Summary
Um protocolo de fracionamento abreviado para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte é descrito.
Abstract
Neste estudo, descrevemos um protocolo abreviado fracionamento de etapa única para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte. O detergente iônico N-Lauril-sarcosina (sarkosyl) efetivamente solubiliza proteínas dobradas nativamente no tecido cerebral, permitindo o enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente de uma ampla gama de proteinopathies neurodegenerativas, tais como A doença de Alzheimer (AD), doença de Parkinson e esclerose lateral amiotrófica e doenças de príon. Controle humano e tecidos do cérebro após a morte de AD foram homogeneizadas e sedimentada por ultracentrifugação na presença de sarkosyl para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente incluindo tau fosforilada patológica, o componente do núcleo do tangles emaranhados em AD. Mancha ocidental demonstrou a solubilidade diferencial de agregados-tau fosforilada e a proteína solúvel em detergente, Early Endosome antígeno 1 (EEA1) no controle e no cérebro do AD. Análise proteômica também revelou o enriquecimento de β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) e apolipoproteína E (APOE) nas fracções sarkosyl insolúveis do cérebro AD comparados de controle, consistente com estratégias de fracionamento de tecido anterior . Assim, o presente protocolo simples enriquecimento é ideal para uma ampla gama de aplicações experimentais variando de mancha ocidental e proteína funcional ensaios de agregação co a espectrometria de massa-baseado proteomics.
Introduction
Doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD), esclerose lateral amiotrófica (ela) e as doenças de príon estreitamente relacionadas são proteinopathies caracterizadas pelo acúmulo gradual de agregados de proteína insolúvel em detergente no cérebro com acompanhamento cognitivo declinam. 1 , 2 este recurso compartilhado patológico é pensado para jogar um papel central na etiologia e fisiopatologia dessas doenças neurodegenerativas. 2 estes agregados, normalmente, compostos de fibras de amiloides poliméricas, que são compostas de repetir unidades de misfolded proteínas exibindo Cruz β-estrutura. 1 , 2 , 3 , 4 bioquimicamente, agregados amiloides são altamente resistentes à desnaturação química ou térmica e solubilização,3 que apresenta desafios únicos para a sua purificação, análise e estudo através de técnicas bioquímicas tradicionais. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 não é novidade, a fração de proteína insolúvel em detergente tem sido o foco de muita pesquisa em fisiopatologia das doenças neurodegenerativas que envolvem o acúmulo de misfolded proteínas. 6 , 12 , 13 , 14
Técnicas de fracionamento bioquímico frequentemente têm sido utilizadas para enriquecer a fração insolúvel em detergente de homogenates cerebral post-mortem. 6 , 12 , 13 , 14 um dos métodos mais comuns envolve a extração sequencial de tecido homogenates com buffers e detergentes de aumentar o rigor, seguido por ultracentrifugação para particionar as frações solúveis e insolúveis. Um protocolo comumente usado fracionamento sequencial6,14 envolve a homogeneização de amostras de tecido congelado em um buffer de detergente livre baixo sal (LS) e as pelotas insolúveis resultantes então são extraídas sequencialmente com amortecedores que contêm sal elevado, detergentes não-iônicos, alta sacarose, detergentes iônicos e finalmente chaotropes como ureia. 6 , 14 uma desvantagem óbvia de tais protocolos um fracionamento sequencial é o tempo substancial e compromisso de trabalho necessário para concluí-las. Incluindo a homogeneização e ultracentrifugação, um protocolo típico de cinco etapas de fracionamento pode levar várias horas ou mesmo dias para completar. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 além disso, como muitos agregados de proteína patológica permanecem insolúveis em todos, mas as mais adversas condições19,20 a maioria das frações geradas são de valor limitado. Assim, as etapas de fracionamento menos rígidas utilizando altas concentrações de sal e detergentes não-iônicos são em grande parte redundantes.
Estudos anteriores mostraram que o detergente iônico N-Lauril-sarcosina (sarkosyl) é um excelente candidato para um protocolo simplificado fracionamento de detergente de etapa única. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 como um detergente de desnaturação, sarkosyl é suficientemente rigorosa para solubilizar a maioria vasta das proteínas nativamente dobradas no cérebro sem solubilizing agregados de misfolded proteínas compostos por beta-amiloide (Aβ),6,11 tau fosforilada (pTau),6 TAR ADN-proteína obrigatória 43 (TDP-43),14 alfa-synuclein,12,13 do tremor epizoótico,23 ou U1 pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNPs U1) como U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Como sarkosyl é menos rigoroso do sulfato dodecyl de sódio detergente aniônico onipresente (SDS), preserva menos robustas oligoméricas formas de agregados de misfolded proteínas que não podem suportar o tratamento de SDS. 9
Anteriormente, nós descrevemos um protocolo de detergente-fracionamento Abreviado que obtiveram resultados comparáveis aos métodos de fracionamento sequencial mais trabalhosos. 5 , omitindo as menos rigorosas etapas de fracionamento, fomos capazes de desenvolver um protocolo facile fracionamento de etapa única para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte. 5 este protocolo detalhado aqui descrito é bem adequado para uma ampla gama de aplicações experimentais que variam de mancha ocidental e ensaios de espectrometria de massa-baseado proteomics para enrolamento de proteína funcional e propagação de agregação. 5 , 6 , 21
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Protocol
declaração de ética: todos os tecidos do cérebro foram obtidos a partir da Emory Alzheimer ' s doença Research Center (ADRC) banco de cérebro. Tecidos humanos após a morte foram adquiridos ao abrigo de protocolos apropriados institucional Review Board (IRB).
1. homogeneização e fracionamento
- seleção de tecido
Nota: congelado o tecido do córtex frontal após a morte de controle saudável (Ctl) e patologicamente casos confirmados de AD foram seleccionados a partir do Emory Banco de cérebro ADRC (n = 2). Post-mortem neuropatológica avaliação da distribuição de placa amiloide foi realizada de acordo com o consórcio para estabelecer um registro para Alzheimer ' s doença semi-quantitativa marcando critérios 24, embora patologia do tangles emaranhado foi avaliada em conformidade com o sistema de preparo de Braak. 16- obter congelado o tecido cerebral post-mortem de controle saudável (Ctl) e patologicamente confirmado casos de AD. Utilizando recipientes de gelo seco, fórceps e uma lâmina de barbear, impostos especiais de consumo ~ porções de 250 mg de matéria cinzenta de cada amostra de tecido na tarada descartável pesam barcos, tendo o cuidado de evitar que o tecido descongelar. Registrar o peso de cada peça para ser homogeneizado.
- Impostos ~ 250 mg de matéria cinzenta, usando a pinça e navalha, inspecionando visualmente para localizar a interface entre a substância cinzenta externa e interna de substância branca. Evitar a substância branca e, mais importante, qualquer grandes vasos sanguíneos ou regiões sangrentas, meninges ou aracnoide. Mantenha o tecido congelado durante o processo de corte a trabalhar rapidamente e frequentemente colocando o barco pesagem com tecido cerebral em recipientes de isopor com gelo seco
- Gravar o peso exato da matéria cinzenta extirpado da cada pedaço congelado usando uma balança analítica. Calcular o volume de tampão baixo sal (LS) (ver tabela 1) necessário para homogeneização de homogenizacao (5 mL/g ou 20% w/v).
- Preparar 10 mL LS de tampão com 1x do inibidor de protease e fosfatase cocktail e calma na Ice.
- Remover tecido pesado e pesagem do barco de gelo seco e corte em pedaços de 2 x 2 mm aproximadamente, enquanto ele derrete. Transferência para um tubo de homogeneizador de pre-refrigerados homogenizacao 2ml no gelo
- Adicionar 5 mL/g (20% w/v) do buffer de sal baixo gelada (LS) com 1 X coquetel de inibidor de protease e fosfatase.
- Homogenize no tecido cerebral no gelo usando aproximadamente 10 traços de alta apuramento pilão A e 15 golpes de pilão de depuração baixa B.
- Transferir tudo homogeneizado para um tubo de polipropileno 2 mL, usando um pipeta Pasteur de vidro. Rótulo do tubo com “ TH ” (Homogenate Total), o tecido caso número e homogeneizado volume. alíquota 0,8 mL num tubo rotulado 1,5 mL. Qualquer excesso homogenate pode ser similarmente aliquotadas e armazenado a -80 ° C.
- a cada 0,8 mL alíquota, adicionar 100 µ l cada de 5 M NaCl e sarkosyl de 10% (p/v) para as concentrações de 0,5 M e 1% p/v, respectivamente. Misturar os tubos bem pela inversão e incubar no gelo por 15 min. de tubos de rótulo com " TH-S " (Total homogeneizado-Sarkosyl) para indicar que o homogenates estão no buffer de sarkosyl (tabela 1).
- Proceda à sonicação cada tubo para pulsos de três 5 s em 30% amplitude no gelo (intensidade máxima = 40%) usando uma sonda de microtip.
- determinar as concentrações de proteína do homogenates usando o ácido bicinchoninic (BCA) ensaio 25 método.
Nota: A concentração de proteína média de TH-S homogenates preparado em 5 mL LS por grama de tecido é de 15-20 mg/mL. O homogenates pode ser fracionada imediatamente ou armazenado a-80 ° C até o uso. - Homogenates TH-S diluir a 10 mg/mL, usando gelada sark buffer (tabela 1) com 1 x inibidores de protease e fosfatase.
- Transferir 5 mg proteína (0,5 mL) de cada homogenate TH-S em 500 tubos de se µ l em policarbonato e par-equilíbrio com buffer de sark. Carregar os tubos em um rotor pre-refrigerado e se a 180.000 x g durante 30 min a 4 ° C. transferência do sarkosyl-solúvel fracções sobrenadantes (S1) para tubos de 1,5 mL e armazene a -80 ° C.
Nota: (Lavagem opcional) adicionar 200 µ l de sark-buffer para o se tubos contendo as frações insolúveis em detergente (P1) e desalojar as pelotas (P1) da parte inferior dos tubos se utilize uma ponta de pipeta de 200 µ l.
Tubos - brevemente de pulso-gire o invertido para 2-3 s (≤ 2.500 x g) em um microcentrifuge para transferir o buffer e pelotas (P1) para os tubos de 1,5 mL abaixo. Resuspenda as pelotas insolúveis (P1) no buffer de sark pipetando para cima e para baixo para garantir a pelota é interrompida.
- Par-equilíbrio e centrifugar 180.000 x g por um adicional 30 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante de lavagem opcional (S2) e incube as pelotas de sarkosyl insolúveis (P2) em 50-75 µ l de tampão de ureia (tabela 1) com 1 x PIC (protease e fosfatase inibidor cocktail) por 30 min à temperatura ambiente para solubilizar o pelota.
Nota: Buffer de ureia quente a temperatura ambiente antes do uso para evitar a precipitação de SDS. Para aplicações sensíveis ao detergente, omitir SDS de buffer de ureia e considerar lavar o sedimento insolúvel (P2) no baixo sal buffer antes de resuspending no buffer de ureia. - Transferir as ressuspensa Pelotas (P2) para tubos de 0,5 mL e usar breve (1 s) microtip sonication em amplitude de 20% (intensidade máxima = 40%) para solubilizar totalmente as pelotas.
- Determinar as concentrações de proteína de sarkosyl-solúvel (S1) e insolúveis (P2) frações usando o BCA método de ensaio. Use estas frações imediatamente ou armazenar a-80 ° C até o uso.
2. Immunoblotting
- mancha ocidental
Nota: mancha ocidental foi realizada de acordo com os procedimentos anteriormente relatados com ligeiras alterações. 5 , 10- preparar 40 µ g amostras de homogenates total (TH-S), sark-solúvel (S1) e frações de sark insolúveis (P2) em 1 amortecedor da amostra X Laemmli SDS-page com pH TCEP 5 mM 7. Incubar as amostras a 95 ° C por 5 min. Amostras de
- carga em SDS-PAGE um pré-moldado bem 10 4-12% Bis-Tris gel. Electrophorese em 80 V para o primeiro centímetro (10 min) e 120 V para o restante (60 min), ou até que a tintura de seguimento atinge a parte inferior do gel.
- Use uma lâmina de barbear fresca e gel de faca para dividir-abrir a gaveta do gel de pre-cast. Delicadamente cortar fora os pentes e inferior do gel com uma lâmina de barbear fresco.
- Resuspenda as pelotas insolúveis (P1) em 200 µ l sark-buffer com 1x PIC pipetando cima e para baixo.
- Transferência para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 µm usando um método de transferência de seco em uma máquina de mancha (consulte a tabela de materiais).
- Bloquear a membrana em tampão de bloqueio (BB) sem Tween 20 por 30 min, seguida com BB com 0,05% Tween 20 (BB/T) por 30 min. Após o bloqueio, lavar a membrana em TBS/T (0.1% Tween 20) por 5 min remover o tampão de bloqueio excesso.
- Preparar diluições de 1:1,000 de pT231 os anticorpos primários, Tau-2 (pan tau), AT8 e EEA1 no BB/T (0,05% Tween 20).
- Incubar as membranas em solução de anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, com agitação circular. Lavar a membrana em TBS/T 3 x 15 min.
- Sonda a membrana com uma diluição de 1: 20.000 de fluorescente-etiquetadas infravermelho próximo anticorpo secundário no BB/T para 60 min à temperatura ambiente na escuridão agitador. Lavar a membrana para 3 x 10 min na TBS/T e 2 x 5 min em TBS
- Scan a membrana usando um sistema no comprimento de onda de excitação apropriada (por exemplo, 700 nm (canal vermelho) para tintura infravermelho 680 cabra anti-rato IgG (H + L) secundário e 800 nm (canal verde) para tintura infravermelho 790 burro anti-rabbit IgG (H + L de imagens de infravermelho secundária)).
- Usar o software de imagem para quantificar a intensidade do sinal e executar medidas de densitometria conforme o fabricante ' instruções de s, garantir autoconfiguração de fundo é definido como média o fundo todo.
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Representative Results
O protocolo de sarkosyl de etapa única abreviado-fracionamento foi usado para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente de controle e o cérebro após a morte de AD (Figura 1). Proteínas de frações TH-S, S1, S2 e P2 foram resolvidas por SDS-PAGE, fixado por 15 min em Coomassie azul reserva fixador seguida de coloração suave com buffer de coloração azul brilhante de Coomassie G-250. A etapa de ressuspensão é opcional, desde que não havia níveis indetectáveis de proteína na fração S2 (ver 1.1.14). Análise ocidental do borrão (Figura 2A e B) demonstra claramente que no cérebro do AD, os agregados patológica alto peso molecular tau fosforilada eram insolúveis em sarkosyl, e muito pouco pTau permaneceu na Sarkosyl-solúvel fracções. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 por outro lado, a maioria dos pTau no cérebro de controle dividido na fração solúvel em sarkosyl. 5 , 6 , 10 por outro lado, EEA1 principalmente particiona em fração de S1 em controle e cérebro AD (Figura 2). Aqui, EEA1 atua como um marcador geral para mais nativos, não-patológica de proteínas que são inerentemente solúvel em sarkosyl5. Notadamente, há um pouco menos sinal para EEA1 na fração solúvel (S1), em comparação com a fração de TH-S, indicando que uma piscina menor de EEA1 é provável sarkosyl insolúveis, ainda abaixo do limite de detecção por western blot com este anticorpo específico. É igualmente possível que o ligeiro decréscimo na intensidade do sinal de EEA1 na fração solúvel (S1) é devido à ligação não específica de EEA1 para os tubos se poderia também explicar o pequeno desvio de resultados esperados.
Para aferir a eficácia do protocolo de fracionamento de etapa única abreviado (Figura 3A) contra a metodologia mais tradicional de fracionamento sequencial de várias etapas (Figura 3B), os níveis relativos de sarkosyl insolúveis proteína precursora amiloide (APP), tau (MAPT), small nuclear ribonucleoprotein U1 - 70K (snRNP70) e apolipoproteína E (APOE) foram comparados por espectrometria de massa livre de rótulo (MS) com base em proteômica do outro lado em pool controle (Ctl), transtorno cognitivo leve (MCI) e AD casos de estudos anteriores7,18 (Figura 3). Medições de insolúvel em detergente APP representa efetivamente o peptídeo Aβ, como todos os peptídeos APP totalmente tryptic quantificada mapeado para a região Aβ do comprimento total 695 resíduo APP proteína7. Com ambos os métodos, os níveis de sarkosyl insolúveis de todas as proteínas patológicas quatro direcionados para cima em MCI e AD casos em relação a controles, consistentes com a forte correlação de declínio cognitivo e carga patológica. Em geral, enriquecimento destas proteínas em frações insolúveis em detergente (P2) eram notavelmente consistente usando o passo a passo18 e protocolos de fracionamento multi-passo7.
No entanto, existem pequenas diferenças entre as duas metodologias que possam revelar vantajosa ou deletérios consoante a natureza e os objetivos de uma experiência individual. Os dados comparativos proteomic resumidos na Figura 3 podem informar qual protocolo usar dependendo de parâmetros experimentais específicos e aplicativos. Como se poderia esperar, há uma compensação geral entre o enriquecimento de amostra e pureza, com o protocolo de fracionamento simplificados proporcionando mais enriquecidas amostras com menos perda de proteína do que o método de várias etapa.
Por exemplo, frações insolúveis de controle preparadas usando o protocolo simplificado (Figura 3A) exibem um pouco fundo níveis mais altos de proteínas doença relevantes aqueles preparados através da abordagem de várias etapa. Por outro lado, a técnica de fracionamento de etapa única pode ser vantajosa para baixo-abundância proteínas que a amostra global perdas são significativamente reduzidas. Por exemplo, o enriquecimento relativo de sarkosyl insolúveis APOE em casos MCI é significativamente maior nas fracções insolúveis preparadas através do protocolo abreviado(Figura 3).
Embora ambas as abordagens são mais do que adequado para observar um aumento significativo de agregados de proteínas misfolded patológica ou relevantes para a doença, os mais numerosos e fracionamento extensivo e etapas de lavagem da abordagem de várias etapa podem gerar um produto de limpeza e assinatura de proteomic mais específica. No entanto, nossos dados verifique se o método de fracionamento de etapa única é consistente com resultados publicados que agregados patológicos como neurofibrilares tau (NFTs), placas Aβ e príons scrapie (Pr,Sc) são insolúveis em sarkosyl, enquanto suas contrapartes nativamente dobrados permanecem solúveis. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
Calculando-se os montantes relativos da proteína que particionem em frações insolúveis em detergente de controle (n = 3) e AD (n = 3) cérebro (tabela 2), somente ~ 10% do pool total de proteína é sarkosyl insolúveis. Quando proteínas totais de 5 mg de cérebro homogeneizado (TH-S) é fracionada, 10,4% e 11,3% do proteome particiona na fração insolúvel em detergente no controle e casos de AD, respectivamente. Embora a quantidade total de proteínas insolúveis sarkosyl enriquecida no cérebro AD é ligeiramente superior ao controle, sem diferenças significativas foram observadas entre os dois grupos (p = 0,703). Isto indica que enrolamento de proteínas e agregação não é generalizadas no cérebro de AD, mas bastante limitado a um subconjunto estreito e específico de proteínas tais como tau, Aβ e U1 snRNPs. 7 , 21 , 22
Figura 1: esquema de fracionamento Sarkosyl. Cérebro humano após a morte do (A) A foi homogeneizado em buffer de sal baixo, após o qual sarkosyl e NaCl foram adicionados à concentração final de 1% p/v e 0,5 M, respectivamente e incubadas durante 15 min no gelo. Depois sonication, os homogenates foram fracionados por ultracentrifugação a 180.000 x g durante 30 min, proporcionando o sobrenadante sarkosyl-solúvel (S1) e o pellet de sarkosyl insolúveis (P1). A pelota de P1 (OPCIONALMENTE) foi lavada com buffer de sark e re-sedimentada pela ultracentrifugação para pagar a pelota de sarkosyl insolúveis final (P2). Esta fração P2 foi solubilizada no buffer de ureia para 30 min à temperatura ambiente, seguida de 3 x 5 sonication de s com uma sonda de microtip limpo. (B) proteínas (20 µ g) de TH-S, S1, S2 (10 µ l) e P2 fracções foram resolvidas por SDS-PAGE, fixado por 15 min em Coomassie azul reserva fixador seguida de coloração suave com buffer de coloração azul brilhante de Coomassie G-250 durante a noite em temperatura ambiente.
Figura 2: enriquecimento de tau fosforilada na fração insolúvel detergente do cérebro AD. (A e B) Proteína (40 μg) do total (TH-S), (S1) solúvel e insolúvel (P2) fracções foram destruídas com um anticorpo contra tau fosforilada em treonina 231 (pT231) ou AT8 (pSer202, pThr205) para demonstrar o enriquecimento de espécies fosfo-tau patológica na fração insolúvel (P2) do cérebro de AD. No cérebro de AD, de alto peso molecular agregados tau exclusivamente partições em fração insolúvel em detergente (P2). (C) EEA1 serviu como um marcador de proteína solúvel e controle de carregamento relativo para o total (TH-S) e solúvel (S1) frações de controle e o cérebro de AD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise proteômica patológica proteínas do AD usando um protocolo de etapa única ou várias etapas de fracionamento. Os níveis relativos das proteínas insolúveis sarkosyl representante APP (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) e APOE através de diferentes doenças entre pool controle, casos MCI e AD usando o único passo (um) ou várias etapas (B) sarkosyl abordagem de fracionamento. Para ambos os conjuntos de dados, nível de proteína foi estimado pelo peptídeo espectral partidas (PSMs), estes identificaram proteínas e normalizado para definir o máximo de 100. PSMs de casos controle, MCI e AD (n = 5 cada) foram usados para o conjunto de dados single-conjunto. Para a abordagem de várias etapa, PSMs de dois pools de replicar de controle, casos MCI e AD (n = 5 cada) foram analisados. Barras de erro indicam os valores da média ± no MEV mostrou clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| solução a 10% w/v sarkosyl: sal de sódio de 10 g N-Lauril-sarcosina por 100 ml de DDQ2O (celeuma em RT durante a noite) |
| Baixa em sal (LS) tampão: 50 mM HEPES pH 7.0, sacarose de 250 mM, 1 mM EDTA |
| Buffer Sarkosyl (sark): Buffer de LS + 1% (p/v) sarkosyl + 0,5 M de NaCl |
| Ureia tampão (loja a -20 ° C): 50 mM Tris-HCl com pH 8,5, ureia 8m, 2% SDS |
| Tampão de carregamento SDS X 4: pH de 200 mM Tris-HCl 6,8, 40% de glicerol, 8% suflate de dodecil de sódio (SDS), 0,4% bromofenol (BPB) e pH 7.0 do TCEP 20mm em ddH2O |
| Coomassie fixador buffer: 40% de metanol, ácido acético a 10% em ddH2O |
| Tampão de coloração azul brilhante de Coomassie G-250: 25% de metanol, ácido acético a 5%, 0,1% coomassie blue G-250 em ddH2O |
| Coomassie destain reserva: 25% de metanol, ácido acético a 5% em ddH2O |
| 1 X Tris tamponada salino (TBS): pH de 50 mM Tris-HCl 7.45, 150 mM de NaCl em ddH2O |
| 1 X Tris tamponada salino com Tween 20 (TBS/T): pH de 50 mM Tris-HCl 7.45, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20 ddH em2O |
| 1 X bloqueio tampão (BB): 50 mM Tris-HCl com pH 7,45, 150 mM de NaCl, 1% de proteína proprietárias (ver lista de materiais), 750mm Methylchloroisothiazolinone em ddH2O |
| 1 buffer X bloqueio com 0,05% Tween 20 (BB/T): pH 50 mM Tris-HCl 7,45, 150 mM de NaCl, 1% de proteína proprietárias (ver lista de materiais) 0,05% Tween 20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone de ddH2O |
Tabela 1: Lista de Buffers.
| Amostra | Volume de amostra (µ l) | Concentração (µ g / µ l) | Proteína total (µ g) | Proteína Total média (µ g) e no MEV mostrou | % TH-S (5 mg) |
| 1 CTL | 70 | 9.89 | 692.3 | ||
| CTL 2 | 70 | 7,38 | 516.6 | 518.7 (±99.63) | 10,4% |
| CTL 3 | 70 | 4.96 | 347.2 | ||
| AD 1 | 70 | 9.77 | 683.9 | ||
| ANÚNCIO 2 | 70 | 6,67 | 466.9 | 567.0 (±63.20) | 11,3% |
| 3 AD | 70 | 7,86 | 550.2 |
Tabela 2: Quantidade de proteína em frações de sarkosyl insolúveis (P2). Em média, a porcentagem de proteína que particiona em fração insolúvel em sarkosyl de controle (n= 3) e AD (n= 3) cérebro foi 10,4% e 11,3%, respectivamente. Não houve nenhuma diferença estatisticamente significativa da quantidade de proteínas insolúveis em sarkosyl de controle e o cérebro de AD, como evidenciado pelo por student t-teste (p = 0,703) e erro padrão da média (no MEV mostrou) valores.
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Discussion
Neste documento vamos apresentar e discutir um protocolo de detergente-fracionamento de etapa única Abreviado que é aplicável a uma ampla variedade de aplicações experimentais que variam de análise proteômica de espectrometria de massa-baseado a proteína funcional ensaios de enrolamento e mancha ocidental. 5 , 6 , 7 , 10 esta metodologia é talvez mais eficaz quando usado para estudar proteinopathies neurodegenerativas como Alzheimer, ALS, a doença de Huntington, doenças do prião e as vários Tauopatias. Em comparação com o protocolo original do fracionamento sequencial de cinco etapas, este procedimento passo a passo pode ser concluído em um único dia e proporciona resultados muito semelhantes. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
Um aspecto importante do protocolo é o uso de sarkosyl como o detergente de fracionamento. Em contraste com outros detergentes como Triton X-100 ou sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS), sarkosyl parece ser bem adequado para esta tarefa; em termos de rigor e solubilizing força, é forte o suficiente para solubilizar a maioria das proteínas nativamente dobradas, preservando o detergente-insolubilidade, estrutura e função dos agregados de proteína doença relevantes que são inerentemente sensível a SDS. 5 , 9 além disso, ao contrário de SDS, sarkosyl permanece solúvel em baixas temperaturas e em condições de sal elevadas.
Outra característica fundamental do presente protocolo é a ressuspensão das primeiras pelotas sarkosyl insolúveis (P1) após a primeira rodada de ultracentrifugação. Esta etapa de lavagem permite as pelotas iniciais (P1), para ser completamente extraído e lavado de qualquer Cruz-contaminação residual proteínas solúveis ou total homogeneizado, proporcionando uma fração da proteína insolúvel em detergente de puro e bem definido. Sem a etapa de ressuspensão e lavagem opcional da pelota (P1), proteínas solúveis residual poderá manter-se na fração insolúvel em detergente, possivelmente confundir subsequentes resultados e experiências (ou seja, a análise immunoblotting ou proteômica).
A natureza insolúvel e alto peso molecular de proteínas misfolded patológica agregados (ou seja, tau, fosfo-tau e espécies Aβ) presentes desafios em direção a seu isolamento e análise através de técnicas bioquímicas tradicionais. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 ao contrário de proteínas solúveis, insolúveis agrega como amiloides (Aβ) e hyperphosphorylated tau tangles neurofibrillary (NFTs) não pode ser facilmente purificadas de tecido pós-morte por métodos tradicionais, tais como imunoprecipitação ou rápido cromatografia líquida de proteína (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 assim, o protocolo de sarkosyl abreviado-fracionamento é uma das técnicas a única que permite o fácil enriquecimento e isolamento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro após a morte dentro de um comparativamente curto-prazo. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
Enquanto etapas adicionais podem ser empregadas para isolar uma amostra pura, homogênea de agregados da proteína, o protocolo de fracionamento de sarkosyl permite o enriquecimento superficial dos agregados de proteína insolúvel em detergente com compromisso de tempo comparativamente pequeno. 5 , 6 em apoio esta hipótese, estudos de proteomic do proteome sarkosyl insolúveis confirmam que a grande maioria das proteínas conhecidas de propensos a agregação patológicas partição para o sarkosyl-insolúvel fração-em ambos os tradicionais várias etapas 6 , 11 , 21 , bem como a nossa abordagem de romance fracionamento de etapa única. 5 , 7 , 9 , 10
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer os Drs Jim Lah e Allan Levey, Emory departamento de Neurologia, sugestões e comentários úteis. Este trabalho foi parcialmente financiado pela parceria de medicina acelerando subvenção (U01AG046161-02), o Emory Alzheimer centro de pesquisa da doença (P50AG025688) e um Instituto Nacional sobre envelhecimento concedem (R01AG053960-01) para N.T.S. Esta pesquisa também foi apoiada em parte pelo núcleo neuropatologia da subvenção Emory neurociência NINDS núcleo instalações, P30NS055077.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
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