaltekstraksjon 5 . Som nevnt i trinn 5.8 kan samlingstider og embryo aldringsperioder væreSette opp med presise intervaller for å oppnå forskjellige utviklingsstadier.

Det er ofte ønskelig å fastslå at det merkede protein av interesse er uttrykt i nivåer som nærmer seg de endogene ekspressjonsnivåer, som vi har vist ved å bruke anti-totalt ERK-antistoff ( figur 2A ). Hvis antistoffet mot endogent protein ikke er tilgjengelig, kan konstruksjonens funksjonalitet verifiseres ved andre analyser, f.eks. I et genetisk redningseksperiment. I de fleste tilfeller bør imidlertid en mild overekspresjon av det merkede protein fortsatt resultere i isolering av meningsfulle proteinkomplekser, og kan faktisk lette utvinning og rensing av "vanskelige" proteiner.

Den største fordelen med denne protokollen er dens enkelhet og mulighet til å sette opp hele prosedyren til moderat pris. En ekstra fordel ved å bruke mindre bur er at flere transgene linjer kan settes opp og analyseres i paralleL, som kanskje ikke er mulig når du bruker større bur. Flygeburene som vi beskriver her, kan enkelt rengjøres og gjenbrukes i årevis. I stedet for å lage 1-L bur fra Nalgene krukker som beskrevet, er det mulig å bruke andre tilgjengelige beholdere, for eksempel en mindre versjon av 5-L beholderen.

Vi har med hell brukt denne protokollen (eller dens variasjoner med små modifikasjoner) for rensing av komplekser som inneholder forskjellige signalproteiner og tilhørende komponenter, etterfulgt av analyse ved massespektrometri 6 , 10 , 15 . Disse tilnærmingene har ført til identifisering av nye PPI som ble ytterligere validert i funksjonelle studier 10 , 15 . Variasjoner av protokollen presentert her har tidligere blitt brukt til å analysere fosfoproteomet i Drosophila embryogenese 20 , og å studere landskapetAv ubiquitination i nevrale utvikling 21 , 22 . Denne prosedyren representerer derfor en praktisk gateway for å analysere PPIer in vivo , og kan brukes til andre proteomikapplikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker medlemmer av Veraksa-laboratoriet for nyttige kommentarer om manuskriptet og forslag til protokollforbedringer. AV ble støttet av NIH-tilskuddene GM105813 og NS096402. LY ble støttet av University of Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Doctoral fellesskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) Home Depot 209330 For making 5-L cages.
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) Home Depot 209320 Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm Fisher Scientific FB0875714 Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm Fisher Scientific FB0875713A Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.
Sefar NITEX nylon mesh Sefar 03-180/44 180 micron, 44% open area, used for fly cages.
Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor Home Depot 49-56-9670 3 inch cutting tool for making 1-L cages.
Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure Fisher Scientific 11-823-33 For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.
Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch Red Star  can be purchased from Amazon.com or other suppliers.
Frozen 100% Apple Juice Concentrate  can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can.
Methyl 4-hydroxybenzoate Acros Organics AC126965000 also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.
IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml Sigma I8896 used for preparing lysis buffer.
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane  Fisher Scientific 09-740-2A 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.
Corning SFCA syringe filters  Fisher Scientific 09-754-21 SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples.
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles Fisher Scientific 14-823-2A for filtering final extract samples. BD cat # 309604.
Bleach Clorox used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.
Corning Costar Netwell Plates Fisher Scientific 07-200-213 mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well.
Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml Fisher Scientific 06-435B homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
  2. Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
  3. Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
  4. Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
  5. Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
  6. Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
  7. Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
  8. Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
  9. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
  10. Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
  11. Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).
  12. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
  13. Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
  14. Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
  15. Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).
  16. Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
  17. Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
  18. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  19. Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
  20. Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
  21. Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
  22. Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 123 ekstrakt lysat protein, Fruktfly embryo proteomics middels skala rensing bur
Medium-skala forberedelse av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoekstrakter for proteomiske eksperimenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne,… More

Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne, S., Kyriakakis, P., Veraksa, A. Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55804, doi:10.3791/55804 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter