Summary
Questo protocollo consente la microscopia a cellule singole del nuotatore diverso Vibrio parahaemolyticus e delle cellule swarmer. Il metodo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili per l'analisi delle cellule singole e copre la preparazione delle colture cellulari, l'induzione della differenziazione swarmer, la preparazione del campione e l'analisi delle immagini.
Abstract
La capacità di studiare la localizzazione intracellulare delle proteine è essenziale per la comprensione di molti processi cellulari. A sua volta, questo richiede la possibilità di ottenere singole celle per la microscopia a fluorescenza, che può essere particolarmente impegnativa quando le cellule di immagini che esistono all'interno delle comunità batteriche. Ad esempio, il patogeno umano Vibrio parahaemolyticus esiste come brevi cellule nuotatori a forma di bastoncino in condizioni liquide che, al contatto con la superficie, si differenziano in una sottopopolazione di cellule swarmer altamente allungate specializzate per la crescita su superfici solide. Questo articolo presenta un metodo per eseguire un'analisi microscopica di una singola cellula di V. parahaemolyticus nei suoi due stati differenziali. Questo protocollo produce molto riproducibilmente la differenziazione del V. parahaemolyticus in un ciclo vitale della cellula swarmer e facilita la loro proliferazione su superfici solide. Il metodo produce fasci di cellule swarmer differenziate che si estendono da tÈ il bordo della colonia. Notevolmente, alla punta delle bruciature di swarm, le cellule swarmer esistono in un unico strato di cellule, che consente loro facile trasferimento a una diapositiva del microscopio e successiva microscopia a fluorescenza di singole cellule. Inoltre, viene presentato il flusso di lavoro dell'analisi delle immagini per la rappresentazione demografica delle società batteriche. Come prova del principio, è descritta l'analisi della localizzazione intracellulare delle matrici di segnalazione chimotassie in nuotatori e cellule swarmer di V. parahaemolyticus.
Introduction
I batteri sperimentano costantemente cambiamenti nel loro ambiente esterno e hanno sviluppato diverse tecniche per modificare e adattare il loro comportamento di conseguenza. Uno di questi meccanismi comporta la differenziazione in tipi cellulari distinti che meglio integrano l'ambiente alterato. La differenziazione comporta spesso importanti cambiamenti nella regolazione del ciclo cellulare, nella morfologia delle cellule e nell'organizzazione spaziale delle cellule. Un organismo che può subire la differenziazione è Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartiene alla Vibrionaceae , che è una famiglia di proteobatteri che abitano abitualmente acqua fresca o salata. Vibrionaceae sono ampiamente distribuite nell'ambiente e includono diverse specie che causano infezioni del tratto intestinale nell'uomo, incluso anche Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus è un organismo dimorfico ed è in grado di differenziarsi in due distinti tipi di cellule come risposta per accogliere i cambiamentiAmbiente esterno. In ambienti acquosi, esiste come una breve cella da nuoto a forma di bastoncello con un singolo flagello polare posizionato all'antico palo di cella. A contatto con la superficie, viene attivata la differenziazione in una cellula swarmer. La differenziazione delle cellule swarmer comporta due importanti cambiamenti: la morfogenesi delle cellule swarmer attraverso l'inibizione della divisione cellulare e l'induzione di un secondo sistema flagella. Ciò determina la formazione di una cellula swarmer a forma di forma a forma di forma e molto allungata, che può continuare lo stile di vita swarmer, dove gli eventi di divisione producono cellule swarmer di progenie o alternativamente si differenziano in cellule nuotatori.
Sono stati riportati diversi fattori per indurre o influenzare la differenziazione del swarmer. Lo stimolo primario sembra essere guidato da meccanosensing dove V. parahaemolyticus utilizza il flagello polare come un sensore tattile che rileva l'inibizione della rotazione sul contatto di superficie, ma sono coinvolti diversi altri fattoriBene 1 . Nel laboratorio, la rotazione del flagello polare può essere inibita artificialmente mediante l'aggiunta di fenamil, che blocca la rotazione flagellare guidata dal canale sodico, inducendo così la differenziazione swarmer 2 . Inoltre, in uno studio precedente , Vibrio alginolyticus è stato indotto a sciogliersi su supporti solidi quando le cellule sono state propagate su un mezzo di crescita in un piatto di Petri sigillato con chiaro nastro di plastica. La carta filtrante satura alcalina impediva lo swarming in queste condizioni, suggerendo pertanto che uno o più acidi volatili potrebbero essere coinvolti nell'induzione dello swarming. Così, sigillare il piatto di Petri con nastro di plastica probabilmente consentito per l'accumulo di acidi volatili, formati come sottoprodotti di metabolismo cellulare, all'interno dello spazio testa della piastra. Lo stesso effetto è stato raggiunto quando H2O2 è stato aggiunto al mezzo di crescita in piatti Petri non sigillati per produrre artificialmente acidi volatili idrolizzando i componenti mediali
V. la differenziazione del parahaemolyticus comporta grandi cambiamenti nella regolazione della divisione cellulare, nella morfologia cellulare e nel posizionamento di macchine macromolecolari come flagellA e chemiotassi - processi che richiedono la localizzazione specifica delle proteine secondo il ciclo cellulare. Così, la capacità di studiare la localizzazione intracellulare di tali proteine è essenziale per la comprensione dei suddetti processi cellulari. Per eseguire tali studi è necessaria la microscopia a fluorescenza sulle singole cellule. Ciò può essere particolarmente impegnativo quando le cellule di immagini che esistono all'interno di popolazioni batteriche densi, come avviene per le cellule swarmer. Ci sono stati tentativi di indurre una differenziazione di swarmer in supporti liquidi, che potenzialmente potrebbero generare singole cellule per studi di microscopia. E sebbene su un livello trascrizionale queste cellule hanno in parte indotto il programma di differenziazione swarmer, non subiscono gli stessi cambiamenti morfologici distinti, come le cellule swarmer completamente differenziate coltivate su un mezzo solido 8 . Questo documento offre un protocollo robusto e riproducibile di un metodo per indurre swarmer ceLl differenziazione su una superficie di agar. Il protocollo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili prontamente disponibili per la microscopia a cellule singole e successive analisi. Inoltre, il protocollo consente di localizzare studi di proteine etichettate con fluorescenza in entrambi i tipi di nuoto e swarmer (sezioni 1, 2, 3, 4). Inoltre, il protocollo descrive il flusso di lavoro successivo su come elaborare e analizzare i dati generati dagli esperimenti di microscopia a fluorescenza, che consente l'analisi demografica delle società batteriche (sezione 5).
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Protocol
1. Preparazione delle cellule V. parahaemolyticus elettrocompatibili e elettroporazione del DNA plasmidico nelle cellule nuotatori
NOTA: La seguente sezione del protocollo consente la preparazione di celle elettro-competenti e la successiva elettroporazione del plasmide DNA in cellule nuotatori. Questo passo è importante se le proteine fluorescenti vengono espresse ectopicamente da un plasmide.
- Sradicare le cellule V. parahaemolyticus da una riserva di glicerolo da -80 ° C su una piastra di LB agar fresca contenente 100 μg / mL di ampicillina e incubare per una notte a 37 ° C.
- Il giorno seguente, inoculare 200 ml di mezzo LB con una singola colonia di V. parahaemolyticus e incubare a 37 ° C in condizioni di agitazione fino a raggiungere un OD 600 di 1,0. Richiede solitamente 5-6 h di incubazione per la coltura cellulare per raggiungere la densità ottica desiderata.
- Trasferire immediatamente le celle su ghiaccio e perfTutte le ulteriori tappe su ghiaccio e in centrifughe pre-raffreddate a 4 ° C.
- Raccogliere le cellule a 4 ° C per 10 minuti a 2.000 x g.
- Scartare il surnatante decantando e ri-sospendere il pellet cellulare in 25 ml di soluzione fredda di saccarosio 273 mM (pH 7.4, tamponata con KOH).
- Raccogli le cellule di nuovo a 4 ° C per 10 minuti a 2000 x g. Ripetere due ulteriori volte.
- Riassemblare il pellet di cellule lavate in 400 μl di soluzione fredda di 273 mM di saccarosio. Successivamente aggiungere il glicerolo ad una concentrazione finale del 15% vol / vol. Le cellule sono pronte per l'elettroporazione, ma possono anche essere congelate in aliquote di 70 μl a -80 ° C per un uso successivo.
- Per l'elettroporazione, mescolare una aliquota di elettrocompatibili da 70 μl con 100-1000 ng di DNA plasmidico e trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione ghiacciata (intervallo di elettrodo 0,2 cm). Effettuare l'elettroporazione con le seguenti impostazioni: 25 μF, 2400 V e 200 Ω.
- Sospendi laLe cellule nella cuvetta di elettroporazione in 600 μL di brodo LB, trasferire in un tubo da 2 ml e incubare agitando a 37 ° C per 3 ore.
- Spin giù le cellule a 2.000 xg per 5 min e ri-sospendere il pellet in 100 μL di brodo LB. Distribuire la sospensione cellulare su piastrine selettive di agar LB contenenti gli antibiotici necessari e incubare a 37 ° C per una notte.
- Il giorno seguente, controllare le piastre per la formazione della colonia. Le colonie che crescono portano il gene di resistenza antibiotica corretta codificato sul plasmide e ora può essere utilizzato per ulteriori esperimenti.
2. Induzione della differenziazione delle cellule Swarmer
NOTA: Le seguenti fasi descrivono come indurre la differenziazione del V. parahaemolyticus nel suo ciclo vitale della cellula swarmer e come stimolare la proliferazione sulle superfici solide.
- Sospendere 4 g di agar cuore infusione (HI) in 100 mL ddH 2 O per preparare le piastre di swarming.
- Mescolare accuratamente la soluzione agar HI nel forno a microonde e scuotere la bottiglia di tanto in tanto finché la polvere non viene sciolta. Autoclave a 121 ° C per 20 min.
- Dopo l'autoclave, raffreddare l'agar HI a 60-65 ° C. Aggiungere 2,2'-Bipyridyl ad una concentrazione finale di 50 μM (soluzione di riserva di 50 mM in etanolo al 100%). Aggiungere CaCl 2 ad una concentrazione finale di 4 mM (soluzione di riserva di 4 M in ddH2O). Se necessario, aggiungete gli antibiotici nella soluzione per mantenere i plasmidi.
NOTA: Se si prevede di utilizzare un plasmide inducibile, aggiungere agente induttivo alla sua concentrazione finale.
ATTENZIONE: 2,2'-Bipyridyl: tossicità acuta (orale, dermico, inalazione). Usare guanti e occhiali di protezione durante la manipolazione di questa sostanza chimica. - Versare 30 - 35 ml della soluzione finale agar HI in un piatto rotondo da 150 mm di Petri e lasciare che l'agar si solidifichi.
- Prima di individuare la coltura cellulare, asciugare la piastra agar a 37 ° C per almeno 10 minuti (o fino a quando nessun residuo liquidoSi avvicinò, ma non più) a destra con un coperchio aperto.
NOTA: I tempi di essiccazione dipendono fortemente dall'incubatrice utilizzata e le piastre asciutte non consentono lo scoramento di V. parahaemolyticus . (Questo passo è molto importante!) Le piastre devono essere utilizzate fresche e non devono essere più vecchie di 2 - 3 ore. Le vecchie lastre saranno troppo asciutte per stimolare lo swarming. - Inoculare una piccola quantità di cellule dal bordo di una singola colonia in 5 ml di brodo LB. Incubare la coltura agitando a 37 ° C fino a raggiungere OD 600 = 0.8, richiede solitamente circa 2-3 ore. Successivamente, le cellule sono pronte per essere individuate sulle piastre agar HI swarming.
- Posizionare 1 μl di coltura cellulare al centro di una piastra di brigatura agar HI ( Figura 1A ).
- Lasciare asciugare il punto ( Figura 1B ).
- Sigillare la piastra con un nastro di plastica trasparente e assicurarsi che sia saldamente attaccato, altrimenti potrebbe staccarsi durante l'incubazione durante la notte ( Figura 1C ).
NOTA: ÈMolto importante che il sigillo sia perfetto. Evitare la formazione di bolle d'aria e pieghe al nastro quando viene applicata. - Incubare la piastra a 24 ° C per una notte. Ciò comporterà la formazione di una colonia di V. parahaemolyticus con fasci di razza che si estendono dalla periferia della colonia ( Figura 2 ).
3. Preparazione delle cellule Swarmer V. parahaemolyticus per la microscopia a fluorescenza
NOTA: Il seguente protocollo descrive come preparare le diapositive di agarosio a microscopia e la successiva imprinting di flaresci di swarming su un tampone di agarosio per ottenere singole cellule swarmer per la microscopia.
- Per preparare le diapositive agarose per microscopia aggiungere 1 g di agarosio a 100 ml di un 20% vol / vol PBS e 10% vol / vol LB broth solution. Mescolare accuratamente la soluzione nel forno a microonde per sciogliere l'agarosio e lasciarlo raffreddare a 65-70 ° C mentre si mescola con un agitatore magnetico.
- Luogo acScivolare il microscopio magro su una sezione perfettamente livellata di una panchina di lavoro. Coprire entrambe le estremità dello scivolo con due strati di nastro adesivo di laboratorio di uso generale, fissando la slitta alla panca di lavoro. La distanza tra i due pezzi di nastro dovrebbe essere di circa 3 cm.
NOTA: i due strati di nastro creano una elevazione molto piccola, che determinerà l'altezza del rilievo agarosio. È importante che lo spazio di lavoro sia livello per assicurarsi che le celle saranno nello stesso piano per l'analisi microscopica. - Pipettare ~ 250 μL della soluzione di agarosio preparata in precedenza sulla superficie di vetro non coperta.
- Ora posizionare una seconda scivola a microscopio nello stesso orientamento del fondo in alto e premere leggermente verso il basso in modo che l'agarosio residuo possa scorrere verso i lati.
- Lasciare che l'agarosio si solidifichi per 1-2 min e poi tirare lentamente la scaletta di vetro superiore dal basso in un movimento orizzontale.
- Utilizzando un bisturi, tagliare qualsiasi agarosio residuo che è attaccato alI lati dello scivolo del microscopio e rimuovere lentamente il nastro dalle estremità del vetrino del microscopio.
NOTA: La scocca di agarosso è pronta e deve essere utilizzata il più presto possibile in quanto si inizia lentamente a seccare. - Per eseguire la microscopia su cellule swarmer, tagliare un pezzo di agarro da 3 mm x 10 mm dal bordo più esterno di una colonia di scorrimento ( Figura 1D ). E 'molto importante non rompere la guarnizione a nastro della piastra a scoppio fino immediatamente prima del trasferimento di cellule swarmer al vetrino del microscopio. Una volta che il nastro viene rimosso, le cellule V. parahaemolyticus innescano la differenziazione in cellule nuotatori.
NOTA: Assicurarsi di indirizzare i tagli dall'esterno del bordo della colonia di scorrimento verso l'interno della colonia ( Figura 1D ). In questo modo è possibile impedire la "contaminazione del nuotatore" nel bordo della colonia di swarming. - Trasferire il pezzo di agar di scorrimento su un microscopio scivolo agaroso con le cellule affacciate sul agarosio paD ( figura 1E ). Questo imprime le cellule swarming sul tampone agarosio.
- Dopo aver aspettato ~ 30 s, rimuovere attentamente il pezzo agar dal tampone agarosio ( Figura 1F ).
- Mettere un coperchio di vetro sul tampone di agarosio dove le cellule sono state imprintate. Le cellule sono pronte per la microscopia.
NOTA: è importante immaginare immediatamente le cellule swarmer, poiché le cellule swarmer iniziano lentamente la differenziazione allo stato nuotatore.
4. Preparazione di V. parahaemolyticus Swimmer Cell-cultures per microscopia a fluorescenza
NOTA: Questa sezione del protocollo descrive come preparare una coltura di V. parahaemolyticus per eseguire la microscopia a fluorescenza sul tipo di nuotatore.
- Inoculare una piccola quantità di cellule dal bordo di una singola colonia in 5 ml di brodo LB. Incubare la coltura agitando a 37 ° C per 1 ora o fino a quando la leggera crescita cellulare diventa visibile.
- AQuesta fase, se necessario, aggiungerà agente induttivo per l'espressione di proteine di interesse. In questo esempio, L-arabinosi è stata aggiunta ad una concentrazione finale dello 0,2% (w / vol) per indurre l'espressione di YFP-CheW 9 .
- Incubare la coltura agitando per altri 2 h a 37 ° C.
- Seguire le fasi 3.1-3.7 per preparare le diapositive a microscopio agarosio.
- Spot 1 μL di coltura cellulare al centro del tampone agarosio e lasciare incubare il punto fino a secco.
- Posizionare una copertura in vetro sul rilievo di agarosio dove le cellule sono state individuate. Le cellule sono ora pronte per essere riprese sotto il microscopio a fluorescenza.
5. Analisi delle immagini
Questa parte del protocollo descrive un flusso di lavoro per l'analisi delle immagini, in particolare come estrarre i dati di fluorescenza delle singole celle per l'analisi demografica.
- Prima di iniziare l'analisi delle immagini assicurarsi che tutte le immagini di microscopia vengano salvate in formato TIF a 16 bit.
- Caricare il DIC (o il contrasto di fase) e le corrispondenti immagini del canale fluorescente nel software.
- Genera un'immagine di sovrapposizione di entrambi i canali selezionando "Mostra / Sovrapposizione immagini". Impostare il numero di immagini ("# Immagini:") a due e selezionare l'immagine DIC nel primo canale e l'immagine fluorescente nel secondo canale.
- Selezionare lo strumento "Multi-Line" dalla barra degli strumenti e contrassegnare le celle da un polo all'altro attraverso la metà della cella. Per ottenere un elenco di tutte le linee generate (oggetti di linea), aprire "Measure / Region Measurements". Configurare le misure della regione per visualizzare solo l'etichetta della regione, la distanza e l'intensità media.
- Calibrare la dimensione dei pixel sotto "Misura / calibrazione delle distanze" alla dimensione del pixel specificata per la configurazione del microscopio e fare clic su "Applica a tutte le immagini aperte".
- Trasferisci tutte le regioni (oggetti di linea) all'immagine del canale fluorescente. Sotto "Regioni / TrasfEr Regions "selezionare l'immagine di origine (l'immagine di sovrapposizione) e l'immagine di destinazione (l'immagine del canale fluorescente). Selezionare" Tutte le regioni "e premere" OK ".
NOTA: Per riuscire a riprodurre le righe esatte (oggetti di linea, regioni, ROI), aprire "Regioni / Salva regioni" e salvare le regioni. - Esportare le misurazioni di tutte le regioni in un foglio di calcolo aprendo "Measure / Measurements Region" e premendo "Open Log". Confermare di aprire ed esportare i dati. Una volta aperto il foglio di calcolo in background, esportare i dati premendo "F9: Log Data".
- Per determinare la posizione dei foci fluorescenti lungo la cella, aprire "Measure / Linescan". Impostare "Linescan Width" in un valore in modo che l'intera larghezza di una cella sia coperta dalla regione creata in precedenza. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico di scansione di linea e selezionare "Mostra dati grafico". Cliccando con il tasto sinistro e trascinando il cursore del mouse lungo la linea di scansione sullo schermoPunto di interesse, la finestra "Grafico dati" visualizzerà la corrispondente pixel / distanza tra i due punti. Selezionare la riga evidenziata blu e quindi copiare il contenuto.
NOTA: L'intero profilo di intensità della scansione di linea può essere registrato in un foglio di calcolo premendo "Log Data" nella finestra "Linescan". I dati estratti possono ora essere utilizzati per la visualizzazione in grafici o ulteriori analisi statistiche. I modelli di localizzazione del ciclo cellulare possono essere facilmente visualizzati in una rappresentazione demografica della lunghezza delle cellule e delle intensità fluorescenti lungo il corpo cellulare. Queste rappresentazioni possono essere ottenute utilizzando lo stesso ROI precedentemente selezionato. Le seguenti fasi forniranno un esempio di come generare demografia simile a quelle riportate nelle figure 3C e 4C .- Nelle mappe di regione di caricamento di Figi / ImageJ (.rgn) precedentemente create nel software (passo 5.6) utilizzando il "importatore di file Metamorph nd & ROI";. In alternativa, le regioni di interesse (ROI) delle cellule da analizzare possono essere create direttamente in Figi / ImageJ utilizzando lo strumento "Segmented Line".
- Apri "Analizza / Strumenti / Gestione ROI" e segnala tutte le voci di elenco attivo ".
- Successivamente, fare clic su "Altro / Multiplot" e selezionare "Elenco" nella nuova finestra "Multi Plot". Fare clic su una voce di tabella, quindi selezionare e "copiare tutto". Successivamente, incollare in un nuovo foglio di lavoro.
NOTA: Assicurarsi che i dati della cella più lunga (due colonne X e Y corrispondenti con il maggior numero di righe) siano l'ultima a destra nel foglio di calcolo. - Salva il foglio di calcolo come "CSV (delimitato da virgole) (* .csv)".
- Scaricare gli script R qui da "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10. Gli script gestiscono le celle per lunghezza e normalizzano i profili di intensità fluorescenti di tutte le celle come una media della fluorescenza di ciascuna cellae.
- Esegui l'intero script "profili di cella function.R" in R [versione 3.0.1; 11 ].
- Modificare lo script "example plots.R" nella riga 30 in modo tale che il percorso del file si riferisca alla cartella in cui viene salvato il file .csv generato in precedenza. Inoltre, modificare il nome del file "profile.csv" nella riga 31 al nome del file scelto per il file .csv generato nel passaggio 5.9.4. Successivamente, eseguire "esempio plots.R" e seguire la documentazione da "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" nonché i commenti del file di script per generare l'analisi demografica.
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Representative Results
Induzione della differenziazione e della generazione di colonie di brulicante
La figura 1 fornisce uno schema delle fasi importanti per la produzione di colonie di V. parahaemolyticus ( Figura 1A-C ). Una cultura del nuotatore è stata individuata su agar aghi e incubata a 24 ° C, inducendo una differenziazione e una proliferazione del swarmer sulla superficie del solido agar. Una rappresentazione stereo-microscopia immagine di una colonia di swarming è presentata in Figura 2 . L'imaging stereo-microscopico indica chiaramente i brillamenti che si estendono verso l'esterno della periferia della colonia. L'ingrandimento più alto rivela che nelle cellule di brughiera, le cellule sono raggruppate solo in mono o bi-strati, mentre in mezzo le cellule di colonie sono sovrapposte in più strati ( Figura 2A ). I bastoni a scoppio possono essere facilmente trasferiti (come descritto nei passaggi 3.8-3.11,
Microscopia a fluorescenza e analisi delle immagini
Figura 1: Induzione della differenziazione swarmer e preparazione delle cellule per la microscopia. Visualizzazione semplificata del flusso di lavoro per produrre le cellule swarmer V. parahaemolyticus e la preparazione di diapositive a microscopio per l'analisi microscopica di singole cellule swarmer. ( A ) Individuare 1 μL di una coltura di cellule di V. parahaemolyticus OD 600 = 0,8 al centro di una piastra di brigatura HAR agar. ( B ) Incubare il punto fino ad essere asciugato e le cellule sono fissate alla superficie del agar. ( C ) Sigillare il piatto di Petri con nastro trasparente. Incubare la piastra a 24 ° C per 16 ore. ( D ) Acciai accuratamente un piccolo pezzo di agar HI dal bordo esterno della colonia di swarming. ( E ) Trasferire l'escissione su un micrOscopio di agarosio con le cellule swarmer rivolte al tampone agarosio. Dopo un breve periodo di incubazione di 30 sec, le cellule swarmer vengono imprimate sul tampone agarosio. ( F ) Rimuovere accuratamente l'agar escassato dal tampone agarosio e posizionare una copertura microscopica sulla parte superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'organizzazione delle cellule in una colonia di rovina V. parahaemolyticus . ( A ) Stereomicroscopia di una colonia di V. parahaemolyticus swarmer. I pannelli superiori visualizzano il bordo esterno di una colonia di swarming in ingrandimento crescente. I pannelli inferiori mostrano un'area della colonia di scorrimento tra il centro e il bordo aumentando l'ingrandimento. Gli sparatorie si estendono dalla periferia diLa colonia. ( B ) Immagini rappresentative di microscopia DIC del bordo della colonia swarmer (pannello superiore) e una zona tra il centro e la periferia (pannello inferiore) dopo il trasferimento di celle dalle rispettive posizioni indicate della colonia di scorrimento. I brillanti sono stati imprinti direttamente su un microfilo di agarosio come descritto nei passaggi 3.8-3.11. Le cellule della zona tra il centro e la periferia sono state prima strappate fuori dalla colonia di swarm e ri-sospese nel brodo LB, prima di essere individuate su un micro agglomerato di agarosio. Barra di scala = 7,5 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Localizzazione di array di Chemotaxis nelle cellule nuotatori di V. parahaemolyticus. ( A ) DIC e immagini microscopiche fluorescenti delle cellule nuotatori del parahaemolyticus selvatico di tipo V. Ectopicamente esprimono YFP-CheW. ( B ) Grafico che mostra la distribuzione di foci YFP-CheW plottando la distanza dei foci dai poli della cellula in funzione della lunghezza delle celle nelle nuotate. ( C ) Analisi demografica dei profili di intensità della fluorescenza delle cellule nuotatori V. parahaemolyticus che esprimono YFP-CheW. Le cellule sono ordinate per lunghezza cellulare e mostrano un'intensità fluorescente relativa. Barra di scala = 5 μm. I pannelli B e C sono adattati dal riferimento 9 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Localizzazione di array di Chemotaxis in cellule Swarmer di V. parahaemolyticus. A ) DIC e immagini microscopiche fluorescenti delle cellule swarmer di tipo V. parahaemolyticus selvatiche che esprimono ectopicamente YFP-CheW. ( B ) Grafico che mostra la distribuzione di foci di YFP-CheW plottando la distanza dei foci dai poli della cellula in funzione della lunghezza delle cellule in cellule swarmer. ( C ) Analisi demografica dei profili di intensità di fluorescenza delle cellule swarmer di V. parahaemolyticus che esprimono YFP-CheW. Le cellule sono ordinate per lunghezza cellulare e visualizzano l'intensità fluorescente relativa. Barra di scala = 5 μm. I pannelli B e C sono adattati da riferimento 9 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo documento descrive un metodo per l'imaging microscopico delle cellule swarmer V. parahaemolyticus seguito da analisi a valle destinate a risolvere e quantificare la localizzazione subcellulare e altre caratteristiche delle proteine studiate fluorescenti. Sebbene esistano diversi strumenti per l'elaborazione e l'analisi di immagini microscopiche 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , l'analisi delle cellule di swamping V. parahaemolyticus rimane impegnativa soprattutto perché normalmente esistono all'interno di una comunità cellulare densa e vi è un'elevata variazione della lunghezza cellulare ( Figura 2 ). Pertanto, la rilevazione automatica delle celle è talvolta difettosa e quindi i risultati sono in qualche modo inaffidabili. Questo protocollo descrive una pipeline progettata per coltivare , immaginare e analizzare le cellule di V. parahaemolyticus , che è adattata alle specificheLe necessità efficaci di queste cellule, ad esempio un ambiente di crescita controllato su un'analisi di immagini a livello e a valle che accolgono la presenza di celle di lunghezze variabili che crescono in stretta vicinanza.
La capacità di esprimere ectopicamente una proteina di interesse da un plasmide può essere importante per diversi esperimenti, ad es. Espressione di proteine etichettate con fluorescenza per studi di microscopia o complementazione delle delezioni geniche. Qui viene descritto anche il processo di preparazione delle cellule chimicamente competenti e l'elettroporazione del plasmide DNA in V. parahaemolyticus. Il vantaggio dell'elettroporazione sulla coniugazione, spesso usato per V. parahaemolyticus , è che la spina dorsale del plasmide non deve essere modificata per consentire la coniugazione. Tuttavia, occorre adottare alcune precauzioni; Come descritto nel punto 1.2, è molto importante raggiungere una densità di cella di OD 600 = 1,0. Alle densità ottiche più basse le cellule si lenti su elettroporatiSu e alle densità più elevate il plasmide non viene assorbito dalle cellule. Inoltre, la centrifugazione troppo dura delle cellule di V. parahaemolyticus (punti 1.4-1.6) diminuisce drasticamente l'efficienza dell'elettroporazione. È anche importante riposizionare attentamente la pellicola cellulare durante i passi di lavaggio per generare celle elettro-competenti.
Sebbene la preparazione di una coltura delle cellule sembrasse banale, la densità della cultura è molto importante per le prestazioni di brulicante. In genere, una coltura cellulare nella fase di crescita iniziale esponenziale (OD 600 <0,5) produrrà una colonia di scorrimento più grande durante l'incubazione di una notte che una coltura in fase tardiva esponenziale o stazionaria precoce. A seconda dell'esperimento, una colonia di rocciosa più grande potrebbe essere utile. Tuttavia, per confrontare l'espansione della colonia e la morfologia tra vari ceppi cresciuti sulla stessa piastra di agar HI, è importante avere spazio sufficiente tra le singole colonie di brulicante. Questo può essere achOsservato da una coltura di cellule di densità ottica superiore che di solito provocherebbe piccole colonie di brulicante.
L'induzione del fenotipo di swarming varia notevolmente tra le specie batteriche e la riproducibilità è fortemente influenzata da fattori quali l'agar e la composizione nutritiva, la temperatura ambiente e il contenuto di umidità sia dell'ambiente che del medium di crescita. Di conseguenza, piccoli cambiamenti nel protocollo e nell'ambiente esterno influenzano in modo significativo i risultati del sondaggio e l'induzione della differenziazione del swarmer. Sono stati riportati protocolli per indurre lo swarming di altre specie batteriche come Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis 19 . Le fasi descritte in questo protocollo produrranno in modo affidabile la tipologia di cellule swarmer di V. parahaemolyticus e mantenerle sotto forma di colonie che scottano che producono singoli strati di brulicante a bordo della colonia. Per eseguire stabili eSperimentali riproducibili sul tipo di cellule swarmer di V. parahaemolyticus , la preparazione delle piastre di agar HI swarming è la parte più importante di questo protocollo. In particolare, la fase di asciugatura potrebbe richiedere l'ottimizzazione, in quanto ogni incubatore esegue in modo diverso. Un altro fattore che può influenzare il comportamento dello swarming è il tipo di plastica utilizzata nei piatti di Petri. I piatti tipici di Petri utilizzati nel nostro laboratorio per eseguire esperimenti di brulicante sono realizzati in polistirene (PS). Tuttavia, utilizzando piatti di Petri realizzati in polietilene a bassa densità (PE LD) hanno prodotto risultati misti in sondaggi di swarming. E 'fondamentale seguire le fasi descritte, perché solo le colonie di swarming riproducibili che mostrano una distinta formazione di flare periferiche, consentono la microscopia delle cellule singole swarmer.
Indubbiamente, si possono adottare approcci diversi per visualizzare i risultati ottenuti mediante studi microscopici a fluorescenza delle cellule di rottura di V. parahaemolyticus . Per instancE, il programma ampiamente utilizzato MicrobeTracker 16 rappresenta un'alternativa plausibile. L'applicazione recentemente disponibile di MicrobeTracker Oufti 20 , che non richiede MATLAB, è anche un'altra alternativa. Tuttavia, l'uso di immagini di differenza di interfaccia differenziale (DIC) non è possibile in Oufti, e l'imaging di contrasto di fase non è idoneo a distinguere la segmentazione cellulare nelle cellule swarmer. Inoltre, non tutti i microscopi sono equipaggiati per l'imaging a contrasto di fase e, a sua volta, l'imaging a contrasto di fase non è adatto a tutti i tipi di analisi di microscopia. Un altro strumento promettente, gratuito e basato su ImageJ, è MicrobeJ 17 , ma ancora di più può essere utilizzato solo il contrasto di fase e le immagini fluorescenti. Inoltre, questo protocollo consente solo l'imaging e l'analisi delle cellule in momenti specifici del loro ciclo di vita. Tuttavia, un ottimo protocollo che descrive l'imaging di tempo e l'analisi di immagine successiva, che consente di seguire singoliLe traiettorie delle cellule e le dinamiche proteiche 21 possono anche essere applicate a V. parahaemolyticus .
Seguendo le fasi descritte in questo protocollo, gli scienziati consentiranno di eseguire microscopia a fluorescenza a cellule singole affidabili e riproducibili sia per il nuotatore che per il tipo di cellule swarmer di V. parahaemolyticus . Questo protocollo illustra un modo robusto per trasformare V. parahaemolyticus dal suo nuotatore nel suo tipo di cellule swarmer. Imprimendo il monostrato di cellule swarmer dai perturbatori periferici di colonie di swarming su un tampone di agarosio, si può osservare la localizzazione intracellulare di proteine, la pipeline per l'analisi delle immagini può essere applicata ad altre specie batteriche che esistono all'interno delle comunità batteriche dove le cellule crescono Vicinanza molto vicina e situazioni in cui l'analisi automatica delle immagini potrebbe non essere un vantaggio.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Società Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
