Summary
Dit protocol maakt het mogelijk om de celcellen van een enkele cel te onderscheiden van de differentieel onderscheidende Vibrio parahaemolyticus zwemmer en zwermcellen. De methode produceert een populatie van zwermcellen die gemakkelijk beschikbaar zijn voor enkelvoudige celanalyse en behandelt de bereiding van celculturen, inductie van zwarmerdifferentiatie, monsterbereiding en beeldanalyse.
Abstract
Het vermogen om de intracellulaire lokalisatie van eiwitten te bestuderen is essentieel voor het begrijpen van veel cellulaire processen. Op zijn beurt vereist dit de mogelijkheid om enkele cellen te verkrijgen voor fluorescentiemicroscopie, die bijzonder uitdagend kan zijn bij beeldcellen die in bacteriële gemeenschappen bestaan. Bijvoorbeeld bestaat de menselijke pathogeen Vibrio parahaemolyticus als korte staafvormige zwemmercellen in vloeibare omstandigheden die bij oppervlaktecontact onderscheiden maken in een subpopulatie van sterk verlengde zwermcellen die zijn gespecialiseerd voor groei op vaste oppervlakken. In dit artikel wordt een methode beschreven voor het uitvoeren van single-cell fluorescence microscopy analyse van V. parahaemolyticus in zijn twee differentiële toestanden. Dit protocol stimuleert zeer differentiėle differentiatie van V. parahaemolyticus in een levenscyclus van de zwermcellen en vergemakkelijkt hun proliferatie over vaste oppervlakken. De methode produceert flares van gedifferentieerde zwermcellen die zich uitstrekken van tHij rand van de zwermkolonie. Op het punt van de swarm-flares bevinden zich zwarmercellen in een enkele laag cellen, waardoor ze gemakkelijk kunnen worden overgebracht naar een microscoopschuif en daaropvolgende fluorescentiemicroscopie-imaging van enkele cellen. Daarnaast wordt de workflow van beeldanalyse voor de demografische representatie van bacteriële samenlevingen gepresenteerd. Als principieel bewijs wordt de analyse van de intracellulaire lokalisatie van chemotaxis signalerende arrays in zwemmer- en zwemmercellen van V. parahaemolyticus beschreven.
Introduction
Bacteriën ervaren voortdurend veranderingen in hun externe milieu en hebben verschillende technieken ontwikkeld om hun gedrag te wijzigen en aan te passen. Een dergelijk mechanisme behelst differentiatie in verschillende celsoorten die de gewijzigde omgeving beter aanvullen. Differentiatie omvat vaak grote veranderingen in de regulering van de celcyclus, celmorfologie en de spatiotemporale organisatie van de cellen. Een organisme dat onderscheid kan ondergaan is Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus behoort tot de Vibrionaceae , een familie van proteobacteriën die gewoonlijk vers of zout water bezitten. Vibrionaceae worden wijd verspreid in het milieu en omvatten verschillende soorten die intestinale infecties veroorzaken bij mensen, ook Vibrio cholerae. V. Parahaemolyticus is een dimorfe organisme en is in staat om te onderscheiden in twee afzonderlijke celtypes als reactie om veranderingen aan te passen aan zijnExtern milieu. In waterige omgevingen bestaat het als een korte staafvormige zwemmercel met een enkele polaire flagellum die zich in de oude celpaal bevindt. Bij oppervlaktecontact wordt differentiatie in een zwarmercellen geactiveerd. Swarmer-celdifferentiatie omvat twee belangrijke veranderingen: zwemmere celmorfogenese door remming van celverdeling en de inductie van een tweede flagella systeem. Dit resulteert in de vorming van een peritriche en sterk verlengde staafvormige zwermcellen, die de zwaartekracht kunnen voortzetten, waarbij divisie-gebeurtenissen resulteren in nageslachtswarmercellen of alternatief in zwemmercellen onderscheiden.
Verschillende factoren zijn gemeld om zwarmerdifferentiatie te beïnvloeden of te beïnvloeden. De primaire stimulus lijkt te worden aangedreven door mechanosensing waar V. parahaemolyticus het polaire flagellum gebruikt als een tactiele sensor die remming van de rotatie detecteert bij oppervlaktecontact, maar er zijn verschillende andere factoren betrokken alsGoed 1 . In het laboratorium kan de rotatie van het polaire flagellum kunstmatig worden geremd door toevoeging van fenamil, die de natriumkanaal gedreven flagellaire rotatie blokkeert, waardoor zwarmer differentiatie 2 wordt geïnduceerd. Bovendien werd Vibrio alginolyticus in een eerdere studie geïnduceerd om te zwermen op vaste media als cellen op groeimedium werden gepropageerd in een Petri-schaal verzegeld met duidelijke plastic tape. Alkali-verzadigd filterpapier voorkomt onder deze omstandigheden zwermen, waardoor erop wordt gewezen dat één of meer vluchtige zuren betrokken kunnen zijn bij inductie van zwermen. Zo verzegelt de Petri schotel met plastic tape die waarschijnlijk is toegestaan voor de accumulatie van vluchtige zuren, gevormd als bijproducten van cellulaire metabolisme, binnen de hoofdruimte van de plaat. Hetzelfde effect werd bereikt wanneer H202 werd toegevoegd aan het groeimedium in niet-afgesloten Petri-schalen om kunstmatig vluchtige zuren kunstmatig te produceren door hydrocomponenten van mediakomponenten
V. parahaemolyticus differentiatie omvat grote veranderingen in de regulering van celverdeling, cellulaire morfologie en de positionering van macromoleculaire machines zoals flagellA en chemotaxis apparaten - processen die allemaal de specifieke lokalisatie van eiwitten in overeenstemming met de celcyclus vereisen. Zo is het vermogen om de intracellulaire lokalisatie van dergelijke eiwitten te bestuderen essentieel voor het begrijpen van de hiervoor genoemde cellulaire processen. Om dergelijke studies te verrichten is fluorescentiemicroscopie op enkele cellen vereist. Dit kan bijzonder uitdagend zijn bij beeldcellen die in dichte bacteriepopulaties bestaan, zoals bij zwermcellen geldt. Er zijn pogingen gedaan om zwarmerdifferentiatie in vloeibare media te veroorzaken, die mogelijk cellen voor microscopie studies kunnen genereren. En alhoewel deze cellen op transcriptioneel niveau de zwarmer-differentieringsprogramma gedeeltelijk hebben geïnduceerd, ondergaan ze niet dezelfde zelfde morfologische veranderingen als volledig gedifferentieerde zwermcellen die op vast medium 8 worden gegroeid. Dit papier biedt een robuust en reproduceerbaar protocol van een methode om swarmer ce te veroorzakenLl differentiatie op een agar oppervlak. Het protocol produceert een populatie van gemakkelijk toegankelijke zwermcellen die gemakkelijk beschikbaar zijn voor single-cell microscopie en daaropvolgende analyse. Bovendien maakt het protocol plaatsbepalingsstudies van fluorescent gelabelde eiwitten in zowel de zwemmer- als zwermercellen (secties 1, 2, 3, 4). Daarnaast beschrijft het protocol de daaropvolgende workflow over het verwerken en analyseren van de gegenereerde data uit fluorescentiemicroscopie experimenten, die het mogelijk maakt de demografische analyse van bacteriële samenlevingen mogelijk te maken (sectie 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van elektrokompetente V. parahaemolyticuscellen en elektroporatie van plasmide-DNA in zwemmercellen
OPMERKING: De volgende sectie van het protocol maakt het mogelijk de bereiding van elektrokompetente cellen en de daaropvolgende elektroporatie van plasmide-DNA in zwemmerscellen te maken. Deze stap is belangrijk als fluorescerende eiwitten ectopisch uit een plasmide worden uitgedrukt.
- Streep de V. parahaemolyticus cellen uit een -80 ° C glycerol voorraad op een verse LB agarplaat die 100 μg / ml ampicilline bevat en incubeer overnacht bij 37 ° C.
- De volgende dag, 200 ml LB-medium met een enkele kolonie van V. parahaemolyticus inoculeren en incuberen bij 37 ° C onder schudde omstandigheden totdat een OD 600 van 1,0 is bereikt. Het duurt meestal 5-6 uur incubatie voor de celcultuur om de gewenste optische dichtheid te bereiken.
- Zet de cellen onmiddellijk over op ijs en perfSnij alle verdere stappen op ijs en in 4 ° C voorgekoelde centrifuges.
- Oog de cellen bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 2000 x g.
- Verwijder de supernatant door decanteren en schakel de celpelletje opnieuw in 25 ml ijskoude 273 mM sucroseoplossing (pH 7,4, gebufferd met KOH).
- Oog de cellen opnieuw bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 2000 x g. Herhaal twee extra tijden.
- Re-suspend de gewassen celpellet in 400 μl ijskoude 273 mM sucroseoplossing. Vervolgens voeg glycerol toe aan een uiteindelijke concentratie van 15% vol / vol. De cellen zijn nu klaar voor elektroporatie, maar kunnen ook in een hoeveelheid van 70 μl bij -80 ° C worden bevroren voor later gebruik.
- Voor de elektroporatie, meng een 70 μL aliquot van elektrokompetente cellen met 100-1000 ng plasmide-DNA en overbreng het mengsel in een ijskoude elektroporatiecuvette (0,2 cm elektrodegap). Voer elektroporatie uit met de volgende instellingen: 25 μF, 2400 V en 200 Ω.
- Schakel deCellen in de elektroporatiecuvette in 600 μl LB bouillon, overbrengen naar een 2 ml buis en incuberen terwijl ze 3 uur bij 37 ° C schudden.
- Spin de cellen bij 2.000 xg gedurende 5 minuten en zet de pellet opnieuw op in 100 μL LB bouillon. Spread de cel-suspensie op selectieve LB-agarplaten die de nodige antibiotica bevatten en incuberen bij 37 ° C overnacht.
- De volgende dag, controleer de platen voor kolonievorming. Kolonies die groeien dragen het juiste antibioticum resistentie gen dat op het plasmide wordt gecodeerd en kan nu gebruikt worden voor verdere experimenten.
2. Inductie van Swarmer Cell Differentiatie
OPMERKING: In de volgende stappen wordt beschreven hoe differentiatie van V. parahaemolyticus in de levenscyclus van de zwermcellen wordt geïnduceerd en hoe de proliferatie op vaste oppervlakken wordt gestimuleerd.
- Suspensieer 4 g Heart Infusion (HI) Agar in 100 ml ddH 2 O om de zwervende platen te bereiden.
- Kook de HI-agaroplossing voorzichtig in de magnetron en schud de fles van tijd tot tijd totdat het poeder is opgelost. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
- Na autoclaving koel de HI-agar af tot 60-65 ° C. Voeg 2,2'-bipyridyl toe aan een eindconcentratie van 50 μM (voorraadoplossing van 50 mM in 100% ethanol). Voeg CaCl2 toe aan een eindconcentratie van 4 mM (voorraadoplossing van 4 M in ddH20). Voeg indien nodig antibiotica toe aan de oplossing om plasmiden te behouden.
OPMERKING: Als u een induceerbaar plasmide wilt plannen, voeg het inducerende middel toe aan zijn uiteindelijke concentratie.
VOORZICHTIG: 2,2'-Bipyridyl: Acute toxiciteit (orale, dermale, inademing). Gebruik handschoenen en veiligheidsbril bij het hanteren van deze chemische stof. - Giet 30 - 35 ml van de uiteindelijke HI-agaroplossing in een ronde 150 mm Petri-schotel en laat de agar stollen.
- Voordat de celcultuur wordt opgespoord, droog de agarplaat bij 37 ° C gedurende tenminste 10 minuten (of totdat alle vloeibare residuen disa hebbenPpeared, maar niet meer) rechts met een open deksel.
OPMERKING: Droogtijden zijn sterk afhankelijk van de gebruikte incubator en zwaar gedroogde platen zullen geen zwavel van V. parahaemolyticus toestaan . (Deze stap is erg belangrijk!) De platen moeten vers worden gebruikt en mogen niet ouder zijn dan 2 - 3 uur. Oude platen zijn te droog om te zwermen te stimuleren. - Inoculeer een kleine hoeveelheid cellen van de rand van een enkele kolonie in 5 ml LB bouillon. Incubeer de cultuur die schudt bij 37 ° C tot OD 600 = 0,8 is bereikt, duurt meestal ongeveer 2-3 uur. Daarna zijn de cellen klaar om te worden gespot op HI zwermende agarplaten.
- Spot 1 μL celcultuur in het midden van een HI-agar zwarmende plaat ( Figuur 1A ).
- Laat de plek droog zijn ( Figuur 1B ).
- Verzegel de plaat met een heldere plastic tape en zorg ervoor dat het stevig is bevestigd, anders kan het tijdens de incubatie van de nacht loslaten ( Figuur 1C ).
OPMERKING: Het isHeel belangrijk dat de zeehond perfect is. Vermijd de vorming van luchtbellen en plooien op de band als het wordt aangebracht. - Incubeer de plaat bij 24 ° C overnacht. Dit zal resulteren in de vorming van een V. parahaemolyticus zwermkolonie met swarm-flares die zich uitstrekken van de omtrek van de zwermkolonie ( Figuur 2 ).
3. Bereiding van V. parahaemolyticus Swarmer Cellen voor Fluorescentiemicroscopie
OPMERKING: In het volgende protocol wordt beschreven hoe u microscopische agaroseplaten kunt voorbereiden en de daaropvolgende afdruk van zwermende flares op een agarosepad om alleen zwamcellen voor microscopie te verkrijgen.
- Om agarose diapjes voor microscopie te bereiden, voeg 1 g agarose toe aan 100 ml van een 20% vol / vol PBS en 10% vol / vol LB bouillon oplossing. Kook de oplossing voorzichtig in de magnetron om de agarose op te lossen en laat het afkoelen tot 65-70 ° C tijdens het mengen met een magnetische roerder.
- Plaats acLeun microscoop glijbaan op een perfect niveau gedeelte van een werkbank. Dek beide uiteinden van de glijbaan aan met twee lagen laboratoriumlabels met algemene doeleinden en bevestig de glijbaan op de werkbank. De afstand tussen de twee stukjes tape moet ongeveer 3 cm bedragen.
OPMERKING: De twee lagen tape maken een zeer kleine hoogte, die de hoogte van het agarosepaneel bepaalt. Het is belangrijk dat de werkruimte op niveau staat om ervoor te zorgen dat cellen in hetzelfde vliegtuig voor microscopieanalyse zullen zijn. - Pipet ~ 250 μL van de eerder bereide agaroseoplossing op het niet bedekte glazen oppervlak.
- Plaats nu een tweede microscoopschuif in dezelfde richting als de onderkant op de bovenkant en druk er een beetje op, zodat de resterende agarose naar de zijkanten kan stromen.
- Laat de agarose 1-2 min dalen en trek langzaam de bovenste glazen glijbaan van de onderkant in een horizontale beweging.
- Met behulp van een scalpel, verwijder eventuele resterende agarose die is bevestigd aan deZijkanten van de microscoopglijbaan en verwijder de tape langzaam van de uiteinden van de microscoopschuif.
OPMERKING: De agaroschuif is nu klaar en moet zo snel mogelijk worden gebruikt, want het zal langzaam uitdrogen. - Om microscopie op zwermcellen uit te voeren, snij een 3 mm x 10 mm stuk zwarmende agar uit de meest buitenste rand van een zwermende kolonie ( Figuur 1D ). Het is zeer belangrijk om de bandafdichting van de zwermplaat niet te breken tot onmiddellijk voor de overdracht van zwermcellen naar de microscoopschuif. Zodra de tape is verwijderd, zwaaien V. parahaemolyticus cellen een differentiatie in zwemmerscellen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de snijdingen vanaf de buitenkant van de zwenkende kolonierand naar de binnenkant van de kolonie leidt ( Figuur 1D ). Op deze manier kan u "zwemmer besmetting" in de rand van de zwermende kolonie voorkomen. - Breng het stuk zwermende agar over op een microscoop agaroseschuif met de cellen die naar de agarose pa kijkenD ( figuur 1E ). Dit imprint de zwermende cellen op het agarosepaneel.
- Na wachten ~ 30 s, verwijder het agarstuk zorgvuldig uit het agarosepaneel ( Figuur 1F ).
- Plaats een glazen deklaag op het agarosepaneel waar de cellen ingeprint werden. De cellen zijn nu klaar voor microscopie.
OPMERKING: Het is belangrijk om onmiddellijk beeldzwermcellen aan te leggen, aangezien zwermcellen langzaam differentiatie starten naar de zwemmerstaat.
4. Bereiding van V. parahaemolyticus zwemmercelculturen voor fluorescentiemicroscopie
OPMERKING: In dit gedeelte van het protocol wordt beschreven hoe u een cultuur van V. parahaemolyticus moet voorbereiden om fluorescentiemicroscopie op het type zwemmerscel uit te voeren.
- Inoculeer een kleine hoeveelheid cellen van de rand van een enkele kolonie in 5 ml LB bouillon. Incubeer de cultuur gedurende 1 uur bij 37 ° C of tot een geringe celgroei zichtbaar wordt.
- OpVoeg bij dit stadium, indien nodig, inducerend middel toe voor expressie van eiwitten van belang. In dit voorbeeld werd L-arabinose toegevoegd aan een uiteindelijke concentratie van 0,2% (w / vol) om expressie van YFP-CheW 9 te induceren.
- Incubeer de cultuur gedurende nog eens 2 uur bij 37 ° C.
- Volg stappen 3.1-3.7 voor het voorbereiden van microscopie-agarose-dia's.
- Plaats 1 μL celcultuur in het midden van het agarosepaneel en laat de plek incuberen tot het droog is.
- Plaats een glazen deklaag op het agarosepaneel waar de cellen werden gespot. De cellen zijn nu klaar om onder de fluorescentiemicroscoop te worden afgebeeld.
5. Beeldanalyse
Dit deel van het protocol beschrijft een workflow voor beeldanalyse, in het bijzonder hoe u de fluorescentiedata van afzonderlijke cellen kunt uittrekken voor demografische analyse.
- Voordat u de beeldanalyse begint, moet u ervoor zorgen dat alle microscopiebeelden in 16bit TIF-formaat worden opgeslagen.
- Laad de DIC (of fase contrast) en de bijbehorende fluorescent kanaal beelden in de software.
- Genereer een overlay afbeelding van beide kanalen door "Beeldschermen / Overlay images" te selecteren. Stel het aantal afbeeldingen ("# Afbeeldingen:") in op twee en selecteer het DIC-beeld in het eerste kanaal en het fluorescerende beeld in het tweede kanaal.
- Selecteer het gereedschap "Multi-Line" van de werkbalk en markeer de cellen van de ene pool naar de andere door het midden van de cel. Om een lijst van alle gegenereerde lijnen (lijnobjecten) te openen, open "Meet / Region Measurements". Configureer de regio metingen om alleen de regio label, afstand en gemiddelde intensiteit te tonen.
- Kalibreer de pixelgrootte onder "Afmetingen / Kalibreren Afstanden" naar de pixelgrootte die specifiek is voor uw microscoopinstelling en klik op "Toepassen op alle openstaande afbeeldingen".
- Breng alle regio's (lijnobjecten) over naar het fluorescentkanaalbeeld. Onder "Regio's / TransfEr Regions "selecteert u de bron afbeelding (de overlay afbeelding) en de bestemmings afbeelding (het fluorescent kanaal beeld). Selecteer" All Regions "en druk op" OK ".
OPMERKING: Om later de exacte regels (lijnobjecten, regio's, ROI) opnieuw te kunnen produceren, open 'Regio's / Bewaar Regio's' en sla de regio's op. - Export alle regio metingen in een spreadsheet door "Meet / Region Measurements" te openen en op "Open Log" te drukken. Bevestig om de gegevens te openen en exporteren. Zodra de spreadsheet op de achtergrond is geopend, voer de gegevens eindelijk uit door op "F9: Log Data" te drukken.
- Om de positie van fluorescerende foci langs de cel te bepalen, open "Meet / Linescan". Stel 'Linescan Width' in op een waarde zodat de hele breedte van een cel wordt gedekt door de regio die u eerder hebt gemaakt. Klik met de rechtermuisknop op de lijn-scan grafiek en selecteer 'Grafiedata weergeven'. Door met de rechtermuisknop te klikken en te slepen, beweegt u de muisknop langs de lijnscan naar deBelangrijk, het venster 'Grafiedata' geeft de overeenkomstige pixel / afstand tussen de twee punten weer. Selecteer de blauwe gemarkeerde rij en kopieer dan de inhoud.
OPMERKING: het gehele line-scan intensiteitsprofiel kan in een spreadsheet worden gelogd door op "Log Data" in het venster "Linescan" te drukken. De geëxtraheerde gegevens kunnen nu worden gebruikt voor visualisatie in grafieken of verdere statistische analyse. Lokalisatiepatronen over de celcyclus kunnen gemakkelijk worden weergegeven in een demografische representatie van de cellengte en de fluorescerende intensiteiten langs het cellichaam. Deze representaties kunnen worden verkregen met behulp van dezelfde eerder genoemde ROI. De volgende stappen geven een voorbeeld van hoe u demografie kunt genereren die vergelijkbaar zijn met die welke zijn weergegeven in de figuren 3C en 4C .- In Fiji / ImageJ laden regio markeringen (.rgn) die eerder in de software zijn gemaakt (stap 5.6) met behulp van de importeur Metamorph nd & ROI files;. Als alternatief kunnen regio's van belang (ROI's) van de te analyseren cellen direct in Fiji / ImageJ worden gemaakt met behulp van het ingebouwde "Segmented Line" -gereedschap.
- Open "Analyseer / Tools / ROI manager" en markeer alle actieve lijstinvoer ".
- Klik daarna op 'Meer / Multi Plot' en selecteer vervolgens 'Lijst' in het nieuwe 'Multi Plot' venster. Klik op een tabel entry, selecteer dan en "alles kopiëren". Plak vervolgens in een nieuwe spreadsheet.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de gegevens van de langste cel (twee corresponderende X- en Y-kolommen met het meeste aantal rijen) de laatste rechts in de spreadsheet zijn. - Sla de spreadsheet op als een "CSV (Comma-gescheiden) (* .csv)".
- Download de R-scripts van hier "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10. De scripts sorteren cellen op lengte en normaliseren de fluorescentie-intensiteitsprofielen van alle cellen als een gemiddelde van de fluorescens van elke cele.
- Run het volledige script "celprofielen function.R" in R [versie 3.0.1; 11 ].
- Bewerk het 'voorbeeld plots.R' script in regel 30 zodanig dat het bestandspad betrekking heeft op de map waar het eerder gegenereerde .csv-bestand is opgeslagen. Bijkomend, wijzig de bestandsnaam "profile.csv" in regel 31 naar de bestandsnaam die is geselecteerd voor .csv-bestand dat is gegenereerd in stap 5.9.4. Voer daarna 'voorbeeld plots.R' uit en volg de documentatie van 'https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles', evenals de opmerkingen van het scriptbestand om demografische analyse te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inductie van differentiatie en opwekking van zwermende kolonies
Figuur 1 geeft een schema van de belangrijke stappen die betrokken zijn bij het produceren van zwermkolonies van V. parahaemolyticus ( Figuur 1A-C ). Een zwemcultuur werd op zwerm-agar opgespoord en geïncubeerd bij 24 ° C, waardoor zwarmerdifferentiatie en proliferatie over het vaste agaroppervlak werd geïnduceerd. Een representatieve stereomicroscopie afbeelding van een zwermende kolonie wordt weergegeven in figuur 2 . Stereo-microscopie beeldvorming laat duidelijk zwerm-flares zien uitwijken van de zwermkolonie-periferie. Hogere vergroting laat zien dat in zenuwvlammen cellen alleen in mono- of bi-lagen worden gegroepeerd, terwijl in het midden van de zwermkolonie cellen in meerdere lagen gestapeld zijn ( Figuur 2A ). Swarm-flares kunnen gemakkelijk worden overgedragen (zoals beschreven in stappen 3.8-3.11,
Fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse
Figuur 1: Inductie van zwarmerdifferentiatie en bereiding van cellen voor microscopiebeeldvorming. Vereenvoudigde visualisatie van de workflow om V. parahaemolyticus swarmercellen te produceren en de bereiding van microscoopschuiven voor microscopie analyse van single swarmercellen. ( A ) Spot 1 μL van een OD 600 = 0,8 celkweek van V. parahaemolyticus in het midden van een HI agar zwermplaat . ( B ) Incubeer de plek tot het gedroogd is en cellen zijn bevestigd aan het agaroppervlak. ( C ) Verzegel de Petri schotel met duidelijke tape. Incubeer de plaat gedurende 16 uur bij 24 ° C. ( D ) Accijns een klein stukje HI-agar uit de buitenste rand van de zwermkolonie. ( E ) Breng de excisie over op een micrOscopie agarose pad met de zwermcellen naar de agarosepaneel gericht. Na een korte incubatietijd van 30 s worden de zwemmercellen op het agarosepad geïmprint. ( F ) Verwijder uitgesneden agar uit agarosepaneel en plaats een microscopische deklaag bovenop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De organisatie van cellen in een V. parahaemolyticus Swarming Colony. ( A ) Stereomicroscopie van een V. parahaemolyticus zwarmerkolonie. De bovenste panelen tonen de buitenste rand van een zwermende kolonie in toenemende vergroting. De onderste panelen tonen een gebied van de zwermende kolonie tussen het midden en de rand in toenemende vergroting. Swarm-fakkels strekken zich uit van de periferie vanDe zwermkolonie. ( B ) Representatieve DIC microscopie beelden van de zwarmer colony rand (bovenpaneel) en een gebied tussen het midden en de periferie (onderpaneel) na overdracht van cellen uit de respectieve aangegeven locaties van de zwermkolonie. De zwermvlammen werden direct op een microscoop agarosepad geïmprinteerd zoals beschreven in stappen 3.8-3.11. Cellen uit het gebied tussen het centrum en de periferie werden eerst uit de zwermkolonie afgekapt en opnieuw in LB-bouillon gesuspendeerd voordat ze op een microscopie-agarosepad werden gespot. Schaalbalk = 7,5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Lokalisatie van Chemotaxis Arrays in zwemmerscellen van V. parahaemolyticus. ( A ) DIC en fluorescerende microscopie beelden van wild-type V. parahaemolyticus zwemmercellen die YFP-CheW ectopisch uitdrukken. ( B ) Grafiek die YFP-CheW foci verdeling toont door de afstand van foci uit de celpalen te plotten als een functie van cellengte in zwemmercellen. ( C ) Demografische analyse van fluorescentie-intensiteitsprofielen van V. parahaemolyticus zwemmercellen die YFP-CheW uitdrukken. Cellen worden gesorteerd op cellengte en relatieve fluorescerende intensiteit weergeven. Schaalbalk = 5 μm. Paneel B en C zijn aangepast uit referentie 9 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Lokalisatie van Chemotaxis Arrays in Swarmer Cellen van V. parahaemolyticus. A ) DIC- en fluorescerende microscopiebeelden van wild-type V. parahaemolyticus zwarmercellen die YFP-CheW ectopisch uitdrukken. ( B ) Grafiek die YFP-CheW foci verdeling toont door de afstand van foci uit de celpalen te plotten als een functie van cellengte in zwermcellen. ( C ) Demografische analyse van fluorescentie-intensiteitsprofielen van V. parahaemolyticus zwarmercellen die YFP-CheW uitdrukken. Cellen worden gesorteerd op cellengte en de relatieve fluorescerende intensiteit weergegeven. Schaalbalk = 5 μm. Paneel B en C zijn aangepast vanaf referentie 9 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel wordt een methode beschreven voor microscopische beeldvorming van V. parahaemolyticus zwarmercellen, gevolgd door stroomafwaartse analyses die bestemd zijn om de subcellulaire lokalisatie en andere eigenschappen van de onderzochte fluorescent gelabelde eiwitten op te lossen en te kwantificeren. Hoewel er meerdere instrumenten bestaan voor microscopische beeldverwerking en analyse 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , blijft de analyse van V. parahaemolyticus zwermende cellen meestal uitdagend omdat ze normaal gesproken binnen een dichte celgemeenschap bestaan en er is een grote variatie in de cellengte ( Figuur 2 ). Daarom is geautomatiseerde celdetectie soms foutief, waardoor de resultaten enigszins onbetrouwbaar zijn. Dit protocol beschrijft een pijplijn die is ontwikkeld om te groeien, te imagen en te analyseren zwermende cellen van V. parahaemolyticus , die is aangepast aan de specIfic behoeften van deze cellen, zoals een gecontroleerde groeimilieu op een oppervlak- en stroomafwaartse beeldanalyses die de aanwezigheid van cellen van variabele lengten opvangen die in de nabijheid groeien.
Het vermogen om een eiwit van belang van een plasmide ectopisch uit te drukken kan belangrijk zijn voor verscheidene experimenten, bijvoorbeeld expressie van fluorescent gelabelde eiwitten voor microscopie studies of complementatie van gen deleties. Hier wordt ook het proces van het bereiden van chemisch bevoegde cellen en elektroporatie van plasmide-DNA in V. parahaemolyticus beschreven. Het voordeel van elektroporatie over vervoeging, die vaak gebruikt wordt voor V. parahaemolyticus , is dat de plasmide ruggengraat niet moet worden aangepast om conjugatie toe te staan. Niettemin moeten enkele voorzorgsmaatregelen worden genomen; Zoals beschreven in stap 1.2, is het zeer belangrijk om een celdichtheid van OD 600 = 1,0 te bereiken. Bij lagere optische dichtheden zullen cellen op electroporati lichtenOp en bij hogere dichtheden wordt het plasmide niet door de cellen opgenomen. Bovendien zal te sterke centrifugatie van V. parahaemolyticus cellen (stappen 1.4-1.6) drastisch verminderen elektroporatie efficiëntie. Het is ook belangrijk om de celpellet tijdens de wasstappen zorgvuldig opnieuw op te schorten om elektrokompetente cellen te genereren.
Hoewel de bereiding van een celcultuur triviaal lijkt, is de cultuurdichtheid van groot belang voor het zwermen van prestaties. In het algemeen zal een celcultuur in de vroege exponentiële groeifase (OD 600 <0,5) een grotere zwermkolonie produceren tijdens de incubatie gedurende de nacht dan een cultuur in late exponentiële of vroege stationaire fase. Afhankelijk van het experiment kan een grotere zwermkolonie voordelig zijn. Om de uitbreiding en de morfologie van de kolonie te vergelijken tussen verschillende stammen die op dezelfde HI-agarzwarmende plaat worden gegroeid, is het echter belangrijk dat er voldoende ruimte beschikbaar is tussen individuele zwermkolonies. Dit kan ach zijnOntdaan door een celcultuur met een hogere optische dichtheid te detecteren die gewoonlijk resulteert in kleinere zwermende kolonies.
Inductie van het zwervende fenotype verschilt significant tussen bacterie- soorten en de reproduceerbaarheid hiervan is sterk beïnvloed door factoren zoals agar- en nutriëntsamenstelling, de omgevingstemperatuur en het vochtgehalte van zowel de omgeving als het groeimedium. Bijgevolg beïnvloeden kleine wijzigingen in protocol en extern milieu de resultaten van zwermassays en de inductie van zwarmerdifferentiatie. Protocollen voor het induceren van zwermen van andere bacteriële soorten zoals Pseudomonas aeruginosa en Bacillus subtilis zijn gerapporteerd 19 . De stappen die in dit protocol beschreven worden, zullen betrouwbaar de zwarmercel type V. parahaemolyticus produceren en in de vorm van zwermende kolonies die enkelvoudige zwevende fakkels op de rand van de kolonie produceren , in stand houden. Om stabiel enReproduceerbare experimenten op het zwermcellen type V. parahaemolyticus , is het voorbereiden van de HI zwarmende agarplaten het belangrijkste onderdeel van dit protocol. In het bijzonder kan de droogtreng optimalisatie vereisen, aangezien elke broeikas anders zal uitvoeren. Een andere factor die zwermend gedrag kan beïnvloeden is het type kunststof dat in de Petri-schotels wordt gebruikt. De typische Petrischalen die in ons laboratorium worden gebruikt om zwervende experimenten uit te voeren zijn gemaakt van polystyreen (PS). Met behulp van Petri-schotels, vervaardigd uit laagdichtheidspolyethyleen (PE LD), produceerden echter gemengde resultaten in zwermende analyses. Het is van cruciaal belang om de beschreven stappen te volgen, omdat alleen dan reproduceerbare zwermkolonies die duidelijke perifere vlamvorming tonen, vormen, die een enkele zwarmercellenmicroscopie mogelijk maken.
Ongetwijfeld kunnen verschillende benaderingen worden genomen om de resultaten weer te geven die door fluorescerende microscopiestudies van V. parahaemolyticus zwermende cellen worden weergegeven . Voor instancE, het veelgebruikte programma MicrobeTracker 16 is een aannemelijk alternatief. De onlangs beschikbare MicrobeTracker applicatie Oufti 20 , die geen MATLAB nodig heeft, is ook een ander alternatief. Het gebruik van DIC-beelden (Differential Interface Contrast) is echter niet mogelijk in Oufti, en fase contrast beeldvorming is niet geschikt om celsegmentatie in zwermcellen te onderscheiden. Bovendien zijn niet alle microscopen uitgerust voor faseconstante beeldvorming en op zijn beurt is fase contrast beeldvorming niet geschikt voor allerlei microscopie analyse. Een ander veelbelovend gereedschap, dat gratis en ImageJ is gebaseerd, is MicrobeJ 17 , maar nogmaals kan alleen fasecontrast en fluorescerende beelden worden gebruikt. Bovendien staat dit protocol alleen voor beeldvorming en analyse van cellen op specifieke tijdspunten van hun levenscyclus. Echter, een uitstekend protocol dat time-lapse imaging en de daaropvolgende beeldanalyse beschrijft, die het mogelijk maakt om single te volgenCel trajecten en eiwitdynamiek 21 kunnen waarschijnlijk ook toegepast worden op V. parahaemolyticus .
Na aanleiding van de stappen die in dit protocol beschreven worden, kunnen wetenschappers betrouwbare en herproducerbare single-cell fluorescentiemicroscopie uitvoeren op zowel de zwemmer als de zwermcellen van V. parahaemolyticus . Dit protocol beschrijft een robuuste manier om V. parahaemolyticus van zijn zwemmer in zijn swarmerceltype te transformeren. Door de monolaag van zwermcellen uit de perifere fakkels van zwermende kolonies op een agarosepad te impreteren, kan de intracellulaire lokalisatie van eiwitten worden waargenomen. De pijpleiding voor beeldanalyse kan waarschijnlijk worden toegepast op andere bacteriële soorten die voorkomen in bacteriële gemeenschappen waar cellen groeien Zeer nabijheid en situaties waar geautomatiseerde beeldanalyse misschien niet voordelig is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
