Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, einen direkten und kostengünstigen Ansatz für die Sammlung von Drosophila- Embryonen im mittleren Maßstab (0,5-1 g) und die Herstellung von Proteinextrakten, die in nachgeschalteten proteomischen Anwendungen verwendet werden können, wie Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS ).
Abstract
Die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) ist zu einem unverzichtbaren Ansatz geworden, um biologische Prozesse und Mechanismen wie Zell-Signalisierung, Organismusentwicklung und Krankheit zu untersuchen. Es ist oft wünschenswert, PPI-Informationen unter Verwendung von in vivo- Material zu erhalten, um die natürlichste und unvoreingenommenste Sicht auf die Interaktionsnetze zu gewinnen. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist eine hervorragende Plattform, um PPIs in vivo zu studieren, und eignet sich für einfache Ansätze zur Isolierung von Material für biochemische Experimente. Insbesondere stellen Fruchtfliege-Embryos eine bequeme Art von Gewebe dar, um PPIs zu untersuchen, aufgrund der Leichtigkeit des Sammelns von Tieren in diesem Entwicklungsstadium und der Tatsache, dass die Mehrheit der Proteine in der Embryogenese exprimiert wird, wodurch eine relevante Umgebung bereitgestellt wird, um die meisten PPIs zu enthüllen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Sammlung von Drosophila- Embryonen im mittleren Maßstab (0,5-1 g) vor, was eine ideale Menge für eine breite Palette vonProteomische Anwendungen, einschließlich der Analyse von PPIs durch Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS). Wir beschreiben unsere Entwürfe für 1 L und 5 L Käfige für Embryosammlungen, die in jedem Labor leicht und kostengünstig eingerichtet werden können. Wir bieten auch ein allgemeines Protokoll für Embryo-Sammlung und Proteinextraktion, um Lysate zu erzeugen, die direkt in nachgeschalteten Anwendungen wie AP-MS verwendet werden können. Unser Ziel ist es, allen Forschern ein zugängliches Mittel zu bieten, um die Analysen von PPIs in vivo durchzuführen.
Introduction
Genetische Bildschirme und in jüngster Zeit haben genomische Ansätze das Studium der biologischen Funktionen revolutioniert. Wichtige zelluläre Informationen sind jedoch in Proteinen und ihrem Ensemble von interagierenden Partnern codiert. Während traditionelle genetische Modifikatorbildschirme ratenbegrenzende Wegkomponenten identifizieren und indirekte Wechselwirkungen wiederherstellen können, liegt die Stärke der proteomischen Ansätze in ihrer Fähigkeit, vollständige unmittelbare Interaktionsnetze von interessanten Proteinen zu identifizieren. Proteomik ist also eine wertvolle orthogonale Methode, um biologische Systeme zu studieren und ergänzt Genomik, Transkriptomik und traditionelle genetische Bildschirme. Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS) hat sich als ein leistungsfähiger Ansatz zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) in ihrer nativen Umgebung in Zellen und Geweben 1 , 2 erwiesen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von direkten oder indirekten Wechselwirkungen bei einer spezifischen EntwicklungAl-Stadien oder Gewebe-Kontexte, und wurde erfolgreich verwendet, um mehrere neuartige PPIs in einer Vielzahl von Entwicklungswegen zu identifizieren (siehe Referenz 1 ). Trotz des unbestrittenen Erfolgs von PPI-Studien wurden die meisten von ihnen in kultivierten Zellen durchgeführt, in denen die interessierenden "Köder" -Proteine überexprimiert wurden. Es gibt zwei Probleme mit dem Studium von PPIs in der Zellkultur: Erstens kann eine spezifische Zelllinie keine vollständige Komplementierung von Wechselwirkungen aufgrund des Mangels an Expression bestimmter Proteine liefern. Zweitens könnte eine hohe Überexpression, die gewöhnlich bei solchen Analysen verwendet wird, zu Artefakten führen, wie z. B. Proteinfehlfalten oder Identifizierung von falsch positiven Wechselwirkungen.
Beide Einschränkungen können durch die Analyse von PPIs in vivo überwunden werden . Ein limitierender Schritt bei solchen Experimenten ist die Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials zur Reinigung von Proteinkomplexen. Drosophila melanogaster ist seit langem als Modell für funktionelle Analyten verwendet wordenSis, und vor kurzem wurde auch gezeigt, dass es ein ausgezeichnetes System für das Studium von PPIs in vivo ist . Die Drosophila- Embryogenese stellt einen besonders attraktiven Gewebetyp dar, um PPIs zu untersuchen, da Embryonen leicht in großen Mengen gesammelt werden können und auch weil die meisten Gene (> 88%) im Verlauf der Embryogenese exprimiert werden, so dass eine reiche in vivo- Umgebung für die Erkennung von relevanten Informationen bereitgestellt wird PPIs 3
Traditionell verwendeten biochemische Studien an Fliegen sehr große Embryosammlungen (100-150 g), wie sie für die Reinigung von funktionellen Transkriptionslysaten 4 , 5 notwendig sind . Bisherige AP-MS-Studien in Drosophila benötigten auch große Mengen an Embryonen (5-10 g), da sie sich auf einen zweistufigen Reinigungsansatz wie Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) mit dem damit verbundenen Materialverlust bei jedem Schritt 6 stützten. Großes amounTs des Ausgangsmaterials erforderten die Einrichtung von Embryosammlungen in großen Populationskäfigen, die sowohl teuer sein können (wenn sie kommerziell gekauft werden) und zeitaufwändig, um 7 , 8 , 9 zu erhalten und zu reinigen.
Jüngste Fortschritte bei der Entwicklung von Einstufen-Affinitätsreinigungsansätzen sowie die zunehmende Empfindlichkeit von Massenspektrometern haben die notwendige Menge an Ausgangsmaterial um eine Größenordnung reduziert. Unter Verwendung von Markierungen wie dem Streptavidin-bindenden Peptid (SBP) oder dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) und ausgehend von weniger als 1 g Embryos ist es möglich, die Mengen des Köderproteins und die interagierenden Komponenten zu isolieren, die für die Identifizierung durch ausreichend sind Massenspektrometrie 10 , 11 .
Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls ist es, den Forschern Overco zu helfenMir eine wahrgenommene Barriere zur biochemischen Analyse von PPIs in vivo . Zu diesem Zweck stellen wir ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Verfügung, um Drosophila- Embryos im mittleren Maßstab (0,5-1 g) zu sammeln, gefolgt von einer einstufigen Herstellung von ganzzelligen Proteinextrakten, die für die anschließende Analyse durch AP-MS oder andere Ansätze geeignet sind . Unsere Methode beruht auf der Verwendung von maßgeschneiderten 1-L- oder 5-L-Populationskäfigen, die von jedem Labor leicht hergestellt werden können. Weiterhin wurden die hier vorgestellten Extraktionsbedingungen in mehreren Studien sowohl in kultivierten Zellen als auch in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 validiert.
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Protocol
1. Vorbereitung von 5 L Fliegenkäfigen (um 15 cm Platten zu passen)
- Erhalten Sie die benötigten Materialien: 5-Liter (4,7-L) Behälter mit Deckel (Abbildung 1A ), Nylongewebe und Rasierklinge.
- Markieren Sie einen Kreis von 12 cm Durchmesser und schneiden Sie ein Loch in der Unterseite des Behälters mit dem Rasierklinge (Abbildung 1B ). Schneiden Sie ein Loch von 15 cm Durchmesser in den Deckel ( Abbildung 1C ).
- Nylongewebe in 25 x 25 cm Quadrate schneiden.
- Legen Sie das Netz über den oberen Rand des Behälters und drücken Sie mit dem Deckel nach unten (Abbildung 1C ). Stellen Sie sicher, dass das Netz fest ist und der Deckel nicht gekippt ist. Der Käfig ist bereit, mit Fliegen bevölkert zu werden (siehe Schritt 5.3).
2. Vorbereitung von 1 L Fliegenkäfigen (zur Anpassung von 10 cm Platten)
- Erhalten Sie die benötigten Materialien: einen Elektrobohrer, ein 3 Zoll (76 mm) Schneidwerkzeug (Abbildung 1E und FIgure 1F), ein geradliniges 1 l Plastikgefäß mit Deckel, Nylongewebe, Rasierklinge, Sandpapier, Schutzbrille und Arbeitshandschuhe.
- Schneiden Sie 3 Zoll (76 mm) Löcher in den Boden und den Deckel des Plastikgefäßes (Abbildung 1G ), wobei der Deckel während des Bohrens fest auf den Behälter geschraubt wurde. Positionieren Sie das Schneidwerkzeug in der Mitte des Kreises, wenn Sie beginnen, ein Loch zu machen.
Achtung: Bei diesem Schritt Augenschutz und Arbeitshandschuhe tragen. - Die Kanten der Löcher mit einem Rasierklinge und Sandpapier glätten.
- Nylongewebe in 18 x 18 cm Quadrate schneiden.
- Legen Sie das Netz über den oberen Rand des Gefäßes und ziehen Sie es fest, indem Sie den Deckel anziehen ( Abbildung 1G ). Stellen Sie sicher, dass das Netz fest ist und der Deckel nicht gekippt ist. Der Käfig ist bereit, mit Fliegen bevölkert zu werden (siehe Schritt 5.3).
3. Vorbereitung der Apfelsaft (AJ) Platten
- 19 g Agar und 1 l 18,2 MΩ · cm Wasser in einen 2 l-Kolben geben.Fügen Sie einen Rührstab hinzu und mischen Sie kurz.
- Autoklav für 30 min. Mittlerweile konzentrieren sich 100% Apfelsaft aus gefrorenem Stamm und bereiten 10 ml 10% (Gewicht / Volumen) Methyl-4-hydroxybenzoat-Lösung in Ethanol vor.
- Nach dem Autoklavieren mischen Sie den Agar auf eine Rührplatte und fügen Sie 80 ml 100% iges Apfelsaftkonzentrat und 10 ml 10% (Gewicht / Volumen) Methyl-4-hydroxybenzoat-Lösung in den Kolben ein. Bei Raumtemperatur bei konstantem Mischen abkühlen lassen.
- Gießen Sie 15 cm Petrischalen (für 5 l Käfige) oder 10 cm Petrischalen (für 1 l Käfige), so dass der Grad des Agars in jeder Schale etwa 5 mm dick ist. Erlauben Sie bei Raumtemperatur zu verfestigen und wickeln Sie in Plastiktüten ein. AJ-Platten können bei 4 ° C für zwei Wochen gelagert werden.
Hinweis: Petrischalen können gewaschen und wiederverwendet werden. - Bereiten Sie nasse Hefepaste vor: Gießen Sie einige aktive Trockenhefe in einen 100 ml-Behälter mit einem Deckel, der ein leichtes Mischen ermöglicht und Wasser in kleinen Mengen unter Rühren zugeben, um eine dicke, aber gründlich gemischte zu erhaltenPaste. Bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen aufbewahren.
4. Vorbereitung von Lyse-Reagenzien
- Zubereitet 5x Lysepuffer: 250 mM Tris pH 7,5, 25% Glycerin, 1% Octylphenoxypoly (ethylenoxy) ethanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl 2 , 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na 3 VO 4 .
- Zur Herstellung von 200 ml: 1 g NaF-Pulver und 184 mg Na 3 VO 4 -Pulver in 71 ml Wasser unter konstantem Rühren vollständig auflösen. Fügen Sie 50 ml 1 M Tris pH 7,5, 2 ml 100% IGEPAL, 1,5 ml 1 M MgCl 2 und 25 ml 5 M NaCl hinzu. Dann 50 ml Glycerin zugeben (zuletzt hinzufügen) und noch 1 h rühren lassen.
- Filter-sterilisieren mit 250-ml-Filtereinheiten. Dieser Schritt kann langsam sein, aber das Filtern der Lösung ist wichtig, um unlösliche Partikel zu entfernen. Aliquot durch 10 ml in 50 ml Röhrchen und bei -80 ° C aufbewahren.
- 1 M Dithiothreitol (DTT) -Lösung in Wasser vorbereiten. Bei -20 ° C in 1 mL Aliquots lagern.
- Erhalten Sie den SchutzAse-Inhibitor-Cocktail-Tabletten mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Bei 4 ° C aufbewahren.
- Erhalten Sie 10 ml Spritzen und Spritzenfilter: 26 mm Durchmesser, Tensid-freie Celluloseacetat (SFCA) Membran, 0,45 μm Porengröße.
5. Sammlung von Fliegen-Embryonen
- Verstärken Sie die transgenen Fliegenschnüre, die das markierte Protein von Interesse in Flaschen (ungefähr 100 Fliegen pro Flasche) tragen, und übertragen Sie die Flaschen alle 2 Tage, bis 25-30 Flaschen für jede Fliegenschnur angesammelt werden. Verstärken Sie den Kontrollbestand ( zB die yw- Linie) in ähnlicher Weise.
- Warm AJ Platten auf Raumtemperatur (ca. 1-2 Stunden, kann über Nacht gemacht werden). Mit einem behandschuhten Finger, verteilen Sie einige nasse Hefepaste in der Mitte der AJ-Platten, um eine ca. 6-cm-Kreis für eine 15 cm Platte und einen 4 cm-Kreis für eine 10 cm Platte.
- Anästhesieren Sie die Fliegen mit einem Fluss von Kohlendioxid mit einem Standard Drosophila Bühnenaufbau und Transfer inDie Käfige (ca. 15 ausgewachsene Flaschen Fliegen pro 5 l Käfig, 5 Flaschen pro 1 l Käfig).
- Decken Sie den Käfigboden mit vorbereiteten AJ-Platten aus Schritt 5.2 ab und kleben Sie die AJ-Platte mit zwei Streifen Klebeband auf den Käfig ( Abb. 1D und 1H ). Es ist sinnvoll, die Spitzen des Bandes zu klappen, die über die Platte gehen, um ein leichtes Schälen beim Wechseln der Platten zu erzielen.
- Nachdem die Fliegen sich von der Anästhesie erholen, halten Sie die Käfige mit den Platten an der Unterseite und mesh oben.
Hinweis: Es ist wichtig zu warten, bis sich die Fliegen vollständig erholen, da sie sonst an der AJ-Platte und der Hefepaste haften bleiben. - Am Ende des Experiments, um den Käfig für die Reinigung vorzubereiten, legen Sie den Käfig in den Gefrierschrank für mehrere Stunden. Das Einweichen des Netzes in Wasser für ein paar Stunden erleichtert die Reinigung.
- Inkubieren Sie die Käfige mit Fliegen bei Raumtemperatur für 2-3 Tage und ändern AJ Platten zweimal täglich. Um die Teller zu wechseln, drehe den Käfig um,Schneide das Band von der Platte ab, halte aber den Teller an den Käfig, tippe den ganzen Käfig sanft auf die Bank und tausche schnell den alten Teller für einen neuen und versuche nicht, Fliegen zu entkommen.
Anmerkung: Fliegen müssen sich an den Käfig anpassen und am besten ab dem 3. Tag liegen. Sie werden weiterhin ca. 4-5 Tage auf Höchststand legen. Zwei 5-l-Käfige bei oberer Verlegekapazität können bis zu 1 g Embryos in einer Übernacht-Sammlung produzieren. Verwenden Sie 1 L Käfige für kleinere Experimente. - Lassen Sie Fliegen Embryonen auf frischen AJ-Platten über Nacht (ca. 16 h) oder für jede andere gewünschte Zeitdauer.
- Am nächsten Morgen, markieren und wiegen Mesh-Container für Embryo-Sammlung, eine pro Fliege Linie verwendet.
- 4 Lysepuffer unter Verwendung von Reagenzien aus Abschnitt 4 vorbereiten (Hinweis: Der gebrauchsfertige 1x Lysepuffer muss vor der Extraktion vorbereitet werden): 40 ml Wasser zu 10 ml 5x konzentriertem Lysepuffer (bei -80 ° C gelagert) In einer 50 mL Röhre.
- 50 μl 1 MD zugebenTT bis zu einer Endkonzentration von 1 mM, gut vermischen und in zwei 50 ml Röhrchen, jeweils 25 ml, trennen. Zu einem der Röhrchen, füge eine Protease-Inhibitor-Tablette hinzu und drehe bei 4 ° C für 30 min. Während sich die Tablette auflöst, embryos sammeln und dechorionieren (Schritte 5.8 bis 6.6). Überprüfen Sie, um sicherzustellen, dass die Tablette vollständig aufgelöst ist, und halten Sie den Puffer auf Eis.
Hinweis: Die zweite Röhre von 1x Puffer mit DTT kann bei -80 ° C gelagert werden und benötigt nur die Tablette vor dem nächsten Experiment. 25 ml Lysepuffer reichen für bis zu 2 Proben unter Berücksichtigung der nachfolgenden Waschungen während der Proteinreinigungsschritte aus.
- 50 μl 1 MD zugebenTT bis zu einer Endkonzentration von 1 mM, gut vermischen und in zwei 50 ml Röhrchen, jeweils 25 ml, trennen. Zu einem der Röhrchen, füge eine Protease-Inhibitor-Tablette hinzu und drehe bei 4 ° C für 30 min. Während sich die Tablette auflöst, embryos sammeln und dechorionieren (Schritte 5.8 bis 6.6). Überprüfen Sie, um sicherzustellen, dass die Tablette vollständig aufgelöst ist, und halten Sie den Puffer auf Eis.
- Markiere die AJ-Platten auf den Käfigen mit den Genotypen der Fliegenlinien und tausche die Teller für frische.
Hinweis: Überschüssige Hefepaste kann bei diesem Schritt von der Platte abgeschabt werden. Embryos können auf den Platten bei 25 ° C oder Raumtemperatur gealtert werden, um das gewünschte Fenster der Entwicklungszeit zu erhalten. - Füge genug Wasser hinzu tO jede AJ-Platte abdecken. Die Embryonen vorsichtig mit einem weichen Pinsel (flacher Kopf ca. 10 mm breit gut für große Platten) ausziehen. Die Embryonen in den vorher gewogenen und markierten Netzbehälter gießen und überschüssiges Wasser abtropfen lassen.
- Wenn nötig, führen Sie eine zweite Spülung und Bürsten der Platte, um alle Embryonen zu entfernen. Kombinieren Sie die Embryonen aus der zusätzlichen Platte (n) für die gleiche Fliege Linie in den gleichen Mesh-Container.
- Das Netz auf Papierhandtücher kurz auftragen, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
6. Embryo Dechorionierung
- Halbfill eine 6 cm Petrischale mit 50% Bleichmittel (vol / vol Lösung in Wasser).
Anmerkung: Siehe wichtige Anmerkung über Bleichmittelmarke in der Tabelle der Materialien und Reagenzien.
Achtung: Handschuhe tragen und Bleichmittel auf Kleidung vermeiden. - 2 größere Petrischalen mit Wasser zubereiten.
- Tauchen Sie den Netzbehälter mit Embryonen in 50% Bleichmittel für 90 s ein. Tippen Sie das Ineinander greifen vorsichtig anBation ein paar Mal, um die Embryonen in der Bleichlösung zu suspendieren.
- Am Ende der 90 s Inkubation, waschen Sie die Mesh-Container in jedem der 2 Gerichte mit Wasser für ca. 10 s.
- Spülen Sie den Netzbehälter gründlich mit 18,2 MΩ · cm Wasser mit der Spritzflasche ab. Auch die Seiten und die Außenseite des Netzbehälters waschen.
Hinweis: Nach einer gründlichen Wäsche sollte kein Bleichgeruch nachgewiesen werden. - Blättern Sie den Netzbehälter auf Papiertücher. Wiegen Sie den Maschenbehälter mit den Embryonen und subtrahieren Sie das Gewicht des in Schritt 5.6 erhaltenen leeren Behälters. Notieren Sie das resultierende Gewicht der Embryonen. Eine gute Menge an Embryonen zu erreichen ist 0,5 - 1 g.
7. Vorbereitung des Embryo-Extrakts
- Füge 1 ml Lysepuffer mit Protease-Inhibitoren (ab Schritt 5.7) zu einem Dounce-Glas-Homogenisator hinzu und halte ihn auf Eis. Übertragen Sie die Embryonen aus dem Netzbehälter in den Homogenisator.
Anmerkung: Embryos können mit einem flachen Ende aufgenommen werden oFa Metallspatel oder Pinsel und direkt in den Puffer übertragen. Führen Sie alle Schritte in diesem Abschnitt auf Eis. - Die restlichen Embryos auf dem Netz mit einem zusätzlichen 1 ml Lysepuffer abwaschen und dem Material im Homogenisator zugeben. Lassen Sie die Embryos sich bis auf den Boden des Homogenisators niederlassen und sorgfältig den Überstand anstreben.
- Fügen Sie Lysepuffer mit Protease-Inhibitoren (von Schritt 5.7) zum Homogenisator hinzu und zielen auf 5-6 ml Lysepuffer pro Gramm Embryos.
- Homogenisieren Sie die Embryonen mit 4-6 Schlägen mit einer losen Passpistole.
Hinweis: Während der ersten Striche gibt es mehr Widerstand. Versuchen Sie, die Stößel in einer kontinuierlichen Bewegung zu bewegen, um das Spritzen der Lösung zu vermeiden. - Homogenisieren Sie die Embryonen mit 8-10 Schlägen mit einer eng anliegenden Stößel.
- Das Homogenat auf Eis für 20 min inkubieren.
- Das Homogenat in Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 4 ° C für 15 min bei Höchstgeschwindigkeit (ca. 13.000 xg) zentrifugieren.
- AvoidiNg die Pellets und die sehr obere Lipidschicht, überführen die Überstände in frische Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren bei 4 ° C für 15 min bei Höchstgeschwindigkeit (ca. 13.000 xg).
- Die Überstände sorgfältig mit 1 mL Spitze abspülen und in gekühlte 10 ml Spritzen mit 0,45 μm Filter auftragen (Aliquots der gleichen Probe in eine Spritze kombinieren). Schieben Sie die gesamte Lösung in ein markiertes 15-ml-Röhrchen auf Eis. Der Extrakt kann sofort für nachfolgende Proteinreinigungsexperimente verwendet oder in flüssigem Stickstoff eingefroren werden und bei -80 ° C für zukünftige Verwendung gehalten werden.
Anmerkung: Es ist besser, die Extrakte eher als die Embryos einzufrieren, denn beim anschließenden Auftauen von Embryonen können Proteasen aktiviert und zum Proteinabbau führen.
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Representative Results
Um die Verwendung dieses Protokolls in einem Protein-Komplex-Reinigungsexperiment zu veranschaulichen, erzeugten wir eine homozygote lebensfähige Fliegenlinie, Arm-EGFP-ERK , die EGFP- markierte Drosophila extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK, kodiert durch das gerollte Gen) unter der Kontrolle exprimiert Eines ubiquitisch ausgedrückten Gürteltier- ( Arm- ) Promotors 18 , 19 . Der Arm- Promotor ist während der meisten Stadien der Drosophila- Embryogenese 19 aktiv. Die Lysate wurden unter Verwendung des beschriebenen Protokolls hergestellt, und die Expression von Protein aus dem Arm-EGFP-ERK- Transgen wurde durch Western-Blotting für das gesamte ERK-Protein bestätigt, um gleichzeitig die Mengen an endogenem und transgenem EGFP-ERK zu detektieren, die bei 42 kDa und 69 kDa wanderten ( Fig. 2A ). Ein einziges Band, das dem nicht markierten endogenen ER entspricht K (42 kDa) wurde in der yw-Steuerleitung erkannt. Dieses Ergebnis bestätigt eine erfolgreiche Extraktion von ERK und EGFP-ERK aus Embryonen.
Um zu testen, ob unser Extraktionsprotokoll für die anschließende Reinigung eines markierten Proteins geeignet ist, wurden Extrakte aus den YW- und Arm-EGFP-ERK- Fliegen einer Affinitätsreinigung unter Verwendung von GFP-Agaroseperlen nach den etablierten Protokollen 10 , 11 unterworfen. Die Silberfärbung der Proben auf einer Gradienten-SDS-PAGE zeigte eine erfolgreiche Reinigung des Köderproteins, EGFP-ERK (Abbildung 2B ). Neben der EGFP-ERK selbst enthielt die experimentelle Spur zusätzliche Banden, die bei der Kontrolle nicht beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass das Reinigungsverfahren potenzielle ERK-interagierende Proteine erholte.
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Abbildung 1 : Vorbereitung der Populationskäfige. ( A - D ) Ein 5-L-Käfig aus Kunststoffbehälter. ( A ) Ein Startbehälter ( B ) Unteransicht des 5-l-Käfigs ( C ) Draufsicht auf 5 L Käfig mit Mesh befestigt. ( D ) Zusammengebauter 5 l Käfig mit einer 15 cm Apfelsaftplatte, Untersicht. ( E und F) Ein Bohrloch mit 3 Zoll (76 mm) zum Bohren von Löchern im 1 L-Behälter. ( G , H ) Ein 1 l Käfig. ( G ) Draufsicht auf einen 1 l Käfig mit Mesh befestigt. ( H ) Montiert 1 l Käfig mit 10 cm Apfelsaftplatte, Untersicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll ist ein einfaches und allgemeines Verfahren für die Einrichtung von Drosophila- Populationskäfigen im mittleren Maßstab und die Herstellung von ganzzelligen Proteinextrakten aus Embryonen. Die resultierenden Extrakte können in einer Vielzahl von nachgeschalteten Anwendungen verwendet werden, wie die Reinigung von Proteinkomplexen auf Affinitätsharze. Es ist entscheidend, die Extraktionsschritte auf Eis durchzuführen und eine starke Proteasehemmung zu verwenden, um den Proteinabbau zu minimieren. Wie beschrieben, eignet sich das Protokoll zur Isolierung der meisten zytoplasmatischen und einigen Membran- und löslichen Kernproteine 6 , 10 , 12 , 15 . Es kann leicht angepasst werden für eine fokussierte Reinigung von Proteinen aus anderen Kompartimenten, wie die Isolierung von weniger löslichen Kernproteinen unter Verwendung von Salzsalz Extraktion 5 . Wie in Schritt 5.8 erwähnt, können Sammelzeiten und Embryo-Alterungsperioden seinIn präzisen Intervallen aufstellen, um unterschiedliche Entwicklungsstadien zu erhalten.
Es ist oft wünschenswert, festzustellen, dass das markierte Protein von Interesse in den Stufen exprimiert wird, die eng mit den endogenen Expressionsniveaus übereinstimmen, wie wir gezeigt haben, indem wir einen Anti-Gesamt-ERK-Antikörper verwenden ( 2A ). Wenn der Antikörper gegen endogenes Protein nicht verfügbar ist, kann die Funktionalität der Konstrukte durch andere Assays, z. B. in einem genetischen Rettungsexperiment, verifiziert werden. In den meisten Fällen sollte jedoch eine milde Überexpression des markierten Proteins noch zur Isolierung von aussagekräftigen Proteinkomplexen führen und kann in der Tat die Extraktion und Reinigung von "schwierigen" Proteinen erleichtern.
Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist seine Einfachheit und die Möglichkeit, das ganze Verfahren zu moderaten Kosten aufzustellen. Ein zusätzlicher Vorteil bei der Verwendung kleinerer Käfige ist, dass mehrere transgene Linien parametriert und analysiert werden könnenL, was bei der Verwendung größerer Käfige nicht möglich ist. Die Fliegenkäfige, die wir hier beschreiben, können seit Jahren leicht gereinigt und wiederverwendet werden. Anstelle der Herstellung von 1-L-Käfigen aus Nalgene-Gefäßen, wie beschrieben, ist es möglich, andere verfügbare Behälter, wie eine kleinere Version des 5-L-Behälters, zu verwenden.
Wir haben dieses Protokoll (oder seine Variationen mit kleinen Modifikationen) erfolgreich zur Reinigung von Komplexen verwendet, die verschiedene Signalproteine und zugehörige Komponenten enthalten, gefolgt von einer Analyse der Massenspektrometrie 6 , 10 , 15 . Diese Ansätze haben zur Identifizierung von neuartigen PPIs geführt, die in den Funktionsstudien 10 , 15 weiter validiert wurden. Variationen des hier vorgestellten Protokolls wurden bisher verwendet, um das Phosphoproteom in der Drosophila- Embryogenese 20 zu analysieren und die Landschaft zu untersuchenDer Ubiquitinierung in der neuronalen Entwicklung 21 , 22 . Diese Prozedur stellt daher ein bequemes Gateway zur Analyse von PPIs in vivo dar und ist für andere Proteomikanwendungen verwendbar.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Mitgliedern des Veraksa-Labors für hilfreiche Kommentare zum Manuskript und Vorschläge für Protokollverbesserungen. AV wurde von den NIH-Stipendien GM105813 und NS096402 unterstützt. LY wurde von der University of Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
References
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