Summary
Un protocole de fractionnement abrégée pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain est décrite.
Abstract
Dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole abrégée seule étape fractionnement pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau humain de post-mortem. Le détergent ionique N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) solubilise efficacement les protéines nativement repliées dans le tissu cérébral, ce qui permet l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent parmi un large éventail de proteinopathies neurodégénératives, telles que La maladie d’Alzheimer (ma), la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique et maladies à prions. Contrôle de l’homme et les tissus du cerveau post-mortem AD ont été homogénéisés et sédimentée par ultracentrifugation en présence de sarkosyl pour enrichir les agrégats de protéines insolubles dans un détergent dont la protéine tau phosphorylée pathologique, le composant principal d’enchevêtrements enchevêtrements dans AD. Western blot ont démontré la solubilité différentielle des agrégés-tau phosphorylée et la protéine soluble dans un détergent, Endosome précoce Antigen 1 (EEA1) dans le contrôle et le cerveau. Analyse protéomique a également révélé l’enrichissement des β-amyloïde (Aß), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) et de l’apolipoprotéine E (APOE) dans les fractions sarkosyl insoluble du cerveau par rapport à celles du contrôle, compatible avec les stratégies précédentes de fractionnement tissulaire . Par conséquent, ce protocole simple enrichissement est idéal pour un large éventail d’applications expérimentales allant de Western Blot et protéine fonctionnelle épreuves agrégation Co à basé sur la spectrométrie de masse protéomique.
Introduction
Les maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH), sclérose latérale amyotrophique (SLA) et les maladies de prion étroitement apparentées sont proteinopathies caractérisée par l’accumulation progressive de agrégats de protéine insoluble dans le détergent dans le cerveau avec accompagnement cognitives déclinent. 1 , 2 cette caractéristique pathologique partagée est censée jouer un rôle central dans l’étiologie et la physiopathologie de ces maladies neurodégénératives. 2 ces agrégats sont composés de polymères fibres amyloïdes, qui sont composées d’unités de protéines mal repliées montrant Croix βrépétitives-structure. 1 , 2 , 3 , 4 biochimiquement, agrégats amyloïdes sont très résistants à la dénaturation chimique ou thermique et solubilisation,3 qui présente des difficultés particulières pour leur purification, analyse et étudient via des techniques biochimiques classiques. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 sans surprise, la fraction des protéines insolubles dans un détergent a fait l’objet de nombreuses recherches dans la physiopathologie des maladies neurodégénératives impliquant l’accumulation de protéines mal repliées. 6 , 12 , 13 , 14
Les techniques de fractionnement biochimique ont souvent été utilisés pour enrichir la fraction insoluble dans le détergent d’homogénats de cerveau post-mortem. 6 , 12 , 13 , 14 une des méthodes plus courantes consiste à l’extraction séquentielle des homogénats de tissus avec des tampons et des détergents d’accroître la rigueur, suivi par ultracentrifugation pour partitionner les fractions solubles et insolubles. Un fractionnement séquentiel couramment utilisés protocole6,14 implique l’homogénéisation des échantillons de tissus congelés dans un tampon sans tensioactifs hyposodé (LS) et les pellets insolubles qui en résultent sont extraites puis séquentiellement avec tampons contenant du sel élevé, détergents non ioniques, saccharose élevé, détergents ioniques et enfin chaotropes comme urée. 6 , 14 un inconvénient évident de ces protocoles de fractionnement séquentiel un est beaucoup de temps et engagement de travail nécessaire pour les terminer. Y compris l’homogénéisation et l’ultracentrifugation, un protocole typique cinq étapes fractionnement peut prendre plusieurs heures, voire jours pour compléter. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 en outre, agrégats de protéine pathologique autant restent insolubles dans tous, mais les plus dures conditions19,20 la plupart des fractions générées sont d’une utilité limitée. Ainsi, les mesures moins rigoureuses fractionnement utilisant de fortes concentrations en sel et détergents non ioniques sont largement redondants.
Des études antérieures ont montré que le détergent ionique N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) est un excellent candidat pour un protocole simplifié seule étape détergent fractionnement. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 comme un détergent dénaturation, sarkosyl est suffisamment strict pour solubiliser la grande majorité des protéines nativement repliées dans le cerveau sans la solubilisation des agrégats de protéines mal repliées composés de protéine bêta-amyloïde (Aß),6,11 tau phosphorylée (pTau),6 protéines de liaison à l’ADN de goudron 43 (TDP-43),14 alpha-synucléine, tremblante de12,13 ,23 ou U1 petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP U1) tels que U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl étant moins rigoureux que le dodécylsulfate de sodium de détergent anionique omniprésent (SDS), elle conserve moins robustes formes oligomères d’agrégats de protéines mal repliées qui ne peut pas résister aux traitement de SDS. 9
Auparavant, nous avons décrit un protocole de détergent-fractionnement abrégé qui a obtenu des résultats comparables aux méthodes de fractionnement séquentiel plus laborieux. 5 en omettant les étapes de fractionnement moins rigoureux, nous avons pu développer un protocole facile seule étape fractionnement pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau humain post-mortem. 5 ce protocole détaillé décrit ci-après est bien adapté pour un large éventail d’applications expérimentales allant de Western Blot et basé sur la spectrométrie de masse protéomique fonctionnelle repliement et ensemencement d’agrégation des analyses. 5 , 6 , 21
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Protocol
déclaration d’éthique : tous les tissus du cerveau ont été extraites de l’Emory Alzheimer ' s Disease Research Center (ADRC) Banque de cerveaux. Des tissus post-mortem humains ont été acquis en vertu de protocoles appropriés de Institutional Review Board (IRB).
1. homogénéisation et fractionnement
- sélection de tissu
Remarque : Frozen tissus post-mortem de cortex frontal de contrôle sain (Ctl) et pathologiquement AD confirmés ont été sélectionnés parmi la Emory Banque de cerveaux ADRC (n = 2). Évaluation neuropathologique post-mortem de la distribution de plaques amyloïdes a été réalisée selon le Consortium afin de mettre sur pied un registre d’Alzheimer ' s maladie semiquantitative marquant les critères 24, bien que pathologie de l’enchevêtrement neurofibrillaire a été évalué conformément au système de mise en scène de Braak. 16- obtenir congelé des tissus post-mortem de cerveau sain contrôle (Ctl) et pathologiquement AD confirmés. Utilisant des conteneurs de glace sèche, forceps et une lame de rasoir, d’accise ~ portions de 250 mg de matière grise de chaque échantillon de tissu sur jetable taré peser bateaux, en prenant soin d’éviter le tissu de la fonte. Noter le poids de chaque pièce pour être homogénéisés.
- D’accise ~ 250 mg de matière grise à l’aide de pinces et rasoir en inspectant visuellement pour localiser l’interface entre la matière grise extérieure et intérieure de matière blanche. Éviter la substance blanche et surtout, un gros vaisseaux sanguins ou régions sanglantes, les méninges ou mater arachnoïdien. Garder les tissus congelés pendant le processus de découpe en travaillant rapidement et fréquemment en plaçant pesage bateau avec tissu cérébral dans des contenants en polystyrène avec glace sèche
- Enregistrer le poids exact de matière grise excisé de chaque morceau gelé à l’aide d’une balance analytique. Calculer le volume de tampon hyposodé (LS) (voir tableau 1) nécessaires pour l’homogénéisation dounce (5 mL/g, soit 20 % p/v).
- Préparer 10 mL LS tampon avec 1 inhibiteur de la protéase et la phosphatase cocktail et chill sur glace.
- Retirer tissu pesé et pesage bateau de glace sèche et dés en morceaux de 2 x 2 mm à peu près comme il dégèle. Transférez dans un tube de homogénisateur de dounce préalablement réfrigérées 2 mL sur glace
- Ajouter 5 mL/g (20 % p/v) de tampon hyposodé glacee (LS) avec 1 X cocktail inhibiteur de la protéase et de la phosphatase.
- Homogénéisez le tissu cérébral sur la glace en utilisant environ 10 coups de clairance élevée Pilon A et 15 coups de pilon de faible garde B.
- Transfert homogénat tous à un tube en polypropylène 2 mL à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Le tube avec l’étiquette “ TH ” (homogénat Total), le tissu affaire nombre et homogénat volume. aliquote 0,8 mL dans un tube marqué 1,5 mL. L’homogénat tout excès peut être de la même manière aliquotés et congelés à -80 ° C.
- à chaque aliquote de 0,8 mL, ajouter 100 µL de chaque de 5 M de NaCl et sarkosyl 10 % (p/v) à des concentrations de 0,5 M et 1 % p/v, respectivement. Mélanger des tubes bien par inversion et incuber sur glace pour les tubes étiquette 15 min. avec " TH-S " (Total homogénat-Sarkosyl) pour indiquer que les homogénats sont en tampon sarkosyl (tableau 1).
- Soniquer chaque tube pour trois 5 s Pulse à amplitude de 30 % sur la glace (intensité maximale = 40 %) en utilisant une sonde de microtip.
- déterminer les concentrations de protéine des homogénats à l’aide de l’acide bicinchoninic (BCA) dosage 25 méthode.
Remarque : La concentration de protéine moyenne des homogénats de TH-S préparés à 5 mL LS par gramme de tissu est de 15 à 20 mg/mL. Les homogénats peuvent être fractionnés immédiatement ou conservées à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. - Des homogénats de TH-S diluer à 10 mg/mL à l’aide de tampon de sark glacee (tableau 1) avec 1 x inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase.
- Transfert 5 mg protéine (0,5 mL) de chaque homogénat TH-S dans 500 µL en polycarbonate ultracentrifugeuse tubes et de balance des paire avec tampon de Sercq. Charger les tubes dans un rotor préalablement réfrigéré et ultracentrifugeuse à 180 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. transfert le sarkosyl soluble dans les surnageants (S1) pour tubes de 1,5 mL et conserver à -80 ° C.
NOTE : (En option lavage) ajouter 200 µL de sark-tampon de l’ultracentrifugeuse tubes contenant les fractions insolubles dans un détergent (P1) et déloger les pellets (P1) de la partie inférieure des tubes ultracentrifugeuse à l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL.
Tubes - brièvement le pouls-spin inversé pour 2-3 s (≤ 2 500 g x) sur une micro-centrifugeuse pour transférer les granulés (P1) et le tampon pour les tubes de 1,5 mL ci-dessous. Resuspendre les pellets insolubles (P1) dans le tampon sark de pipetage de haut en bas afin d’assurer le culot est perturbé.
- La paire-balance et centrifuger à 180 000 x g pendant une supplémentaire de 30 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant de lavage en option (S2) et incuber les pellets sarkosyl insoluble (P2) dans 50 à 75 µL de tampon de l’urée (tableau 1) avec 1 x PIC (protéase et phosphatase inhibiteur de cocktail) pendant 30 min à température ambiante à solubiliser les Pellet.
NOTE : Urée chaude tampon à température ambiante avant utilisation pour éviter la précipitation de SDS. Pour les applications sensibles au détergent, omettez SDS du tampon de l’urée et tient compte de laver le culot insoluble (P2) faible tampon salin avant resuspendant dans tampon urée. - Transfert des granulés remises en suspension (P2) aux tubes de 0,5 mL et l’utilisation brève (1 s) microtip sonication à amplitude de 20 % (intensité maximale = 40 %) à solubiliser complètement les plombs.
- Déterminer les concentrations de protéine du sarkosyl-soluble (S1) et - insolubles fractions (P2) à l’aide de la BCA de la méthode de dosage. Utiliser ces fractions immédiatement ou conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
2. Immunoblotting
- Western blotting
Remarque : Éponger occidental a été effectuée conformément aux procédures déjà rapportées avec de légères modifications. 5 , 10- préparer 40 µg échantillons totales homogénats (TH-S), sark-soluble (S1), des fractions (P2) sark insoluble dans 1 X Laemmli SDS-page échantillon solution tampon 5 mM PTCE 7. Incuber les échantillons à 95 ° C pendant 5 min. Gel d’échantillons
- charge sur un préfabriqué 10 puits 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE. ELECTROPHORESE à 80 V pour le premier centimètre (10 min) et 120 V pour le reste (60 min) ou jusqu'à ce que le colorant de repérage atteint le fond du gel.
- Utiliser une nouvelle lame de rasoir et couteau de gel pour split-ouvrir la cassette de gel préfabriqué. Couper délicatement les peignes et tout en bas du gel avec une lame de rasoir fraîche.
- Remettre en suspension les pellets insolubles (P1) dans 200 µl de sark-tampon avec 1 x PIC de pipetage up ou down.
- Transfert d’une membrane de nitrocellulose de 0,2 µm en utilisant une méthode de transfert sec sur une machine de transfert (voir la Table des matières).
- Bloquer la membrane dans un tampon bloquant (BB) sans Tween 20 pendant 30 min, suivie avec BB avec 0,05 % Tween 20 (BB/T) pendant 30 min. Après le blocage, rincez la membrane dans SCT/T (0,1 % Tween 20) pendant 5 min enlever l’excès de tampon bloquant.
- Préparer des dilutions de 1 : 1 000 de l’anticorps primaire pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 et EEA1 en BB/T (0,05 % de Tween 20).
- Incuber les membranes en solution d’anticorps primaire pendant la nuit à 4 ° C sous agitation circulaire. Rincer la membrane au SCT/T pour 3 x 15 min.
- Sonde la membrane avec une dilution de 1/20 000 de la fluorescent proche infrarouge secondaires anticorps marqués en BB/T pendant 60 min à température ambiante dans l’obscurité sur l’agitateur. Rincer la membrane pour 3 x 10 min dans SCT/T et 2 x 5 min dans les directives du SCT.
- Scan la membrane à l’aide d’un système à la longueur d’onde d’excitation appropriée (p. ex. 700 nm (canal rouge) pour le colorant infrarouge 680 chèvre anti-souris IgG (H + L) secondaire à 800 nm (couche verte) pour teinture infrarouge 790 âne anti-lapin IgG (H + L d’imagerie infrarouge ) secondaire).
- Utiliser le logiciel d’imagerie pour quantifier les intensités du signal et d’effectuer des mesures de densitométrie selon le fabricant ' instructions s, assurant le réglage auto-document d’information est défini sur moyen tout l’arrière-plan.
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Representative Results
Le protocole abrégée seule étape sarkosyl-fractionnement a été utilisé pour enrichir les agrégats de protéines insolubles dans un détergent de contrôle et de cerveau post-mortem (Figure 1). Les protéines des fractions TH-S, S1, S2 et P2 ont été résolus par SDS-PAGE, fixée pendant 15 min dans le bleu de Coomassie bleu tampon fixateur suivie d’une coloration douce avec du tampon de coloration bleu de Coomassie brillant bleu G-250. L’étape de remise en suspension est facultative puisqu’il y avait un niveau indétectable de protéine dans la fraction de S2 (voir 1.1.14). Analyse par Western blot (Figure 2 a et B) montre clairement que dans cerveau, les agrégats pathologique tau phosphorylée de haute masse moléculaire étaient sarkosyl insoluble, et très peu pTau est resté dans le fractions Sarkosyl-solubles. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 à l’inverse, la majorité des pTau dans le cerveau de contrôle répartis dans la fraction soluble sarkosyl. 5 , 6 , 10 en revanche, EEA1 principalement répartit dans la fraction S1 en contrôle et cerveau (Figure 2). Ici, EEA1 agit comme un marqueur général pour des protéines plus indigènes, non pathologiques qui sont intrinsèquement sarkosyl-soluble5. Notamment, il y a un peu moins signal pour EEA1 dans la fraction soluble (S1) par rapport à la fraction de TH-S, indiquant qu’un bassin mineur de EEA1 est probablement sarkosyl insoluble, encore sous le seuil de détection par western blot avec cet anticorps. Il est également possible que la légère baisse de puissance du signal de EEA1 dans la fraction soluble (S1) est due à non-spécifiques de EEA1 aux tubes ultracentrifugeuse pourrait aussi expliquer le léger écart de résultats escomptés.
Pour comparer l’efficacité du protocole abrégée seule étape fractionnement (Figure 3 a) contre la méthode plus traditionnelle des multi-étapes fractionnement séquentiel (Figure 3 b), les niveaux relatifs des sarkosyl-insolubles protéine précurseur de l’amyloïde (APP), tau (MAPT), petites ribonucléoprotéines nucléaires U1 - 70K (snRNP70) et l’apolipoprotéine E (APOE) ont été comparés par protéomique de la spectrométrie de masse exempte d’étiquette (MS) basée à travers regroupée contrôle (Ctl), déficience cognitive légère (DCL) et AD cas de précédentes études7,18 (Figure 3). Mesures de détergent insoluble APP représente effectivement le peptide Aβ, comme tous les peptides APP tryptiques entièrement quantifié mappé à la région de bêta-amyloïdes de la pleine longueur 695 résidus APP protéine7. Avec les deux méthodes, les niveaux sarkosyl insoluble de tous les quatre protéines pathologiques tendanciel vers le haut en cas MCI et AD par rapport aux témoins, compatibles avec la forte corrélation de déclin cognitif et fardeau pathologique. Dans l’ensemble, l’enrichissement de ces protéines dans les fractions insolubles dans un détergent (P2) ont été remarquablement constant à l’aide de la seule étape18 et fractionnement multi-étapes protocoles7.
Il y a, cependant, des légères différences entre les deux méthodes qui peuvent s’avérer avantageux ou nuisible selon la nature exacte et les objectifs d’une expérience individuelle. Les protéomique comparative de données résumées à la Figure 3 peuvent informer quel protocole utiliser selon les applications et les paramètres expérimentaux spécifiques. Comme on pouvait s’y attendre, il y a un compromis général entre l’enrichissement de l’échantillon et de pureté, avec le protocole simplifié de fractionnement offrant plus les échantillons enrichis avec moins de perte de protéines que le procédé à plusieurs étapes.
Par exemple, fractions insolubles de contrôle établies à l’aide du protocole simplifié (Figure 3 a) présentent des niveaux de fond légèrement plus élevés de maladie les protéines que ceux préparés par l’intermédiaire de l’approche de plusieurs étape. À l’inverse, la technique de fractionnement de la seule étape pourrait être avantageuse pour les protéines de faible abondance tant que l’échantillon global pertes sont considérablement réduits. Par exemple, l’enrichissement relatif d’APOE sarkosyl insoluble dans les cas MCI est significativement plus élevée dans les fractions insolubles préparées via le protocole abrégé (Figure 3A).
Bien que les deux approches sont plus que suffisantes pour observer toute augmentation significative en agrégats de protéines mal repliées maladie pertinentes ou pathologiques, les plus nombreux et vaste fractionnement et pas de lavage de l’approche de plusieurs étape peuvent générer un nettoyeur et signature de protéomiques plus spécifique. Néanmoins, nos données vérifier que la méthode de fractionnement de la seule étape concorde avec les résultats publiés que les agrégats pathologiques telles que la dégénérescence neurofibrillaire tau (ENF), plaques bêta-amyloïdes et prions la tremblante (PrSc) sont insolubles dans sarkosyl, alors que leurs homologues en mode natif pliés restent solubles. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
En calculant les quantités relatives des protéines qui partitionnent dans les fractions insolubles dans un détergent de contrôle (n = 3) et AD (n = 3) cerveau (tableau 2), seulement ~ 10 % de la piscine de protéine totale est sarkosyl insoluble. Lorsque 5 mg de protéine totale de l’homogénat de cerveau (TH-S) est fractionné, 10,4 % et 11,3 % du protéome répartit dans la fraction insoluble dans le détergent dans le contrôle et le cas de l’AD, respectivement. Bien que la quantité totale de protéine insoluble sarkosyl enrichi dans cerveau est légèrement supérieure à la commande, pas de différences significatives ont été observées entre les deux groupes (p = 0,703). Cela indique que repliement et agrégation n’est pas répandus dans le cerveau, mais plutôt limité à un sous-ensemble restreint et spécifique des protéines telles que tau, bêta-amyloïdes et U1 snRNP. 7 , 21 , 22
Figure 1 : schéma de fractionnement Sarkosyl. (A) A post-mortem cerveau humain a été homogénéisé dans faible tampon salin, après quoi sarkosyl et NaCl ont été ajoutés à la concentration finale de 1 % p/v et 0,5 M, respectivement et incubés pendant 15 minutes sur la glace. Après la sonication, les homogénats ont été fractionnés par ultracentrifugation à 180 000 x g pendant 30 min, offrant le surnageant sarkosyl-soluble (S1) et le culot sarkosyl insoluble (P1). Le culot de P1 a été lavé (éventuellement) de sark-tampon et re-sédimenté par ultracentrifugation s’offrir la final sarkosyl insoluble pellet (P2). Cette fraction P2 est solubilisée dans un tampon urée pendant 30 min à température ambiante, suivie par sonication s 3 x 5 avec une sonde microtip propre. Protéines (B) (20 µg) de TH-S, S1, S2 (10 µL) et des fractions de P2 ont été résolues par SDS-PAGE, fixée pendant 15 min dans le bleu de Coomassie bleu tampon fixateur suivie d’une coloration douce avec tampon coloration bleu de Coomassie brillant bleu G-250 du jour au lendemain à la température ambiante.
Figure 2 : enrichissement du tau-phosphorylée dans la fraction insoluble détergente du cerveau Alzheimer. (A et B) Protéines (40 μg) du total (TH-S), (S1) solubles et insolubles (P2) fractions ont été effacées avec un anticorps contre tau phosphorylée à thréonine 231 (pT231) ou AT8 (pSer202, pThr205) afin de démontrer l’enrichissement des espèces de phospho-tau pathologiques dans le fraction insoluble (P2) du cerveau. Dans cerveau, poids moléculaire élevé agrégées tau exclusivement des partitions dans la fraction (P2) de détergent insoluble. (C) EEA1 servi de marqueur de protéines solubles et contrôle de charge relative pour le total (TH-S) et les fractions solubles de (S1) de contrôle et de cerveau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : l’analyse protéomique des protéines AD pathologiques, un protocole de fractionnement étape unique ou à plusieurs étapes. Les niveaux relatifs des protéines insolubles dans sarkosyl représentant APP (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) et APOE diverses maladies différentes entre groupés contrôle, cas MCI et AD à l’aide de la seule étape (A) ou sarkosyl multi-étapes (B) approche de fractionnement. Pour les deux ensembles de données, teneur en protéines est estimée de peptide spectrale matches (MPS) de ces identifié des protéines et normalisée pour définir la valeur maximale à 100. MPS de cas contrôle MCI et AD (n = 5 chacun) ont été utilisés pour le dataset unique-ensemble. Pour l’approche multi-étapes, MPS de deux piscines répétées du contrôle, cas MCI et AD (n = 5 chacun) ont été analysés. Barres d’erreur indiquent les valeurs de la moyenne ± S.E.M. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| solution à 10 % p/v sarkosyl : sel de sodium 10 g N-lauryl-sarcosine par 100 ml de ddH2O (remuer à ta toute la nuit) |
| Low Salt (LS) tampon : 50 mM HEPES pH 7.0, saccharose 250 mM, EDTA 1 mM |
| Tampon Sarkosyl (sark) : Tampon de LS + 1 % (p/v) sarkosyl + 0,5 M de NaCl |
| Urée tampon (conserver à -20 ° C) : 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, urée 8 M, 2 % SDS |
| 4 X SDS chargement tampon : pH de 200 mM Tris-HCl 6,8, 40 % de glycérol, 8 % sodium dodécyl suflate (SDS), 0,4 % de bleu de bromophénol (BPB) et 20 mM PTCE pH 7.0 à FD2O |
| Bleu de Coomassie fixateur tampon : 40 % méthanol, acide acétique 10 % en FD2O |
| Tampon de coloration bleu de Coomassie brillant bleu G-250 : 25 % méthanol, acide acétique à 5 %, 0,1 % coomassie bleu G-250 FD2O |
| Bleu de Coomassie destain tampon : 25 % méthanol, acide acétique 5 % en FD2O |
| 1 X Tris buffered saline (TBS) : 50 mM Tris-HCl de pH 7,45, NaCl 150 mM FD2O |
| 1 X Tris buffered saline avec Tween 20 (SCT/T) : 50 mM Tris-HCl de pH 7,45, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20 ddH en2O |
| 1 X blocage de tampon (BB) : 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 1 % de protéines exclusives (voir la liste des matériaux), 750 mM du Methylchloroisothiazolinone ddH2O |
| 1 tampon bloquant X 0,05 % Tween 20 (BB/T) : 50 mM Tris-HCl de pH 7,45, 150 mM NaCl, 1 % de protéines exclusives (voir liste du matériel), 0,05 % Tween 20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone dans ddH2O |
Tableau 1 : Liste de tampons.
| Échantillon | Échantillon de volume (µL) | Concentration (µg/µL) | Protéines totales (µg) | Protéine totale moyenne (µg) et S.E.M. | % TH-S (5 mg) |
| CTL 1 | 70 | 9,89 | 692.3 | ||
| CTL 2 | 70 | 7,38 | 516,6 | 518,7 (±99.63) | 10,4 % |
| CTL 3 | 70 | 4,96 | 347,2 | ||
| AD 1 | 70 | 9,77 | 683,9 | ||
| AD 2 | 70 | 6,67 | 466,9 | 567,0 (±63.20) | 11,3 % |
| AD 3 | 70 | 7.86 | 550.2 |
Tableau 2 : Quantité de protéine dans les fractions sarkosyl insoluble (P2). En moyenne, le pourcentage de protéine qui répartit dans la fraction insoluble sarkosyl de contrôle (n= 3) et AD (n= 3) cerveau était de 10,4 % et 11,3 %, respectivement. Il n’y avait aucune différence statistiquement significative de la quantité de protéines insolubles sarkosyl de contrôle et le cerveau, comme en témoigne la par de student t-test (p = 0,703) et écart-type des valeurs moyennes (S.E.M.).
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Discussion
Dans les présentes, nous introduisons et discuter d’un protocole de détergent-fractionnement seule étape abrégé qui s’applique à un large éventail d’applications expérimentales allant d’analyse basé sur la spectrométrie de masse protéomique d’une protéine fonctionnelle mauvais repliement des essais et transfert Western. 5 , 6 , 7 , 10 cette méthodologie est peut-être plus efficace lorsqu’il est utilisé pour étudier proteinopathies neurodégénératives telles qu’Alzheimer, ALS, de Huntington, les maladies à prions et les tauopathies divers. Par rapport au protocole original de cinq étapes séquentielles fractionnement, cette procédure pas à pas peut être complétée en une seule journée et offre des résultats très similaires. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
Un aspect important de ce protocole est l’utilisation de sarkosyl comme le détergent de fractionnement. Contrairement aux autres détergents comme Triton X-100 ou le sodium dodecyl sulfate (SDS), sarkosyl semble être bien adapté à cette tâche ; en termes de rigueur et de force de solubilisation, c’est assez fort pour solubiliser la majorité des protéines repliées en natif tout en préservant le détergent-insolubilité, la structure et la fonction des agrégats de protéine les maladies qui sont intrinsèquement sensible au SDS. 5 , 9 en outre, contrairement au SDS, sarkosyl reste soluble à basse température et dans des conditions élevées de sels.
Une autre caractéristique essentielle de ce protocole est la remise en suspension des boulettes (P1) premières sarkosyl insoluble issue de la première série de l’ultracentrifugation. Cette étape de lavage permet des granulés initiales (P1) être complètement extraite et lavé de toute Croix-contamination résiduelle protéines solubles ou total l’homogénat, offrant une fraction protéique insoluble dans le détergent pur et bien définis. Sans l’étape de remise en suspension et lavage de pellet facultatif (P1), des protéines solubles résiduels peuvent subsister dans la fraction insoluble dans le détergent, possiblement confusionnelles résultats ultérieurs et expériences (p. ex. analyse immunoblotting ou protéomique).
La nature insoluble et haut poids moléculaire des protéines mal repliées pathologique agrégats (c.-à-d. tau, phospho-tau et espèces Aβ) présente des défis uniques vers leur isolement et leur analyse via des techniques biochimiques classiques. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 contrairement aux protéines solubles, insolubles dans agrégats tels qu’amyloïdes (Aβ) et des enchevêtrements neurofibrillaires tau hyperphosphorylée (NFTs) ne peut pas être facilement purifiées provenant de tissus post-mortem par des méthodes traditionnelles comme l’immunoprécipitation ou plus rapide chromatographie liquide de protéine (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 par conséquent, le protocole abrégée sarkosyl-fractionnement est une des seules techniques qui permet l’enrichissement facile et l’isolement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent de cerveau post-mortem dans un relativement court délai. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
Alors que des mesures supplémentaires peuvent être utilisés pour isoler un échantillon pur et homogène de protéines agrégées, le protocole de fractionnement sarkosyl permet l’enrichissement facile d’agrégats de protéines insolubles dans un détergent avec engagement relativement peu de temps. 5 , 6 à l’appui de cette hypothèse, des études protéomiques du protéome sarkosyl insoluble confirment que la grande majorité des protéines connues d’agrégation sujets pathologiques partitionner en l’insoluble sarkosyl fraction-dans les deux étapes multiples traditionnels 6 , 11 , 21 ainsi que notre approche nouvelle étape unique fractionnement. 5 , 7 , 9 , 10
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient les Drs Jim Lah et Allan Levey, département de neurologie de Emory, des suggestions et des commentaires utiles. Ce travail a été en partie financé par le partenariat de médecine accélérant (U01AG046161-02), le Emory Alzheimer de grant Disease Research Center (P50AG025688) et un National Institute on Aging accordent (R01AG053960-01) à SNRC Cette recherche a été également soutenue en partie par le noyau de neuropathologie de l’octroi d’installations centrales de Emory Neuroscience NINDS, P30NS055077.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al.
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
