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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Préparation à moyen terme de Published: May 30, 2017 doi: 10.3791/55804
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Biology Department, University of Massachusetts Boston, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego

Summary

Le but de ce protocole est de fournir une approche simple et peu coûteuse pour collecter des embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5-1 g) et préparer des extraits de protéines qui peuvent être utilisés dans des applications protéomiques en aval, telles que la purification par affinité, la spectrométrie de masse (AP-MS ).

Abstract

L'analyse des interactions protéines-protéines (IPP) est devenue une approche indispensable pour étudier les processus et mécanismes biologiques, tels que la signalisation cellulaire, le développement de l'organisme et la maladie. Il est souvent souhaitable d'obtenir des informations PPI en utilisant du matériel in vivo , afin d'obtenir la vision la plus naturelle et la plus imparfaite des réseaux d'interaction. La mouche des fruits Drosophila melanogaster est une excellente plate-forme pour étudier les IPP in vivo et se prête à des approches directes pour isoler le matériel pour les expériences biochimiques. En particulier, les embryons de mouche des fruits représentent un type de tissu approprié pour étudier les PPI, en raison de la facilité de collecte des animaux à cette étape de développement et du fait que la majorité des protéines sont exprimées dans l'embryogenèse, fournissant ainsi un environnement pertinent pour révéler la plupart des IPP. Nous présentons ici un protocole pour la collecte d'embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5 à 1 g), ce qui constitue un montant idéal pour une large gamme deApplications protéomiques, y compris l'analyse des IPP par spectrométrie de masse par purification par affinité (AP-MS). Nous décrivons nos modèles pour les cages 1 L et 5 L pour les collections d'embryons qui peuvent être facilement et peu coûteuses dans n'importe quel laboratoire. Nous proposons également un protocole général pour la collecte des embryons et l'extraction des protéines pour générer des lysats qui peuvent être utilisés directement dans les applications en aval telles que l'AP-MS. Notre objectif est de fournir un moyen accessible à tous les chercheurs d'effectuer les analyses des IPP in vivo .

Introduction

Les écrans génétiques et, plus récemment, les approches génomiques ont révolutionné l'étude des fonctions biologiques. Cependant, des informations cellulaires importantes sont codées dans les protéines et leur ensemble de partenaires en interaction. Alors que les écrans modificateurs génétiques traditionnels peuvent identifier les composants de la voie limitant le taux et récupérer les interactions indirectes, la force des approches protéomiques réside dans leur capacité à identifier des réseaux complets d'interactions immédiates de protéines d'intérêt. La protéomique est donc une méthode orthogonale précieuse pour étudier les systèmes biologiques et complète la génomique, la transcriptomie et les écrans génétiques traditionnels. La purification par affinité - la spectrométrie de masse (AP-MS) s'est révélée être une approche puissante pour étudier les interactions protéines-protéines (IPP) dans leur milieu naturel dans les cellules et les tissus 1 , 2 . Cette méthode permet d'identifier des interactions directes ou indirectes à un développement spécifiqueDes étapes ou des contextes tissulaires, et a été utilisée avec succès pour identifier de multiples IPP nouveaux dans une variété de voies de développement (examinées dans la référence 1 ). Malgré le succès incontesté des études PPI, la plupart d'entre elles ont été réalisées dans des cellules cultivées, dans lesquelles les protéines d'intérêt "appât" ont été surexprimées. Il existe deux problèmes avec l'étude des PPI dans la culture cellulaire: premièrement, une lignée cellulaire spécifique peut ne pas fournir un complément complet d'interactions en raison du manque d'expression de certaines protéines. Deuxièmement, une forte surexpression habituellement utilisée dans de telles analyses pourrait conduire à des artefacts tels que le repli des protéines ou l'identification d'interactions faussement positives.

Ces deux limites peuvent être surmontées en analysant les IPP in vivo . Une étape limitante dans de telles expériences est la disponibilité du matériau de départ pour la purification des complexes de protéines. Drosophila melanogaster a longtemps été utilisé comme modèle d'analyse fonctionnelleSis, et récemment, il a également été démontré qu'il s'agissait d'un excellent système d'étude des IPP in vivo . L'embryogenèse de Drosophila représente un type de tissu particulièrement attrayant pour étudier les IPP, car les embryons peuvent être facilement collectés en grandes quantités, et aussi parce que la plupart des gènes (> 88%) sont exprimés au cours de l'embryogenèse, fournissant ainsi un environnement riche in vivo pour détecter des facteurs pertinents PPI 3 .

Traditionnellement, les études biochimiques dans les mouches utilisaient des collections embryonnaires à très grande échelle (100-150 g), telles que celles nécessaires à la purification des lysats fonctionnels transcriptionnels 4 , 5 . Les études AP-MS antérieures chez Drosophila nécessitaient également de grandes quantités d'embryons (5-10 g), car elles reposaient sur une approche de purification en deux étapes telle que la purification par affinité en tandem (TAP), avec la perte de matériau associée à chaque étape 6 . Grand amounLe matériel de départ nécessitait la mise en place de collections d'embryons dans de grandes cages de population, ce qui peut coûter cher (lorsqu'ils sont achetés sur le marché) et long-temps pour maintenir et nettoyer 7 , 8 , 9 .

Les progrès récents dans le développement des approches de purification d'affinité à une étape, ainsi que la sensibilité croissante des spectromètres de masse, ont réduit la quantité nécessaire de matériau de départ d'un ordre de grandeur. En utilisant des marqueurs tels que le peptide de liaison à la streptavidine (SBP) ou la protéine fluorescente verte (GFP) et à partir de moins de 1 g d'embryons, il est possible d'isoler les quantités de protéines d'appât et les composants interactifs qui seraient suffisants pour l'identification par Spectrométrie de masse 10 , 11 .

L'objectif du protocole présenté ici est d'aider les chercheurs à surchargerMoi, une barrière perçue à l'analyse biochimique des IPP in vivo . À cette fin, nous proposons une procédure simple et peu coûteuse pour collecter des embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5 à 1 g), suivie d'une préparation en une étape d'extraits de protéines de cellules entières qui conviennent pour une analyse ultérieure par AP-MS ou d'autres approches . Notre méthode repose sur l'utilisation de cages de population sur mesure de 1-L ou 5-L qui peuvent être facilement produites par n'importe quel laboratoire. En outre, les conditions d'extraction présentées ici ont été validées dans plusieurs études, à la fois dans des cellules cultivées et in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

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Protocol

1. Préparation des cages à vapeur de 5 L (pour ajuster les plaques de 15 cm)

  1. Obtenir les matériaux nécessaires: récipient de 5-quart (4.7-L) avec couvercle ( Figure 1A ), maille en nylon et une lame de rasoir.
  2. Marquez un cercle de 12 cm de diamètre et coupez un trou dans le fond du récipient à l'aide de la lame de rasoir ( Figure 1B ). Couper un trou de 15 cm de diamètre dans le couvercle ( Figure 1C ).
  3. Couper le nylon en carrés de 25 x 25 cm.
  4. Placez le maillage sur le bord supérieur du récipient et appuyez vers le bas avec le couvercle ( Figure 1C ). Assurez-vous que le maillage est serré et que le couvercle n'est pas incliné. La cage est prête à être peuplée de mouches (voir l'étape 5.3).

2. Préparation des cages de mouche de 1 L (pour ajuster les plaques de 10 cm)

  1. Obtenez les matériaux nécessaires: une perceuse électrique, un outil de coupe de 3 pouces (76 mm) ( Figure 1E et FIgure 1F), un pot en plastique de 1 L droit avec couvercle, maille en nylon, une lame de rasoir, du papier de verre, des lunettes et des gants de travail.
  2. Couper les trous de 3 pouces (76 mm) dans le fond et le couvercle du bocal en plastique ( Figure 1G ), avec le couvercle bien vissé sur le récipient pendant le forage. Placez l'outil de coupe au centre du cercle en commençant à faire un trou.
    Attention: porter une protection oculaire et des gants de travail pendant cette étape.
  3. Lisser les bords des trous avec une lame de rasoir et du papier de verre.
  4. Couper le maille en nylon dans des carrés de 18 x 18 cm.
  5. Placez le maillage sur le bord supérieur du pot et serrez-le en vissant le couvercle ( Figure 1G ). Assurez-vous que le maillage est serré et que le couvercle n'est pas incliné. La cage est prête à être peuplée de mouches (voir l'étape 5.3).

3. Préparation des jus de pomme (AJ)

  1. Ajouter 19 g d'agar et 1 L de 18,2 MΩ · cm d'eau dans un flacon de 2 L.Ajouter une barre d'agitation, et mélanger brièvement.
  2. Autoclave pendant 30 min. Pendant ce temps, dégonflez 100% de concentré de jus de pomme à partir d'un concentré congelé et préparez 10 ml d'une solution de méthyl-4-hydroxybenzoate de méthyle à 10% (poids / volume) dans de l'éthanol.
  3. Après l'autoclavage, commencez à mélanger la gélose sur une plaque d'agitation et ajoutez 80 ml d'un concentré de jus de pomme à 100% et 10 ml d'une solution de 4-hydroxybenzoate de méthyle à 10% (poids / volume) dans le flacon. Laisser refroidir à température ambiante avec un mélange constant.
  4. Verser des boîtes de Petri de 15 cm (pour cages de 5 L) ou des boîtes de Petri de 10 cm (pour cages de 1 L) afin que le niveau d'agar dans chaque plat soit d'environ 5 mm d'épaisseur. Laisser se solidifier à température ambiante et enrouler dans des sacs en plastique. Les plaques AJ peuvent être conservées à 4 ° C pendant deux semaines.
    Note: Les boîtes de Petri peuvent être lavées et réutilisées.
  5. Préparer une pâte de levure humide: verser une levure sèche active dans un récipient de 100 ml avec un couvercle qui permettrait un mélange facile, et ajouter de l'eau dans de petites quantités en remuant, pour obtenir un mélange épais mais bien mélangécoller. Conservez à 4 ° C jusqu'à 2 semaines.

4. Préparation des réactifs de lyse

  1. Préparer un tampon de lyse 5x: Tris 250 mM pH 7,5, 25% de glycerol, 1% d'octylphénoxy poly (éthylèneoxy) éthanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM de MgCl2, NaCl 625 mM, 125 mM de NaF, 5 mM de Na 3 VO 4 .
    1. Pour former 200 mL: dissoudre complètement 1 g de poudre de NaF et 184 mg de Na 3 VO4 en poudre dans 71 ml d'eau sous agitation constante. Ajouter 50 ml de Tris 1 M pH 7,5, 2 ml d'IGEPAL à 100%, 1,5 ml de MgCl 2 1 M et 25 ml de NaCl 5 M. Ensuite, ajouter 50 ml de glycerol (ajouter le dernier) et continuer à agiter pendant 1 h.
    2. Filtre-stérilisez avec des unités de filtration de 250 ml. Cette étape peut être lente, mais le filtrage de la solution est important pour éliminer les particules insolubles. Aliquote de 10 ml dans des tubes de 50 ml et entreposez à -80 ° C.
  2. Préparer une solution de dithiothréitol (DTT) 1 M dans de l'eau. Conserver à -20 ° C dans des aliquotes de 1 ml.
  3. Obtenir proteComprimés de cocktails inhibiteurs de l'ase, avec de l'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA). Conserver à 4 ° C.
  4. Obtenir des seringues de 10 ml et des filtres à seringue: diamètre 26 mm, membrane d'acétate de cellulose sans tensioactif (SFCA), taille de pores de 0,45 μm.

5. Collection d'embryons à la mouche

  1. Amplifier les lignes de mouches transgéniques portant la protéine étiquetée d'intérêt dans des bouteilles (environ 100 mouches par bouteille) et transférer les bouteilles tous les 2 jours jusqu'à ce que 25-30 bouteilles soient accumulées pour chaque ligne de mouche. Amplifier le stock de contrôle ( par exemple, la ligne yw ) de manière similaire .
  2. Les plaques chaudes AJ à température ambiante (environ 1-2 h, peuvent être faites pendant la nuit). À l'aide d'un doigt ganté, étaler de la pâte de levure humide au centre des plaques AJ, pour faire env. Cercle de 6 cm pour une plaque de 15 cm et un cercle de 4 cm pour une assiette de 10 cm.
  3. Anesthésier les mouches avec un flux de dioxyde de carbone en utilisant une configuration de scène standard de Drosophila et transférer dansLes cages (environ 15 bouteilles de mouches bien cultivées par cage de 5 L, 5 bouteilles par cage de 1 L).
    1. Couvrir le fond de la cage avec des plaques AJ préparées à partir de l'étape 5.2 et attacher la plaque AJ à la cage à l'aide de deux bandes de ruban adhésif ( Figures 1D et 1H ). Il est utile de replier les pointes de la bande qui passent sur la plaque pour faciliter l'épluchage lors du changement de plaques.
    2. Après que les mouches se sont rétablies de l'anesthésie, gardez les cages avec les assiettes en bas et serrez dessus.
      Remarque: il est important d'attendre que les mouches se rétablissent complètement, car elles s'accrochent à la plaque AJ et à la pâte de levure.
    3. À la fin de l'expérience, pour préparer la cage pour le nettoyage, placez la cage dans le congélateur pendant plusieurs heures. Tremper le maillage dans l'eau pendant quelques heures facilitera le nettoyage.
  4. Incuber les cages avec des mouches à température ambiante pendant 2-3 jours et changer les plaques AJ deux fois par jour. Pour changer les assiettes, tournez la cage à l'envers,Épluchez la bande de la plaque mais tenez la plaque dans la cage, tapez toute la cage doucement sur le banc et permettez rapidement l'ancienne plaque pour une nouvelle, en essayant de ne pas permettre aux mouches de s'échapper.
    Remarque: Les mouches doivent s'adapter à la cage et poser le meilleur départ au jour 3. Ils continueront à se coucher au niveau de crête pendant environ 4-5 jours. Deux cages de 5 L à la capacité de pose supérieure peuvent produire jusqu'à 1 g d'embryons dans une collection de nuit. Utilisez des cages 1 L pour des expériences à plus petite échelle.
  5. Autoriser les mouches à déposer des embryons sur des plaques AJ fraîches pendant la nuit (environ 16 h), ou pendant toute autre durée souhaitée.
  6. Le lendemain matin, marquez et pesez les récipients à mailles pour la collecte des embryons, un par chaque ligne de mouche utilisée.
  7. Préparer 1x tampon de lyse, en utilisant des réactifs de la section 4 (Note: le tampon de lyse 1x prêt à l'emploi doit être préparé avant l'extraction): ajouter 40 mL d'eau à 10 mL de tampon de lyse concentré 5x (conservé à -80 ° C) Dans un tube de 50 ml.
    1. Ajouter 50 μL de 1 MDTT à une concentration finale de 1 mM, mélanger bien et séparer en deux tubes de 50 ml, 25 ml dans chacun. À l'un des tubes, ajouter un comprimé d'inhibiteur de protéase et faire tourner à 4 ° C pendant 30 minutes. Alors que la tablette se dissout, rassemblez et déchorez des embryons (étapes 5.8 à 6.6). Assurez-vous que la tablette a complètement dissous et conservez le tampon sur de la glace.
      Remarque: Le deuxième tube de 1x tampon avec DTT peut être stocké à -80 ° C et ne nécessitera plus d'addition de la tablette avant l'expérience suivante. 25 ml de tampon de lyse est suffisant pour jusqu'à 2 échantillons, en tenant compte des lavages ultérieurs pendant les étapes de purification des protéines.
  8. Marquez les plaques AJ sur les cages avec les génotypes des lignes aériennes utilisées, et permettez les plaques pour les produits frais.
    Remarque: L'excès de levure peut être raclé de la plaque à cette étape. Les embryons peuvent être vieillis sur les plaques à 25 ° C ou à température ambiante pour obtenir la fenêtre souhaitée de temps de développement.
  9. Ajouter assez d'eau tO couvrir chaque plaque AJ. Dégage doucement les embryons de la plaque avec une brosse à peinture douce (la tête plate d'environ 10 mm de large fonctionne bien pour les grandes plaques). Versez les embryons dans le récipient de maille marqué et marqué précédemment, et égouttez l'excès d'eau.
    1. Si nécessaire, effectuer un deuxième rinçage et un brossage de la plaque pour enlever tous les embryons. Mélanger les embryons des plaques supplémentaires pour la même ligne de mouche dans le même récipient à mailles.
  10. Enlevez brièvement le maillage sur les serviettes en papier pour éliminer l'excès d'eau.

6. Dechorionation des embryons

  1. Remplir à moitié une assiette de Petri de 6 cm avec eau de javel à 50% (solution vol / vol dans l'eau).
    Remarque: consultez les remarques importantes sur la marque d'eau de javel dans la Table des matériaux et des réactifs.
    Attention: porter des gants et éviter d'obtenir de l'eau de javel sur les vêtements.
  2. Préparez 2 plats de Petri plus gros avec de l'eau.
  3. Immerger le récipient de mailles avec des embryons dans 50% d'eau de javel pendant 90 s. Touchez doucement le maillot pendant l'incuPlusieurs fois pour suspendre les embryons dans la solution d'eau de Javel.
  4. À la fin de l'incubation de 90 s, laver le récipient de maille dans chacune des 2 plats avec de l'eau pendant environ 10 s.
  5. Rincer abondamment le récipient à mailles avec 18,2 MΩ · cm d'eau à l'aide de la bouteille d'éboulement. En outre, laver les côtés et l'extérieur du récipient à mailles.
    Remarque: Aucune odeur de blanchiment ne doit être détectée après un lavage approfondi.
  6. Nettoyer le récipient de maille sur les serviettes en papier. Peser le conteneur de maille avec les embryons et soustraire le poids du récipient vide obtenu à l'étape 5.6. Notez le poids résultant des embryons. Une bonne quantité d'embryons à atteindre est de 0,5 à 1 g.

7. Préparation de l'extrait d'embryon

  1. Ajouter 1 mL de tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase (de l'étape 5.7) à un homogénéisateur de verre Dunch et le garder sur glace. Transférer les embryons du récipient à mailles dans l'homogénéisateur.
    Note: Les embryons peuvent être ramassés avec une extrémité plateUne spatule métallique ou une brosse et transférée directement dans le tampon. Effectuez toutes les étapes de cette section sur la glace.
  2. Laver les embryons restants sur le maillage avec un tampon de lyse supplémentaire de 1 mL et ajouter au matériau dans l'homogénéisateur. Laissez les embryons s'installer au fond de l'homogénéisateur et aspiraz soigneusement le surnageant.
  3. Ajouter un tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase (de l'étape 5.7) à l'homogénéisateur, en visant 5-6 mL de tampon de lyse par gramme d'embryons.
  4. Homogénéiser les embryons de 4 à 6 coups avec un pilon lâche.
    Remarque: Pendant les premiers traits, il y aura plus de résistance. Essayez de déplacer le pilon dans un mouvement continu pour éviter d'éclabousser la solution.
  5. Homogénéiser les embryons par 8-10 coups avec un pilon ajusté.
  6. Incuber l'homogénat sur glace pendant 20 min.
  7. Transférer l'homogénat en tubes de microcentrifugeuse et centrifuger à 4 ° C pendant 15 min à la vitesse supérieure (environ 13 000 xg).
  8. EviterNg les pastilles et la couche lipidique maximale, transférez les surnageants dans des tubes de microcentrifugation frais et centrifugez à 4 ° C pendant 15 minutes à la vitesse supérieure (environ 13 000 xg).
  9. Aspirer soigneusement les surnageants avec un bout de 1 ml et le charger dans des seringues réfrigérées de 10 mL avec des filtres de 0,45 μm (combiner les parties aliquotes du même échantillon en une seule seringue). Pousser toute la solution dans un tube marqué de 15 ml sur de la glace. L'extrait peut être utilisé immédiatement pour des expériences de purification de protéines ultérieures ou congelé à l'eau liquide et maintenu à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
    Note: Il est préférable de geler les extraits plutôt que les embryons, car pendant la décongélation ultérieure des embryons, les protéases peuvent être activées et conduire à une dégradation des protéines.

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Representative Results

Pour illustrer l'utilisation de ce protocole dans une expérience de purification de complexe de protéines, nous avons généré une ligne de mouche viable homozygote, bras-EGFP-ERK , exprimant la kinase extracellulaire régulée par Drosophila marquée par EGFP (ERK, codée par le gène roulé ) sous le contrôle D'un promoteur omniprésent d' armadillo ( bras ) 18 , 19 . Le promoteur du bras est actif pendant la plupart des étapes de l' embryogenèse de Drosophila 19 . Les lysats ont été préparés en utilisant le protocole décrit et l'expression de la protéine du transgène bras-EGFP-ERK a été confirmée par Western Blot pour la protéine ERK totale pour détecter simultanément les niveaux d'EGFP-ERK endogène et transgénique, migrant à 42 kDa et 69 kDa , Respectivement ( figure 2A ). Une seule bande correspondant à une ER endogène non balisée K (42 kDa) a été détecté dans la ligne de contrôle yw . Ce résultat confirme une extraction réussie d'ERK et EGFP-ERK à partir d'embryons.

Pour tester si notre protocole d'extraction convient à la purification ultérieure d'une protéine marquée, des extraits des mouches yw et bras EGFP-ERK ont été soumis à une purification par affinité en utilisant des billes d'agarose GFP en suivant les protocoles établis 10 , 11 . La coloration par l'argent des échantillons sur un gradient SDS-PAGE a montré une purification réussie de la protéine d'appât, EGFP-ERK ( Figure 2B ). Outre EGFP-ERK lui-même, la voie expérimentale contenait des bandes supplémentaires qui n'étaient pas observées dans l'échantillon de contrôle yw , ce qui suggère que la procédure de purification a récupéré des protéines ERK-interagissant potentielles.

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Figure 1 : Préparation des cages de population. ( A - D ) Une cage de 5 L fabriquée à partir d'un récipient en plastique. ( A ) Un conteneur de départ. ( B ) Vue de dessous de la cage de 5 L. ( C ) Vue de dessus de 5 L cage avec maillage attaché. ( D ) Cage ensachée de 5 L avec une assiette de jus de pommes de 15 cm, vue de dessous. ( E et F) Un foret de 3 pouces (76 mm) utilisé pour percer des trous dans le récipient de 1 L. ( G , H ) A 1 L cage. ( G ) Vue de dessus d'une cage de 1 L avec un maillage attaché. ( H ) Cage assemblée de 1 L avec une assiette de jus de pommes de 10 cm attachée, vue de dessous. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Extraction et purification d'EGFP-ERK à partir d'embryons. ( A ) Western blot montrant l'expression de EGFP-ERK et ERK endogène dans un extrait préparé à partir de la ligne transgénique bras-EGFP-ERK . La ligne yw a été utilisée comme témoin. Vert, anticorps ERK total; Rouge, marqueur de poids moléculaire. ( B ) Gel teinté d'argent montrant EGFP-ERK purifié et protéines associées. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le protocole présenté ici est une procédure simple et générale pour la mise en place des cages de population de Drosophila à l'échelle moyenne et la production d' extraits de protéines à cellules entières à partir d'embryons. Les extraits résultants peuvent être utilisés dans une variété d'applications en aval, telles que la purification de complexes de protéines sur des résines d'affinité. Il est essentiel d'effectuer les étapes d'extraction sur la glace et d'utiliser une forte inhibition de la protéase, afin de minimiser la dégradation des protéines. Comme décrit, le protocole est approprié pour l'isolement de la plupart des protéines nucléaires cytoplasmiques et certaines protéines nucléaires solubles 6 , 10 , 12 , 15 . Il peut être facilement adapté pour une purification plus ciblée des protéines d'autres compartiments, comme l'isolement de protéines nucléaires moins solubles à l'aide d'une importante extraction de sel 5 . Comme mentionné à l'étape 5.8, les temps de collecte et les périodes de vieillissement des embryons peuvent êtreMis en place dans des intervalles précis pour obtenir différents stades de développement.

Il est souvent souhaitable de vérifier que la protéine d'intérêt marquée est exprimée à des niveaux correspondant étroitement aux niveaux endogènes d'expression, comme nous l'avons montré en utilisant un anticorps ERK anti-total ( Figure 2A ). Si l'anticorps contre la protéine endogène n'est pas disponible, la fonctionnalité des constructions peut être vérifiée par d'autres essais, par exemple dans une expérience de sauvetage génétique. Cependant, dans la plupart des cas, une surexpression légère de la protéine marquée devrait encore entraîner l'isolement de complexes protéiques significatifs et peut en fait faciliter l'extraction et la purification de protéines «difficiles».

Le principal avantage de ce protocole est sa simplicité et la possibilité de mettre en place toute la procédure à un coût modéré. Un avantage supplémentaire de l'utilisation de cages plus petites est que des lignes transgéniques multiples peuvent être configurées et analysées en parallèleL, ce qui peut ne pas être réalisable lors de l'utilisation de cages plus grandes. Les cages de mouches que nous décrivons ici peuvent être facilement nettoyées et réutilisées pendant des années. Au lieu de faire des cages 1-L des pots Nalgene comme décrit, il est possible d'utiliser d'autres conteneurs disponibles, comme une version plus petite du conteneur de 5 L.

Nous avons utilisé avec succès ce protocole (ou ses variations avec de petites modifications) pour des complexes de purification contenant diverses protéines de signalisation et des composants associés, suivis d'une analyse par spectrométrie de masse 6 , 10 , 15 . Ces approches ont permis d'identifier de nouveaux IPP qui ont été validés dans des études fonctionnelles 10 , 15 . Les variations du protocole présenté ici ont déjà été utilisées pour analyser le phosphoproteome dans l' embryogenèse de Drosophila 20 et pour étudier le paysageDe l'ubiquitination dans le développement neuronal 21 , 22 . Cette procédure représente donc une passerelle pratique pour analyser les IPP in vivo , et est utilisable pour d'autres applications protéomiques.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Les auteurs remercient les membres du laboratoire de Veraksa pour des commentaires utiles sur le manuscrit et des suggestions pour l'amélioration des protocoles. AV a été soutenu par les subventions NIH GM105813 et NS096402. LY a été soutenu par la bourse de doctorat de Boston Sanofi Genzyme de l'Université du Massachusetts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) Home Depot 209330 For making 5-L cages.
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) Home Depot 209320 Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm Fisher Scientific FB0875714 Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm Fisher Scientific FB0875713A Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.
Sefar NITEX nylon mesh Sefar 03-180/44 180 micron, 44% open area, used for fly cages.
Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor Home Depot 49-56-9670 3 inch cutting tool for making 1-L cages.
Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure Fisher Scientific 11-823-33 For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.
Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch Red Star  can be purchased from Amazon.com or other suppliers.
Frozen 100% Apple Juice Concentrate  can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can.
Methyl 4-hydroxybenzoate Acros Organics AC126965000 also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.
IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml Sigma I8896 used for preparing lysis buffer.
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane  Fisher Scientific 09-740-2A 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.
Corning SFCA syringe filters  Fisher Scientific 09-754-21 SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples.
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles Fisher Scientific 14-823-2A for filtering final extract samples. BD cat # 309604.
Bleach Clorox used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.
Corning Costar Netwell Plates Fisher Scientific 07-200-213 mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well.
Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml Fisher Scientific 06-435B homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
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Biologie du développement numéro 123 extrait lysat protéine, Mouche des fruits embryon protéomique échelle moyenne purification cage
Préparation à moyen terme de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extraits d&#39;embryons pour les expériences protéomiques
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Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne,… More

Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne, S., Kyriakakis, P., Veraksa, A. Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55804, doi:10.3791/55804 (2017).

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