Summary
Dieses Protokoll ermöglicht die Einzelzellmikroskopie der unterschiedlich unterschiedlichen Vibrio parahaemolyticus Schwimmer und Swarmer Zellen. Das Verfahren erzeugt eine Population von Swarmer-Zellen, die für die Einzelzellanalyse leicht verfügbar sind, und umfasst die Herstellung von Zellkulturen, die Induktion von Swarmer-Differenzierung, Probenvorbereitung und Bildanalyse.
Abstract
Die Fähigkeit, die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen zu untersuchen, ist für das Verständnis vieler zellulärer Prozesse unerlässlich. Im Gegenzug erfordert dies die Fähigkeit, einzelne Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie zu erhalten, was bei der Bildgebung von Zellen, die in Bakteriengemeinschaften existieren, besonders schwierig sein kann. Zum Beispiel existiert der menschliche Pathogen Vibrio parahaemolyticus als kurze stabförmige Schwimmerzellen in flüssigen Zuständen, die bei der Oberflächenkontaktdifferenzierung zu einer Subpopulation von stark verlängerten, auf wässerigen Oberflächen spezialisierten Swarmerzellen differenzieren. Dieses Papier stellt eine Methode zur Durchführung einer Einzelzell-Fluoreszenzmikroskopie-Analyse von V. parahaemolyticus in seinen zwei Differentialzuständen vor. Dieses Protokoll induziert sehr reproduzierbar die Differenzierung von V. parahaemolyticus in einen schnelleren Zelllebenszyklus und erleichtert deren Proliferation über feste Oberflächen. Die Methode erzeugt Fackeln von differenzierten Swarmer Zellen, die sich von t erstreckenEr Rand der Schwarmkolonie. Bemerkenswert, an der Spitze der Schwarm-Fackeln befinden sich Swarmer-Zellen in einer einzigen Schicht von Zellen, die ihre leichte Übertragung auf einen Objektträger und die anschließende Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung einzelner Zellen ermöglicht. Darüber hinaus wird der Workflow der Bildanalyse zur demographischen Darstellung von Bakteriengesellschaften vorgestellt. Als prinzipielle prüfung wird die Analyse der intrazellulären Lokalisation von Chemotaxisignalisierungsarrays in Schwimmer und Swarmerzellen von V. parahaemolyticus beschrieben.
Introduction
Bakterien erleben ständig Veränderungen in ihrer äußeren Umgebung und haben mehrere Techniken entwickelt, um ihr Verhalten entsprechend zu verändern und anzupassen. Ein solcher Mechanismus beinhaltet die Differenzierung in verschiedene Zelltypen, die die veränderte Umgebung besser ergänzen. Die Differenzierung beinhaltet oft große Veränderungen in der Regulation des Zellzyklus, der Zellmorphologie und der räumlich-zeitlichen Organisation der Zellen. Ein Organismus, der sich einer Differenzierung unterziehen kann, ist Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus gehört zu den Vibrionaceae , die eine Familie von Proteobakterien ist, die in der Regel frisches oder Salzwasser bewohnen. Vibrionaceae sind weit verbreitet in der Umwelt und umfassen mehrere Arten, die Darmtrakt-Infektionen beim Menschen verursachen, auch einschließlich Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus ist ein dimorpher Organismus und ist in der Lage, in zwei verschiedene Zelltypen als eine Antwort zu differenzieren, um Änderungen an seinem zu unterscheidenExternes milieu In wässrigen Umgebungen existiert es als eine kurze stabförmige Schwimmerzelle mit einem einzigen polaren Flagellum, das am alten Zellpfosten positioniert ist. Bei Oberflächenkontakt wird die Differenzierung in eine schwärmer Zelle ausgelöst. Die Swarmerzelldifferenzierung beinhaltet zwei wesentliche Veränderungen: die Swarmerzellmorphogenese durch Hemmung der Zellteilung und die Induktion eines zweiten Flagella-Systems. Dies führt zur Bildung einer peritrichen und stark verlängerten stabförmigen Swarmerzelle, die entweder den schwärmeren Lebensstil fortsetzen kann, wo Divisionsereignisse zu Nachkommen-Swarmer-Zellen führen oder alternativ zurück in Schwimmerzellen differenzieren.
Es wurde berichtet, dass mehrere Faktoren die Swarmer-Differenzierung induzieren oder beeinflussen. Der primäre Stimulus scheint durch Mechanosensation angetrieben zu werden, wo V. parahaemolyticus das polare Flagellum als einen taktilen Sensor verwendet, der die Hemmung der Rotation auf den Oberflächenkontakt erkennt, aber einige andere Faktoren sind beteiligtGut 1 Im Labor kann die Rotation des polaren Flagellum künstlich durch Zugabe von Phenamilie gehemmt werden, welches die natriumkanalgetriebene Flagellarrotation blockiert, wodurch die Swarmerdifferenzierung 2 induziert wird. Darüber hinaus wurde in einer früheren Studie Vibrio alginolyticus induziert , um auf festen Medien zu schwärmen, wenn Zellen auf Wachstumsmedium in einer Petrischale, die mit einem klaren Plastikband versiegelt wurde, vermehrt wurden. Alkali-gesättigtes Filterpapier verhinderte, unter diesen Bedingungen zu schwärmen, was darauf hindeutet, dass eine oder mehrere flüchtige Säuren an der Induktion von Schwärmen beteiligt sein könnten. So versiegelte die Versiegelung der Petrischale mit Plastikband wahrscheinlich die Ansammlung von flüchtigen Säuren, die als Nebenprodukte des Zellstoffwechsels gebildet wurden, innerhalb des Kopfraums der Platte. Der gleiche Effekt wurde erreicht, wenn H 2 O 2 dem Wachstumsmedium in nicht versiegelten Petrischalen zugesetzt wurde, um künstlich flüchtige Säuren durch Hydrolyse von Medienkomponenten herzustellen
V. parahaemolyticus Differenzierung beinhaltet große Änderungen in der Regulierung der Zellteilung, zelluläre Morphologie und die Positionierung von makromolekularen Maschinen wie FlagellA und Chemotaxis Apparate - Prozesse, die alle die spezifische Lokalisierung von Proteinen nach dem Zellzyklus erfordern. Somit ist die Fähigkeit, die intrazelluläre Lokalisation solcher Proteine zu untersuchen, für das Verständnis der vorgenannten zellulären Prozesse wesentlich. Um solche Studien durchzuführen, ist eine Fluoreszenzmikroskopie an einzelnen Zellen erforderlich. Dies kann bei der Bildgebung von Zellen, die in dichten Bakterienpopulationen existieren, besonders herausfordernd sein, wie dies bei Swarmer-Zellen der Fall ist. Es gab Versuche, eine schwächere Differenzierung in flüssigen Medien zu induzieren, die potentiell einzelne Zellen für Mikroskopie-Studien erzeugen könnten. Und obwohl auf einer Transkriptionsstufe diese Zellen das Swarmer-Differenzierungs-Programm teilweise induziert haben, unterliegen sie nicht denselben deutlichen morphologischen Veränderungen, wie voll differenzierte, auf festem Medium gewachsene Zellen Dieses Papier bietet ein robustes und reproduzierbares Protokoll einer Methode, um Swarmer ce zu induzierenDie Differenzierung auf einer Agarfläche. Das Protokoll erzeugt eine Population von leicht zugänglichen Swarmer-Zellen, die für die Einzelzellmikroskopie und die anschließende Analyse verfügbar sind. Darüber hinaus ermöglicht das Protokoll die Lokalisierungsstudien von fluoreszenzmarkierten Proteinen sowohl im Schwimmer als auch in den Swarmer-Zelltypen (Abschnitte 1, 2, 3, 4). Darüber hinaus beschreibt das Protokoll den nachfolgenden Workflow, wie man die erzeugten Daten aus Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten verarbeitet und analysiert, was eine demographische Analyse von Bakteriengesellschaften ermöglicht (Abschnitt 5).
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Protocol
1. Vorbereitung von elektrokompetenten V. parahaemolyticus- Zellen und Elektroporation von Plasmid-DNA in Schwimmerzellen
HINWEIS: Der folgende Abschnitt des Protokolls ermöglicht die Herstellung von elektrokompetenten Zellen und die anschließende Elektroporation von Plasmid-DNA in Schwimmerzellen. Dieser Schritt ist wichtig, wenn fluoreszierende Proteine aus einem Plasmid ektopisch exprimiert werden.
- Streifen Sie V. parahaemolyticus Zellen aus einem -80 ° C Glycerin-Stamm auf eine frische LB-Agar-Platte, die 100 μg / ml Ampicillin enthält, und inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
- Am folgenden Tag werden 200 ml LB-Medium mit einer einzigen Kolonie von V. parahaemolyticus inokuliert und bei 37 ° C unter Schüttelbedingungen inkubiert, bis eine OD 600 von 1,0 erreicht ist. Es dauert gewöhnlich 5-6 h Inkubation für die Zellkultur, um die gewünschte optische Dichte zu erreichen.
- Sofort die Zellen auf Eis und perf übertragenOrm alle weiteren Schritte auf Eis und in 4 ° C vorgekühlten Zentrifugen.
- Die Zellen bei 4 ° C für 10 min bei 2.000 x g ernten.
- Den Überstand durch Dekantieren verwerfen und das Zellpellet in 25 ml eiskalter 273 mM Saccharose-Lösung (pH 7,4, gepuffert mit KOH) wieder suspendieren.
- Die Zellen erneut bei 4 ° C für 10 min bei 2000 x g ernten. Wiederholen Sie zwei weitere Zeiten.
- Das gewaschene Zellpellet in 400 μl eiskalter 273 mM Saccharoselösung erneut suspendieren. Anschließend wird Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 15% vol / vol zugegeben. Die Zellen sind nun zur Elektroporation bereit, können aber auch in Aliquoten von 70 μl bei -80 ° C für spätere Verwendung eingefroren werden.
- Für die Elektroporation wird ein 70 μl Aliquot von elektrokompetenten Zellen mit 100 - 1000 ng Plasmid-DNA vermischt und die Mischung in eine eiskalte Elektroporationsküvette (0,2 cm Elektrodenspalt) überführt. Führen Sie die Elektroporation mit folgenden Einstellungen durch: 25 μF, 2400 V und 200 Ω.
- SuspendierenZellen in der Elektroporationsküvette in 600 μl LB-Brühe, überführen in ein 2-ml-Röhrchen und inkubieren unter Schütteln bei 37 ° C für 3 h.
- Die Zellen bei 2000 xg für 5 min abreiben und das Pellet in 100 & mgr; l LB-Brühe erneut suspendieren. Verbreiten Sie die Zellsuspension auf selektive LB-Agarplatten, die die notwendigen Antibiotika enthalten und bei 37 ° C über Nacht inkubieren.
- Am nächsten Tag, überprüfen Sie die Platten für Koloniebildung. Kolonien, die wachsen, tragen das korrekte Antibiotikaresistenzgen, das auf dem Plasmid codiert ist, und kann nun für weitere Experimente verwendet werden.
2. Induktion der Swarmer-Zelldifferenzierung
HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben, wie man die Differenzierung von V. parahaemolyticus in seinen schnelleren Zelllebenszyklus induziert und wie man die Proliferation auf festen Oberflächen stimuliert.
- 4 g Herzinfusion (HI) Agar in 100 ml ddH 2 O suspendieren, um die schwärmenden Platten vorzubereiten.
- Die HI-Agar-Lösung vorsichtig in der Mikrowelle kochen und die Flasche von Zeit zu Zeit schütteln, bis das Pulver aufgelöst ist. Autoklav bei 121 ° C für 20 min.
- Nach dem Autoklavieren den HI-Agar auf 60-65 ° C abkühlen lassen. Addieren Sie 2,2'-Bipyridyl zu einer Endkonzentration von 50 μM (Stammlösung von 50 mM in 100% Ethanol). Füge CaCl 2 zu einer Endkonzentration von 4 mM (Stammlösung von 4 M in ddH 2 O) hinzu. Wenn nötig, fügen Sie Antibiotika in die Lösung, um Plasmide zu erhalten.
HINWEIS: Wenn man plant, ein induzierbares Plasmid zu verwenden, füge das induzierende Mittel zu seiner Endkonzentration hinzu.
ACHTUNG: 2,2'-Bipyridyl: Akute Toxizität (oral, dermal, inhalation). Bei der Handhabung dieser Chemikalie Handschuhe und Schutzbrille verwenden. - 40 - 35 ml der endgültigen HI-Agar-Lösung in eine runde 150 mm Petrischale geben und den Agar verfestigen lassen.
- Vor dem Auftragen der Zellkultur, trocknen Sie die Agarplatte bei 37 ° C für mindestens 10 min (oder bis irgendwelche flüssigen Rückstände disaPpeared, aber nicht mehr) rechts oben mit offenem Deckel.
HINWEIS: Die Trockenzeiten hängen stark von dem verwendeten Inkubator ab und schwer getrocknete Platten erlauben keine Schwärme von V. parahaemolyticus . (Dieser Schritt ist sehr wichtig!) Platten müssen frisch verwendet werden und sollten nicht älter als 2 - 3 h sein. Alte Platten werden zu trocken sein, um das Schwärmen zu stimulieren. - Inokulieren Sie eine kleine Menge von Zellen aus dem Rand einer einzelnen Kolonie in 5 ml LB-Brühe. Inkubieren Sie das Kulturschütteln bei 37 ° C bis OD 600 = 0,8 erreicht ist, dauert es normalerweise ca. 2-3 Stunden. Danach sind die Zellen bereit, auf HI Swarming Agar Platten entdeckt zu werden.
- Spot 1 μl Zellkultur in der Mitte einer HI-Agar-Swarming-Platte ( Abbildung 1A ).
- Lassen Sie den Fleck trocken ( Abbildung 1B ).
- Die Platte mit klarem Plastikband abdichten und darauf achten, dass sie fest befestigt ist, sonst könnte sie sich während der Inkubation über Nacht lösen (Abbildung 1C ).
HINWEIS: Es istSehr wichtig, dass das Siegel perfekt ist. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen und Falten auf das Band, wenn es angewendet wird. - Die Platte bei 24 ° C über Nacht inkubieren. Dies führt zur Bildung einer V. parahaemolyticus - Schwarmkolonie mit Schwarm-Fackeln, die sich von der Peripherie der Schwarmkolonie erstrecken (Abbildung 2 ).
3. Vorbereitung von V. parahaemolyticus Swarmer Zellen zur Fluoreszenzmikroskopie
HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt, wie man mikroskopische Agarose-Objektträger und die anschließende Prägung von schwärmenden Fackeln auf ein Agarose-Pad vorbereitet, um einzelne Swarmer-Zellen für die Mikroskopie zu erhalten.
- Zur Herstellung von Agarose-Objektträgern für die Mikroskopie werden 1 g Agarose zu 100 ml einer 20% vol / vol PBS und 10% vol / vol LB-Brühe-Lösung gegeben. Die Lösung in der Mikrowelle sorgfältig abkochen, um die Agarose aufzulösen und unter Mischen mit einem Magnetrührer auf 65-70 ° C abkühlen zu lassen.
- Platz acMageres Mikroskop auf einen perfekt ebenen Abschnitt einer Arbeitsbank schieben. Decken Sie beide Enden der Folie mit zwei Schichten von Allzweck-Laborbeschriftungsband, Befestigung der Folie auf die Arbeitsbank. Der Abstand zwischen den beiden Bandstücken sollte etwa 3 cm betragen.
HINWEIS: Die beiden Schichten des Bandes schaffen eine sehr kleine Höhe, die die Höhe des Agarose-Pad bestimmen wird. Es ist wichtig, dass der Arbeitsraum eben ist, um sicherzustellen, dass Zellen in der gleichen Ebene für die Mikroskopie-Analyse sein werden. - Pipet ~ 250 μl der zuvor hergestellten Agaroselösung auf die nicht überzogene Glasoberfläche pipettieren.
- Legen Sie nun einen zweiten Mikroskop-Objektträger in die gleiche Ausrichtung wie die untere auf die Oberseite und drücken Sie ihn leicht nach unten, so dass Rest-Agarose an den Seiten fließen kann.
- Lassen Sie die Agarose 1-2 min verfestigen und ziehen Sie dann langsam die obere Glasrutsche von der Unterseite in einer horizontalen Bewegung.
- Mit einem Skalpell, schneiden Sie alle restlichen Agarose, die an derSeiten des Mikroskops gleiten und entfernen Sie langsam das Band von den Enden des Objektträgers.
HINWEIS: Die Agarose-Folie ist nun fertig und sollte so schnell wie möglich verwendet werden, da sie langsam anfängt zu trocknen. - Um eine Mikroskopie auf schwärmeren Zellen durchzuführen, schneide ein ~ 3 mm x 10 mm Stück des schwärmenden Agars von der äußersten Kante einer schwärmenden Kolonie aus (Abbildung 1D ). Es ist sehr wichtig, die Banddichtung der Schwarmplatte erst unmittelbar vor dem Transfer von Swarmer-Zellen zum Mikroskop-Objektträger zu brechen. Sobald das Band entfernt ist, beginnen schwärmende V. parahaemolyticus Zellen die Differenzierung in Schwimmerzellen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Schnitte von der Außenseite des schwärmenden Kolonierandes bis zur Innenseite der Kolonie zu lenken ( Abbildung 1D ). Auf diese Weise können Sie "Schwimmer-Kontamination" in den Rand der schwärmenden Kolonie verhindern. - Übertragen Sie das Stück des schwärmenden Agars auf eine Mikroskop-Agarose-Folie mit den Zellen, die der Agarose pa zugewandt sindD ( Abbildung 1E ). Dies drückt die schwärmenden Zellen auf die Agarose-Auflage.
- Nach dem Warten von ~ 30 s, entfernen Sie das Agar-Stück vorsichtig aus dem Agarose-Pad (Abbildung 1F ).
- Legen Sie ein Glasdeckel auf das Agarose-Pad, wo die Zellen eingeprägt wurden. Die Zellen sind nun bereit für die Mikroskopie.
ANMERKUNG: Es ist wichtig, sofortere Zellen sofort zu untersuchen, da Swarmerzellen langsam eine Differenzierung zum Schwimmerzustand einleiten.
4. Vorbereitung von V. parahaemolyticus Schwimmer Zellkulturen für die Fluoreszenzmikroskopie
ANMERKUNG: Dieser Abschnitt des Protokolls beschreibt, wie man eine Kultur von V. parahaemolyticus zur Durchführung einer Fluoreszenzmikroskopie auf dem Schwimmerzelltyp vorbereitet.
- Inokulieren Sie eine kleine Menge von Zellen aus dem Rand einer einzelnen Kolonie in 5 ml LB-Brühe. Inkubieren Sie das Kulturschütteln bei 37 ° C für 1 h oder bis das leichte Zellwachstum sichtbar wird.
- BeimIn diesem Stadium, wenn nötig, fügen Sie induzierenden Mittel für die Expression von Proteinen von Interesse. In diesem Beispiel wurde L-Arabinose zu einer Endkonzentration von 0,2% (w / vol) zugegeben, um die Expression von YFP-CheW 9 zu induzieren.
- Inkubieren Sie das Kulturschütteln für weitere 2 h bei 37 ° C.
- Befolgen Sie die Schritte 3.1-3.7, um mikroskopische Agarose-Folien herzustellen.
- 1 & mgr; l Zellkultur in der Mitte des Agarosekissens auflösen und den Fleck inkubieren lassen, bis er trocken ist.
- Legen Sie ein Glas Deckglas auf die Agarose-Pad, wo die Zellen wurden entdeckt. Die Zellen sind nun bereit, unter dem Fluoreszenzmikroskop abgebildet zu werden.
5. Bildanalyse
Dieser Teil des Protokolls beschreibt einen Workflow für die Bildanalyse, insbesondere, wie man Fluoreszenzdaten einzelner Zellen für die demographische Analyse extrahiert.
- Bevor Sie mit der Bildanalyse beginnen, stellen Sie sicher, dass alle Mikroskopiebilder im 16-Bit-TIF-Format gespeichert sind.
- Laden Sie den DIC (oder Phasenkontrast) und die entsprechenden Fluoreszenzkanalbilder in die Software.
- Erstellen Sie ein Overlay-Bild beider Kanäle, indem Sie "Display / Overlay-Bilder" auswählen. Setzen Sie die Anzahl der Bilder ("# Bilder:") auf zwei, und wählen Sie das DIC-Bild im ersten Kanal und das Fluoreszenzbild im zweiten Kanal.
- Wählen Sie das Werkzeug "Multi-Line" aus der Symbolleiste und markieren Sie Zellen von einem Pol zum anderen durch die Mitte der Zelle. Um eine Liste aller generierten Linien (Linienobjekte) zu erhalten, öffnen Sie "Messen / Region Messungen". Konfigurieren Sie die Bereichsmessungen, um nur die Länderbeschriftung, die Distanz und die durchschnittliche Intensität anzuzeigen.
- Kalibrieren Sie die Pixelgröße unter "Messen / Kalibrieren von Entfernungen" auf die Pixelgröße, die für Ihr Mikroskop-Setup spezifisch ist, und klicken Sie auf "Auf alle offenen Bilder anwenden".
- Übertragen Sie alle Regionen (Linienobjekte) auf das Fluoreszenzkanalbild. Unter "Regionen / TransfEr Regions "wählen Sie das Quellbild (das Overlay-Bild) und das Zielbild (das Fluoreszenz-Kanal-Bild). Wählen Sie" Alle Regionen "und drücken Sie" OK ".
HINWEIS: Um die genauen Linien (Linienobjekte, Regionen, ROI) später wieder herzustellen, öffnen Sie "Regionen / Regionen speichern" und speichern Sie die Regionen. - Exportieren Sie alle Bereichsmessungen in eine Tabellenkalkulation, indem Sie "Messen / Region Messungen" öffnen und "Open Log" drücken. Bestätigen, um die Daten zu öffnen und zu exportieren. Sobald die Kalkulationstabelle im Hintergrund geöffnet ist, exportieren Sie schließlich die Daten mit "F9: Log Data".
- Um die Position der fluoreszierenden Brennpunkte entlang der Zelle zu bestimmen, öffnen Sie "Measure / Linescan". Setzen Sie "Linescan Width" auf einen Wert, so dass die gesamte Breite einer Zelle von der Region abgedeckt wird, die Sie zuvor erstellt haben. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Zeilendiagramm und wählen Sie "Grafikdaten anzeigen". Durch Linksklick und Ziehen der Maus-Courser entlang der Linie-Scan auf dieInteressante, das Fenster "Graph Data" zeigt das entsprechende Pixel / Abstand zwischen den beiden Punkten an. Markieren Sie die blau markierte Zeile und kopieren Sie den Inhalt.
HINWEIS: Das gesamte Zeilen-Scan-Intensitätsprofil kann in einer Tabelle durch Drücken von "Log Data" im Fenster "Linescan" protokolliert werden. Die extrahierten Daten können nun zur Visualisierung in Graphen oder zur weiteren statistischen Analyse verwendet werden. Lokalisierungsmuster über den Zellzyklus lassen sich leicht in einer demographischen Darstellung der Zelllänge und der Fluoreszenzintensitäten entlang des Zellkörpers visualisieren. Diese Darstellungen können mit dem zuvor gewählten ROI erhalten werden. Die folgenden Schritte geben ein Beispiel dafür, wie man Demographie ähnlich den in den Fig. 3C und 4C gezeigten erzeugt.- In Fiji / ImageJ Ladebereich Markierungen (.rgn) zuvor in der Software erstellt (Schritt 5.6) mit dem "Metamorph nd & ROI-Dateien Importeur". Alternativ können die interessierenden Regionen (ROIs) der zu analysierenden Zellen direkt in Fidschi / ImageJ mit dem eingebauten "Segmented Line" -Tool erstellt werden.
- Öffnen Sie "Analysieren / Werkzeuge / ROI-Manager" und markieren Sie alle aktiven Listeneinträge ".
- Danach klicken Sie auf "Mehr / Multi Plot" und wählen Sie dann "List" im neuen Fenster "Multi Plot". Klicken Sie auf einen Tabelleneintrag und wählen Sie dann "Alle kopieren". Anschließend in eine neue Kalkulationstabelle einfügen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Daten der längsten Zelle (zwei entsprechende X- und Y-Spalten mit der meisten Zeilenanzahl) die letzte in der Kalkulationstabelle sind. - Speichern Sie die Kalkulationstabelle als "CSV (Comma delimited) (* .csv)".
- Laden Sie die R-Skripte von hier aus "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10. Die Scripts sortieren Zellen nach Länge und normalisieren die Fluoreszenzintensitätsprofile aller Zellen als Durchschnitt der einzelnen Fluoreszenz jeder ZelleE.
- Führen Sie das gesamte Skript "Zellprofile function.R" in R [Version 3.0.1; 11 ].
- Bearbeiten Sie das Skript "Beispiel plots.R" in Zeile 30, so dass sich der Dateipfad auf den Ordner bezieht, in dem die zuvor erzeugte .csv-Datei gespeichert ist. Ändern Sie außerdem den Dateinamen "profile.csv" in Zeile 31 auf den Dateinamen, der für die in Schritt 5.9.4 generierte .csv-Datei ausgewählt wurde. Danach führen Sie "example plots.R" und folgen Sie der Dokumentation von "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" sowie den Kommentaren aus der Skriptdatei, um demografische Analyse zu generieren.
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Representative Results
Induktion der Differenzierung und Erzeugung von schwärmenden Kolonien
Abbildung 1 zeigt ein Schema der wichtigen Schritte bei der Herstellung von schwärmenden Kolonien von V. parahaemolyticus ( Abbildung 1A-C ). Eine Schwimmerkultur wurde auf Schwarm-Agar entdeckt und bei 24 ° C inkubiert, wodurch eine stärkere Differenzierung und Proliferation über die feste Agaroberfläche induziert wurde. Ein repräsentatives Stereomikroskopiebild einer schwärmenden Kolonie ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Stereomikroskopie-Bildgebung zeigt deutlich Schwärme-Fackeln, die sich außerhalb der Schwarmkolonieperipherie erstrecken. Höhere Vergrößerung zeigt, dass in den Schwarm-Fackeln Zellen nur in Mono- oder Bi-Schichten gruppiert sind, während in der Mitte der Schwarm-Kolonie Zellen in mehreren Schichten gestapelt werden (Abbildung 2A ). Schwarmfackeln können leicht übertragen werden (wie in den Schritten 3.8-3.11 beschrieben,
Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse
Abbildung 1: Induktion der Swarmer-Differenzierung und Vorbereitung von Zellen für die Mikroskopie-Bildgebung. Vereinfachte Visualisierung des Arbeitsablaufs zur Herstellung von V. parahaemolyticus swarmer Zellen und zur Herstellung von Objektträgern zur Mikroskopieanalyse einzelner Swarmerzellen. ( A ) Spot 1 & mgr; l einer OD 600 = 0,8 Zellkultur von V. parahaemolyticus in der Mitte einer HI-Agar- Schwarmplatte . ( B ) Inkubieren Sie den Fleck, bis er getrocknet ist und die Zellen an der Agaroberfläche befestigt sind. ( C ) Die Petrischale mit klarem Band abdichten Inkubieren Sie die Platte bei 24 ° C für 16 h. ( D ) Tragen Sie sorgfältig ein kleines Stück HI-Agar aus dem äußeren Rand der schwärmenden Kolonie aus. ( E ) Übertragen Sie die Exzision auf ein MikrOscopy-Agarose-Pad mit den Swarmer-Zellen, die dem Agarose-Pad zugewandt sind. Nach einer kurzen Inkubationszeit von 30 s werden die Swarmer-Zellen auf das Agarose-Pad aufgeprägt. ( F ) Ausgeschnittenen Agar vorsichtig aus dem Agarose-Pad entfernen und ein Mikroskop-Deckglas aufsetzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Die Organisation der Zellen in einem V. parahaemolyticus Swarming Colony. ( A ) Stereomikroskopie einer V. parahaemolyticus Swarmer Kolonie. Die oberen Tafeln zeigen die äußere Kante einer schwärmenden Kolonie in zunehmender Vergrößerung. Die unteren Tafeln zeigen eine Fläche der schwärmenden Kolonie zwischen dem Zentrum und dem Rand bei zunehmender Vergrößerung. Schwarmfackeln erstrecken sich von der Peripherie vonDie Schwarmkolonie. ( B ) Repräsentative DIC-Mikroskopiebilder der schwärmeren Koloniekante (oberer Tafel) und einer Fläche zwischen dem Zentrum und dem Rand (Bodenplatte) nach der Übertragung von Zellen von den jeweiligen angezeigten Stellen der schwärmenden Kolonie. Die Schwarmfackeln wurden direkt auf eine Mikroskopie-Agarose-Auflage geprägt, wie in den Schritten 3.8-3.11 beschrieben. Zellen aus dem Bereich zwischen dem Zentrum und der Peripherie wurden zuerst von der Schwarmkolonie abgeschabt und in LB-Brühe wieder suspendiert, bevor sie auf eine Mikroskopie-Agarose-Auflage gesichtet wurden. Maßstab = 7,5 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Lokalisierung von Chemotaxis-Arrays in Schwimmerzellen von V. parahaemolyticus. ( A ) DIC und fluoreszierende mikroskopische Bilder von Wildtyp- V. parahaemolyticus Schwimmerzellen, die ectopisch YFP-CheW exprimieren. ( B ) Graph, der die YFP-CheW-Foci-Verteilung zeigt, indem man den Abstand der Brennpunkte aus den Zellpole als Funktion der Zelllänge in Schwimmerzellen aufzeichnet. ( C ) Demographische Analyse von Fluoreszenzintensitätsprofilen von V. parahaemolyticus- Schwimmerzellen, die YFP-CheW exprimieren. Die Zellen werden nach Zelllänge sortiert und zeigen eine relative Fluoreszenzintensität an. Maßstab = 5 μm. Panel B und C sind aus Referenz 9 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Lokalisierung von Chemotaxis-Arrays in Swarmer-Zellen von V. parahaemolyticus. A ) DIC und fluoreszierende mikroskopische Bilder von Wildtyp- V. parahaemolyticus swarmer Zellen, die ectopisch YFP-CheW exprimieren. ( B ) Graph, der die YFP-CheW-Foci-Verteilung anzeigt, indem man den Abstand der Brennpunkte aus den Zellpole als Funktion der Zelllänge in schwärmeren Zellen aufzeichnet. ( C ) Demographische Analyse von Fluoreszenzintensitätsprofilen von V. parahaemolyticus swarmer Zellen, die YFP-CheW exprimieren. Die Zellen werden nach Zelllänge sortiert und zeigen die relative Fluoreszenzintensität an. Maßstab = 5 μm. Die Felder B und C sind von der Referenz 9 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Papier berichtet über eine Methode zur mikroskopischen Bildgebung von V. parahaemolyticus swarmer Zellen, gefolgt von nachgeschalteten Analysen, die dazu bestimmt sind, die subzelluläre Lokalisation und andere Merkmale der untersuchten fluoreszenzmarkierten Proteine zu lösen und zu quantifizieren. Obwohl für die Mikroskopie-Bildverarbeitung und -analyse 14 , 15 , 16 , 17 , 18 mehrere Werkzeuge existieren , bleibt die Analyse von V. parahaemolyticus-Swarming- Zellen meist schwierig, weil sie normalerweise in einer dichten Zellgemeinschaft existieren und eine hohe Variation der Zelllänge ( Abbildung 2 ). Daher ist die automatisierte Zellenerkennung manchmal fehlerhaft und damit die Ergebnisse etwas unzuverlässig. Dieses Protokoll skizziert eine Pipeline, die entworfen ist, um zu wachsen, zu bild und zu analysieren , schwärmende Zellen von V. parahaemolyticus , die auf die Spezifikation zugeschnitten istDass eine kontrollierte Wachstumsumgebung auf einer Oberfläche und nachgeschalteten Bildanalysen, die das Vorhandensein von Zellen mit variablen Längen aufnehmen, die in unmittelbarer Nähe wachsen.
Die Fähigkeit, ein Protein von Interesse aus einem Plasmid exprimieren zu können, kann für mehrere Experimente wichtig sein, zB Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen für Mikroskopie-Studien oder Komplementierung von Gen-Deletionen. Hier wird auch das Verfahren zur Herstellung von chemisch kompetenten Zellen und die Elektroporation von Plasmid-DNA in V. parahaemolyticus beschrieben. Der Vorteil der Elektroporation über die Konjugation, die oft für V. parahaemolyticus verwendet wird , besteht darin, dass das Plasmidrückgrat nicht modifiziert werden muss, um eine Konjugation zu ermöglichen. Trotzdem sollten einige Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden; Wie in Schritt 1.2 beschrieben, ist es sehr wichtig, eine Zelldichte von OD 600 = 1,0 zu erreichen. Bei niedrigeren optischen Dichten werden die Zellen auf Elektroporati lysierenBei und bei höheren Dichten wird das Plasmid nicht von den Zellen aufgenommen. Darüber hinaus wird eine zu harte Zentrifugation von V. parahaemolyticus- Zellen (Schritte 1.4-1.6) drastisch die Elektroporationseffizienz verringern. Es ist auch wichtig, das Zellpellet während der Waschschritte sorgfältig zu suspendieren, um elektrokompetente Zellen zu erzeugen.
Obwohl die Vorbereitung einer Zellkultur trivial klingt, ist die Kulturdichte für die schwärmende Leistung sehr wichtig. Im Allgemeinen wird eine Zellkultur in der frühen exponentiellen Wachstumsphase (OD 600 <0,5) eine größere schwärmende Kolonie während der Inkubation über Nacht erzeugen als eine Kultur in einer späten exponentiellen oder frühen stationären Phase. Je nach Experiment könnte eine größere schwärmende Kolonie von Vorteil sein. Um jedoch die Kolonieexpansion und die Morphologie zwischen verschiedenen Stämmen, die auf der gleichen HI-Agar-Schwarmplatte gezüchtet wurden, zu vergleichen, ist es wichtig, genügend Platz zwischen einzelnen schwärmenden Kolonien zu haben. Das kann ach seinDh durch Spotting einer Zellkultur mit höherer optischer Dichte, die in der Regel zu kleineren schwärmenden Kolonien führen wird.
Die Induktion des schwärmenden Phänotyps variiert signifikant zwischen den Bakterienarten und die Reproduzierbarkeit hiervon wird stark von Faktoren wie Agar- und Nährstoffzusammensetzung, der Umgebungstemperatur und dem Feuchtigkeitsgehalt von Umgebung und Wachstumsmedium beeinflusst. Folglich beeinflussen kleinere Änderungen im Protokoll und in der äußeren Umgebung die Schwarm-Assay-Ergebnisse und die Induktion der Swarmer-Differenzierung. Es wurden Protokolle zur Induktion von Schwärmen anderer Bakterienarten wie Pseudomonas aeruginosa und Bacillus subtilis gemeldet. Die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte werden zuverlässig die Swarmer-Zelle-Art von V. parahaemolyticus produzieren und sie in Form von schwärmenden Kolonien aufrechterhalten , die einschichtige schwärmende Fackeln am Rande der Kolonie erzeugen. Stabile undReproduzierbare Experimente an der Swarmer-Zelle-Art von V. parahaemolyticus , die Vorbereitung der HI-Swarming-Agar-Platten ist der wichtigste Teil dieses Protokolls. Insbesondere kann der Trocknungsschritt eine Optimierung erfordern, da jeder Inkubator anders ausführen wird. Ein weiterer Faktor, der das Schwärmeverhalten beeinflussen kann, ist die Art der in den Petrischalen verwendeten Kunststoffe. Die typischen Petrischalen, die in unserem Labor verwendet werden, um schwärmende Experimente durchzuführen, werden aus Polystyrol (PS) hergestellt. Allerdings, mit Petrischalen aus Low-Density-Polyethylen (PE LD) produziert gemischte Ergebnisse in schwärmenden Assays. Es ist entscheidend, den beschriebenen Schritten zu folgen, denn nur dann werden reproduzierbare schwärmende Kolonien, die eine deutliche periphere Aufflackernbildung aufweisen, bilden, die eine einzelne Swarmer-Zellmikroskopie ermöglichen.
Zweifellos können verschiedene Ansätze genommen werden, um die Ergebnisse zu zeigen, die durch Fluoreszenzmikroskopie-Untersuchungen von V. parahaemolyticus-schwärmenden Zellen wiedergegeben werden. Für instancE, das weit verbreitete Programm MicrobeTracker 16 stellt eine plausible Alternative dar. Die kürzlich verfügbare MicrobeTracker Applikation Oufti 20 , die MATLAB nicht benötigt, ist ebenfalls eine andere Alternative. Allerdings ist die Verwendung von Differentialschnittstellenkontrast- (DIC-) Bildern bei Oufti nicht möglich, und die Phasenkontrast-Bildgebung ist nicht geeignet, die Zellsegmentierung in schwärmeren Zellen zu unterscheiden. Darüber hinaus sind nicht alle Mikroskope für die Phasenkontrast-Bildgebung ausgerüstet und wiederum ist die Phasenkontrast-Bildgebung nicht für alle Arten von Mikroskopie-Analysen geeignet. Ein weiteres vielversprechendes Werkzeug, das frei und ImageJ-basiert ist, ist MicrobeJ 17 , aber nochmals können nur Phasenkontrast und fluoreszierende Bilder verwendet werden. Darüber hinaus erlaubt dieses Protokoll nur die Abbildung und Analyse von Zellen zu bestimmten Zeitpunkten ihres Lebenszyklus. Allerdings ist ein ausgezeichnetes Protokoll, das die Zeitraffer-Bildgebung beschreibt, und die anschließende Bildanalyse,Zelltrajektorien und Proteindynamik 21 können wahrscheinlich auch auf V. parahaemolyticus angewendet werden .
Nach den in diesem Protokoll beschriebenen Schritten können die Wissenschaftler eine zuverlässige und reproduzierbare Einzelzell-Fluoreszenzmikroskopie sowohl am Schwimmer als auch im Swarmer-Zelle-Typ von V. parahaemolyticus durchführen . Dieses Protokoll beschreibt einen robusten Weg, um V. parahaemolyticus von seinem Schwimmer in seinen schwärmeren Zelltyp zu verwandeln. Durch die Prägung der Monolayer von Swarmer-Zellen aus den peripheren Fackeln der schwärmenden Kolonien auf ein Agarose-Pad kann die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen beobachtet werden, die Pipeline für die Bildanalyse kann wahrscheinlich auf andere Bakterienarten angewendet werden, die in Bakteriengemeinschaften vorhanden sind, in denen Zellen wachsen Sehr enge Nähe und Situationen, in denen die automatisierte Bildanalyse nicht von Vorteil sein könnte.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte deklariert.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
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