Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של Published: May 15, 2017 doi: 10.3791/55842
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Ecophysiology, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology

Summary

פרוטוקול זה מאפשר מיקרוסקופית תא בודד של מובחן Vibrio parahaemolyticus שחיין ותאי swarmer . השיטה מייצרת אוכלוסייה של תאים swarmer זמין בקלות עבור ניתוח תא בודד ומכסה הכנה של תרבויות תאים, אינדוקציה של בידול swarmer, הכנת המדגם, ניתוח תמונה.

Abstract

היכולת ללמוד את לוקליזציה תאיים של חלבונים חיונית להבנה של תהליכים סלולריים רבים. בתורו, זה דורש את היכולת להשיג תאים בודדים עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר יכול להיות מאתגר במיוחד כאשר תאים הדמיה הקיימות בקהילות חיידקים. לדוגמה, האדם הפתוגן Vibrio parahaemolyticus קיים כמו קצר בצורת מוט שחין בצורת בתנאים נוזליים כי על פני השטח קשר להבדיל subpopulation של תאים swarmer מוארך מאוד התמחה לצמיחה על משטחים מוצקים. מאמר זה מציג שיטה לבצע יחיד תא פלואורסצנטי ניתוח מיקרוסקופ של V. parahaemolyticus בשני מצבי ההפרש שלה. פרוטוקול זה reproducibly מאוד גורם הפרדה של V. parahaemolyticus לתוך מחזור חיי תא מחזורי ומקל על התפשטות שלהם על פני משטחים מוצקים. השיטה מייצרת התפרצויות של תאים swarmer מובחנת המשתרעת מ tהוא קצה של מושבה נחיל. יש לציין, בקצה מאוד של התנפחות- swarm, תאים swarmer קיים בשכבה אחת של תאים, אשר מאפשר העברת קל שלהם שקופיות מיקרוסקופ ולאחר מכן מיקרוסקופ פלואורסצנטי הדמיה של תאים בודדים. בנוסף, זרימת העבודה של ניתוח תמונות עבור ייצוג דמוגרפי של חברות חיידקים מוצג. כהוכחה לעיקרון, ניתוח של לוקליזציה תאיים של chemotaxis איתות מערכים בשחיינים ותאי swarmer של V. parahaemolyticus מתואר.

Introduction

חיידקים כל הזמן חווים שינויים בסביבה החיצונית שלהם פיתחו מספר טכניקות לשנות ולהתאים את התנהגותם בהתאם. מנגנון אחד כזה כולל את ההבחנה לסוגים שונים של תאים המשלימים טוב יותר את הסביבה המשתנה. בידול לעיתים קרובות כרוך שינויים גדולים הרגולציה של מחזור התא, מורפולוגיה התא, ואת הארגון spatiotemporal של התאים. אורגניזם אחד שיכול לעבור בידול הוא Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus שייך Vibrionaceae , אשר משפחה של proteobacteria כי בדרך כלל מים טריים או מלוחים. Vibrionaceae מופצים באופן נרחב בסביבה וכוללים מספר מינים הגורמים זיהומים בדרכי העיכול בבני אדם, כולל גם cholerae.V Vibrio. Parahaemolyticus הוא אורגניזם dimorphic והוא מסוגל להבדיל לשני סוגי תאים נפרדים כתגובה כדי להתאים את השינויים שלהסביבה חיצונית. בסביבות מימיות, הוא קיים כמו תא שוחה קצר בצורת מוט עם דגלום קוטב יחיד ממוקם על עמוד התא הישן. על פני השטח מגע, בידול לתא swarmer מופעלת. הבדל תאים swarmer כוללת שני שינויים עיקריים: morphogenesis תא swarmer באמצעות עיכוב חלוקת התא, ואת אינדוקציה של מערכת השני flagella. התוצאה היא היווצרותו של תא נחיל, בעל צורה מוטורית ואורך מוארך, אשר יכול להמשיך את סגנון החיים של נחיל, שבו אירועים של חלוקה מביאים לתאי נחילים, או לחילופין להבדיל חזרה לתאי שחיינים.

מספר גורמים דווחו כדי להשפיע או להשפיע על בידול swarmer. הגירוי העיקרי נראה מונע על ידי mechanosensing שבו V. parahaemolyticus משתמש flagell הקוטב כחיישן מישוש המזהה עיכוב של סיבוב על פני השטח קשר, אבל גורמים נוספים מעורבים כמוטוב 1 . במעבדה, סיבוב של דגלום הקוטב יכול להיות מעוכבת באופן מלאכותי על ידי תוספת של phenamil, אשר חוסם את ערוץ הנתרן מונע סיבוב flagellar, ובכך לגרום swarmer differiation 2 . יתר על כן, במחקר מוקדם יותר, Vibrio alginolyticus היה המושרה נחיל על מדיה מוצקה כאשר תאים היו מופצות על המדיום צמיחה בצלחת פטרי חתום עם קלטת פלסטיק ברורה. נייר סינון רווי אלקלי מונע התנפחות תחת תנאים אלה, ומכאן טוען כי אחד או יותר חומצות נדיפות עשוי להיות מעורב אינדוקציה של נחיל. לפיכך, איטום צלחת פטרי עם קלטת פלסטיק מותר ככל הנראה על הצטברות של חומצות נדיפות, נוצר כמו תוצרי לוואי של חילוף החומרים הסלולרי, בתוך שטח הראש של הצלחת. אותו אפקט הושג כאשר H 2 O 2 נוספה בינוני הצמיחה במנות אטום אטום על מנת לייצר באופן מלאכותי חומצות נדיפות ידי hydrolysing רכיבי מדיה , 4 , 5 . עם זאת, הזהות של חומצות נדיפות כאלה עדיין לא ידוע. יתר על כן, הוכח כי זמינות עודפת של סידן 6 ו-הגבלה ברזל 7 הן לשפר את הבדל swarmer והתפשטות על פני משטחים מוצקים. תאים ניתן לרעב ברזל על ידי הוספת המתחם 2,2'-Bipyridyl למדיום הצמיחה, אשר הוכח להשפיע על בידול swarmer 8 . הגורמים ידועים לוויסות בידול מיושמים עכשיו בעיצוב של פרוטוקול זה reproducibly גורם V. parahaemolyticus בידול לתוך תאים swarmer ואת התפשטות שלהם על משטחים אגר מוצק.

V. parahaemolyticus בידול כוללת שינויים משמעותיים ויסות חלוקת התא, מורפולוגיה הסלולר, ואת המיקום של מכונות macromolecular כגון flagellA ו chemotaxis מנגנוני - תהליכים שדורשים כל לוקליזציה ספציפית של חלבונים בהתאם מחזור התא. לכן, היכולת ללמוד את לוקליזציה תאיים של חלבונים כאלה חיונית להבנת התהליכים הסלולר הנ"ל. על מנת לבצע מחקרים כאלה מיקרוסקופ פלואורסצנטי על תאים בודדים נדרשת. זה יכול להיות מאתגר במיוחד כאשר תאים הדמיה הקיימות בתוך אוכלוסיות חיידקים צפופים, כמו במקרה של תאים swarmer. היו ניסיונות לגרום להבדל swarmer בתקשורת נוזלית, אשר יכול ליצור תאים בודדים למחקרים מיקרוסקופיים. ואף על ברמת תעתיק תאים אלה גרמו חלקית את התוכנית swarmer-differentiation, הם לא עוברים את אותם שינויים מורפולוגיים ברורים כמו תאים נבדל מובחן לחלוטין גדל על בינוני מוצק 8 . מאמר זה מציע פרוטוקול חזק לשחזור של שיטה כדי לגרום swarmer CELl הבחנה על פני אגר. הפרוטוקול מייצר אוכלוסייה של תאים swarmer נגיש בקלות זמין עבור מיקרוסקופ תא בודד וניתוח לאחר מכן. יתר על כן, הפרוטוקול מאפשר מחקרים לוקליזציה של חלבונים שכותרתו fluorescently בשחיין סוגי התאים swarmer (סעיפים 1, 2, 3, 4). בנוסף, פרוטוקול מתאר את זרימת העבודה הבאים על איך לעבד ולנתח את הנתונים שנוצר ניסויים מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המאפשר ניתוח דמוגרפי של חברות חיידקים (סעיף 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של המוסמכת V. תאים parahaemolyticus ו electroporation של פלסמיד DNA לתוך תאי שחיינים

הערה: בסעיף הבא של הפרוטוקול מאפשר הכנה של תאים המוסמכות אלקטרו ואת electroporation שלאחר מכן של DNA פלסמיד לתאי שחיינים. צעד זה חשוב אם חלבונים ניאון הם להיות ectopically לידי ביטוי פלסמיד.

  1. להפר את V. תאים parahaemolyticus מ -80 ° C מניות גליצרול על צלחת אגר LB טרי המכיל 100 מיקרוגרם / אמפצילין מ"ל ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. למחרת, לחסן 200 מ"ל של LB בינוני עם מושבה אחת של V. parahaemolyticus ו לדגור אותו על 37 מעלות צלזיוס תחת רעידות התנאים עד 600 OD של 1.0 הוא הגיע. זה בדרך כלל לוקח 5-6 שעות של הדגירה לתרבות התא להגיע הצפיפות האופטית הרצוי.
  3. מיד להעביר את התאים על קרח ו perfOrm כל השלבים הבאים על הקרח ב 4 מעלות צלזיוס מראש צנטריפוגות מקורר.
  4. קציר התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 2000 x גרם.
  5. מחק supernatant ידי decantation מחדש להשעות את גלולה התא 25 מ"ל של קר כקרח 273 פתרון סוכרוז מ"מ (pH 7.4, שנאגרו עם KOH).
  6. קציר התאים שוב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 2000 x גרם. חזור על שתי פעמים נוספות.
  7. Re- להשעות את גלולה תא שטף μL 400 של קר כקרח פתרון 273 מ"מ סוכרוז. לאחר מכן, להוסיף גליצרול לריכוז סופי של נפח 15% / כרך. התאים מוכנים כעת electroporation, אבל יכול גם להיות קפוא aliquots של 70 μL ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  8. עבור electroporation, לערבב 70 aliquot μL של תאים המוסמכות אלקטרו עם 100-1,000 ng של DNA פלסמיד ולהעביר את התערובת לתוך קובט electroporation קר כקרח (0.2 ס"מ אלקטרודה פער). בצע electroporation עם ההגדרות הבאות: 25 μF, 2400 V ו 200 Ω.
  9. להשעות אתתאים בקובט electroporation ב μL 600 של מרק LB, להעביר צינור 2 מ"ל ו דגירה תוך רעד ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
  10. ספין את התאים ב XG 2,000 במשך 5 דקות מחדש להשעות את גלולה μL 100 של מרק LB. מורחים את ההשעיה התא על לוחות אגר LB סלקטיבי המכיל את אנטיביוטיקה הדרושים דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  11. למחרת, לבדוק את צלחות להיווצרות המושבה. מושבות שגדלות לשאת את הגן הנכון אנטיביוטיקה מקודד על פלסמיד והוא יכול לשמש כעת ניסויים נוספים.

2. השראה של התאחדות התאים

הערה: השלבים הבאים מתארים כיצד לגרום להבחנה של V. parahaemolyticus לתוך מחזור החיים של מחזור החיים, וכיצד לעורר התפשטות על משטחים מוצקים.

  1. להשעות 4 גרם של אפר הלב (HI) אגר ב 100 מ"ל dDH 2 O כדי להכין את לוחות נחיל.
  2. בזהירות להרתיח את הפתרון אגר HI במיקרוגל לנער את הבקבוק מעת לעת עד אבקת הוא מומס. החיטוי על 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  3. לאחר החיטוי, להתקרר אגר HI ל 60-65 מעלות צלזיוס. הוסף 2,2'-Bipyridyl לריכוז סופי של 50 מיקרומטר (פתרון המניות של 50 מ"מ באתנול 100%). הוסף CaCl 2 לריכוז סופי של 4 מ"מ (פתרון המניות של 4 M ב DDH 2 O). במידת הצורך, להוסיף אנטיביוטיקה לתוך הפתרון כדי לשמור על פלסמידים.
    הערה: אם מתכננים להשתמש פלסמיד inducible, להוסיף סוכן גורם לריכוז הסופי שלה.
    זהירות: 2,2'-Bipyridyl: רעילות חריפה (אוראלי, דרמטי, שאיפה). השתמש כפפות ומשקפי בטיחות בעת טיפול זה כימי.
  4. יוצקים 30 - 35 מ"ל של הפתרון הסופי אגר HI לתוך צלחת פטרי עגול 150 מ"מ ולתת אגר לחזק.
  5. ממש לפני איתור תרבות התא, יבש את צלחת אגר על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות (או עד שאריות נוזלים יש disaPpeared, אבל לא עוד) למעלה מימין עם מכסה פתוח.
    הערה: פעמים ייבוש תלויים מאוד באינקובטור המשמש לוחות מיובשים בכבדות לא יאפשר swarming של V. parahaemolyticus . (שלב זה חשוב מאוד!) צלחות יש להשתמש טרי לא צריך להיות מעל 2 - 3 שעות. לוחות ישנים יהיה יבש מדי כדי לעורר swarming.
  6. לחסן כמות קטנה של תאים מקצה מושבה אחת לתוך 5 מ"ל של מרק LB. דגירה התרבות רועדת על 37 מעלות צלזיוס עד OD 600 = 0.8 הוא הגיע, זה בדרך כלל לוקח בערך 2-3 שעות. לאחר מכן, התאים מוכנים להיות הבחין על צלחות אגר HI מהמם.
  7. ספוט 1 μL של תרבות התא במרכז צלחת אגר HI נחיל ( איור 1 א ).
  8. בואו נקודה יבשה ( איור 1 ב ).
  9. אטום את הצלחת עם סרט פלסטיק ברור ולוודא כי הוא מחובר היטב, אחרת זה עלול לנתק במהלך הדגירה לילה ( איור 1 ג ).
    הערה: זהחשוב מאוד כי החותם הוא מושלם. הימנע היווצרות של בועות אוויר וקפלים לקלטת כאשר הוא מוחל.
  10. דגירה את הצלחת על 24 מעלות צלזיוס למשך הלילה. זה יוביל להיווצרות של מושבה נחיל V. parahaemolyticus עם נחילי- flares משתרע מן הפריפריה של המושבה נחיל ( איור 2 ).

הכנת V. parahaemolyticus תאים Swarmer עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להכין שקופיות agarose מיקרוסקופ ואת ההטבעה הבאים של התלקחויות מתלהטות על משטח agarose להשיג תאים swarmer יחיד למיקרוסקופ.

  1. כדי להכין שקופיות agarose עבור מיקרוסקופ, להוסיף 1 גרם של agarose ל 100 מ"ל של 20% כרך / כרך PBS ו 10% כרך / כרך פתרון LB מרק. בזהירות לרתיחה הפתרון במיקרוגל לפזר את agarose ולתת לו להתקרר ל 65-70 מעלות צלזיוס תוך ערבוב עם סטירר מגנטי.
  2. מקום acשקופית מיקרוסקופ רזה על החלק ברמה מושלמת של ספסל עבודה. מכסים את שני הקצוות של השקופית עם שתי שכבות של קלטת תיוג כללי תיוג, לתקן את השקופית לספסל העבודה. המרחק בין שתי חתיכות של סרט צריך להיות סביב 3 ס"מ.
    הערה: שתי שכבות של קלטת ליצור גובה קטן מאוד, אשר יקבע את גובה כרית agarose. חשוב כי שטח העבודה הוא ברמה כדי לוודא תאים יהיו באותו מטוס לניתוח מיקרוסקופי.
  3. Pipet ~ 250 μL של פתרון agarose מוכן בעבר על משטח זכוכית לא מכוסה.
  4. עכשיו במקום שקופית מיקרוסקופ השני באותו כיוון כמו התחתונה אחת על העליונה מעט ללחוץ אותו למטה, כך agarose שיורית יכול לזרום החוצה לצדדים.
  5. בואו agarose לחזק 1-2 דקות ואז לאט למשוך את השקופית זכוכית העליון את אחד התחתון בתנועה אופקי.
  6. באמצעות אזמל, לחתוך כל agarose שיורית המצורפתהצדדים של השקופית מיקרוסקופ לאט להסיר את הקלטת מקצוות השקופית מיקרוסקופ.
    הערה: שקופית agarose מוכן עכשיו יש להשתמש בהקדם האפשרי כפי שהוא יתחיל לאט להתייבש.
  7. כדי לבצע מיקרוסקופיה על תאים swarmer, לחתוך ~ 3 מ"מ x 10 מ"מ חתיכת אגר נחיל מן הקצה החיצוני ביותר של מושבה נחיל ( איור 1D ). חשוב מאוד לא לשבור את החותם של צלחת נחיל עד מיד לפני העברת תאים swarmer לשקופית מיקרוסקופ. לאחר שהסיר מוסר, תאי V. parahaemolyticus המתרחצים מתחילים ליזום את ההבחנה לתאי שחיינים.
    הערה: הקפד לכוון את הקיצוצים מבחוץ של קצה המושבה נחיל אל פנים המושבה ( איור 1D ). בדרך זו ניתן למנוע "זיהום שחיינים" לקצה המושבה נחיל.
  8. מעבירים את פיסת אגר נחיל על שקופית agarose מיקרוסקופ עם התאים מול אגרוז הרשותד ( איור 1E ). זה מדמה את התאים swarming על כרית agarose.
  9. לאחר המתנה ~ 30 s, להסיר את חתיכת אגר בזהירות מתוך כרית agarose ( איור 1F ).
  10. מניחים coverslip זכוכית על כרית agarose שבו התאים היו imprinted. התאים מוכנים כעת למיקרוסקופ.
    הערה: חשוב לתאי swarmer התמונה מיד, מאז תאים swarmer לאט לאט ליזום את ההבחנה למצב שחיין.

הכנת V. parahaemolyticus שחיין תא תרבויות עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי

הערה: סעיף זה של הפרוטוקול מתאר כיצד להכין תרבות של V. parahaemolyticus לבצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי על סוג שחין תא.

  1. לחסן כמות קטנה של תאים מקצה מושבה אחת לתוך 5 מ"ל של מרק LB. דגירה התרבות רועדת על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות או עד גידול תאים קל הופך גלוי.
  2. בְּבשלב זה, אם יש צורך, להוסיף גורם המניע ביטוי של חלבונים המעניינים. בדוגמה זו, L-arabinose נוספה לריכוז סופי של 0.2% (w / vol) כדי לעורר ביטוי של YFP-CheW 9 .
  3. דגירה תרבות רועד עבור 2 שעות נוספות ב 37 ° C.
  4. בצע את השלבים 3.1-3.7 כדי להכין שקופיות agarose מיקרוסקופית.
  5. נקודה 1 μL של תרבות תאים במרכז כרית agarose ולתת את הדגירה נקודה עד שהוא יבש.
  6. מניחים coverslip זכוכית על משטח agarose שבו התאים היו מנוקדים. התאים מוכנים כעת להיות צילמו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. ניתוח תמונה

חלק זה של הפרוטוקול מתאר זרימת עבודה לניתוח התמונה, במיוחד כיצד לחלץ נתונים הקרינה של תאים בודדים לניתוח הדמוגרפי.

  1. לפני תחילת ניתוח התמונה לוודא שכל התמונות מיקרוסקופ נשמרים בפורמט TIF 16bit.
  2. טען את DIC (או בניגוד שלב) ואת התמונות המתאימות ערוץ פלואורסצנטי לתוך התוכנה.
  3. צור תמונת שכבת על שני הערוצים על ידי בחירה באפשרות "תמונות תצוגה / שכבת על". הגדר את מספר התמונות ("# תמונות:") לשתיים, ובחר את התמונה DIC בערוץ הראשון ואת התמונה פלורסנט בערוץ השני.
  4. בחר את "Multi-Line" כלי מסרגל הכלים ואת סימון תאים מקוטב אחד לשני באמצעות באמצע התא. על מנת לקבל רשימה של כל השורות שנוצרו (אובייקטים קו) פתוח "למדוד / מדידות אזור". הגדר את מדידות האזור כדי להציג רק את תווית האזור, המרחק והעוצמה הממוצעת.
  5. כייל את גודל פיקסל תחת "למדוד / כיול מרחקים" לגודל פיקסל כי הוא ספציפי עבור הגדרת המיקרוסקופ שלך ולחץ על "החל על כל התמונות הפתוחות".
  6. העברת כל האזורים (אובייקטים קו) לתמונת הערוץ פלורסנט. תחת "אזורים / Transfבחר את תמונת המקור (תמונת השכבה) ואת תמונת היעד (תמונת הערוץ הניאון) בחר "כל האזורים" ולחץ על "אישור".
    הערה: כדי להיות מסוגל מאוחר יותר לייצר מחדש את השורות המדויקות (אובייקטים קו, אזורים, ROI), לפתוח "אזורים / שמור אזורים" ולשמור את האזורים.
  7. ייצא את כל המדידות באזור לגיליון אלקטרוני על ידי פתיחת "מדידות מדידה / אזור" ולחיצה על "פתח יומן". אשר כדי לפתוח ולייצא את הנתונים. לאחר הגיליון האלקטרוני נפתח ברקע, סוף סוף לייצא את הנתונים על ידי הקשה על "F9: יומן נתונים".
  8. כדי לקבוע את המיקום של מוקדי ניאון לאורך התא, פתח "מדוד / Linescan". הגדר "רוחב Linescan" לערך כך שכל רוחב התא יכוסה על ידי האזור שיצרת קודם לכן. לחץ לחיצה ימנית על גרף שורת הסריקה ובחר "הצג נתוני גרף". על ידי לחיצה שמאלית וגרירת העכבר- courser לאורך קו לסרוק אתנקודה של עניין, את "גרף נתונים" חלון יציג את המקביל פיקסל / המרחק בין שתי נקודות. בחר את השורה המסומנת כחול ולאחר מכן להעתיק את התוכן.
    הערה: כל פרופיל עוצמת הסריקה יכול להיות מחובר לגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על "התחבר לנתונים" בחלון "Linescan". הנתונים החילוץ יכול כעת לשמש להדמיה גרפים או ניתוח סטטיסטי נוסף. דפוסי לוקליזציה על מחזור התא יכול להיות דמיינו בקלות ייצוג דמוגרפי של אורך התא ואת עוצמות פלורסנט לאורך הגוף התא. ייצוגים אלה ניתנים להשגה באמצעות אותו החזר ROI שנבחר קודם לכן. השלבים הבאים ייתן דוגמה כיצד ליצור דמוגרפיה דומה לאלה שמוצג באיורים 3C ו 4C .
    1. ב פיג 'י / ImageJ לטעון אזור סימונים (.Rgn) שנוצר בעבר בתוכנה (שלב 5.6) באמצעות "Metamorph nd & ROI יבואנית קבצים"; לחלופין, אזורים של עניין (ROIs) של התאים להיות מנותח ניתן ליצור ישירות פיג 'י / ImageJ באמצעות לבנות ב- "Segmented Line" הכלי.
    2. פתח "ניתוח / כלים / החזר ROI" ולסמן את כל ערכי הרשימה הפעילה ".
    3. לאחר מכן, לחץ על "עוד / רב מגרש" ולאחר מכן בחר "רשימה" בחלון החדש "רב מגרש". לחץ על ערך טבלה, ולאחר מכן בחר "להעתיק הכל". לאחר מכן, הדבק לגיליון אלקטרוני חדש.
      הערה: ודא שהנתונים של התא הארוך ביותר (שני עמודות X ו- Y תואמות עם מספר השורות הרב ביותר) הוא האחרון מימין לגיליון האלקטרוני.
    4. שמור את הגיליון האלקטרוני כ- CSV (מופרד באמצעות פסיק) (* .csv).
    5. הורד את סקריפטים R מכאן "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10. התסריטים מיון תאים לפי אורך לנרמל את הפרופילים עוצמת פלורסנט של כל התאים כממוצע של fluorescenc של כל תאה.
    6. הפעל את התסריט כולו "פרופילים תאים function.R" ב R [גרסה 3.0.1; 11 ].
    7. ערוך את התסריט "לדוגמה plots.R" בקו 30 כך שבנתיב הקובץ מתייחס לתיקייה שבה נשמר קובץ ה- CSV שנוצר. בנוסף, שנה את שם הקובץ "profile.csv" בשורה 31 לשם הקובץ שנבחר עבור קובץ .csv שנוצר בשלב 5.9.4. לאחר מכן, להפעיל "plots.R לדוגמה" ופעל בתיעוד מ "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles", כמו גם את ההערות של קובץ סקריפט כדי ליצור ניתוח דמוגרפי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אינדוקציה של בידול ודור של מושבות נחפזות

איור 1 מספק סכימה של השלבים החשובים מעורב בהפקת מושבות נחיל של V. parahaemolyticus ( איור 1A-C ). תרבות שחיינים זוהה על נחיל אגר ו מודגרות על 24 מעלות צלזיוס, גרימת הבדל swarmer והתפשטות על פני השטח אגר מוצק. בתמונה מס '2 מוצג תמונה סטריאו-מיקרוסקופית מייצגת של מושבה מתרפסת. הדמיה סטריאו מיקרוסקופית מראה בבירור sparm-flares משתרע החוצה של נחיל המושבה פריפריה. הגדלה גבוהה מגלה כי בתאי נפיחות נחילים מקובצים בשכבות חד-שכבתיות בלבד, ואילו באמצע תאי הנחיל-מושבה נערמים בשכבות מרובות ( איור 2 א ). נחילי- flares יכול בקלות להיות מועבר (כמתואר בשלבים 3.8-3.11, איור 2 ב ). זה בניגוד לתאים מאמצע נחיל המושבה, אשר קצרים באופן משמעותי, סביר להניח מייצגים תערובת של שחיינים ותאים swarmer ( איור 2 ב ) 9 . יתר על כן, העברה זהירה של התלקחות לשקופית המיקרוסקופ משאירה את המבנה הכללי ואת נחיל הקצה של התלקחות נחיל שלם, וכתוצאה מכך שכבת מונו של תאים swarmer נגיש עבור מיקרוסקופ תא בודד. בעת הטבעה של זיקוקים על שקופיות המיקרוסקופ, חשוב מאוד לעשות את ההעברה עדין ככל האפשר ולא להוסיף יותר מדי לחץ - אחרת תאים התנפחות- swarm יתפשט על השקופית ערבוב עם תאים שאינם swarmer שמקורם באמצע מושבת הנחילים.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניתוח תמונה

V. הפרמיה נבדלת V. parahaemolyticus שחיינית ותאי swarmer , ניתוח מפורט של efactopically לידי ביטוי YFP-CheW בוצע. CHW הוא חלבון chemotaxis חיוני והוא יכול לשמש סמן עבור לוקליזציה תאיים של מערכים איתות chemotactic 9 , 12 . קידוד פלסמיד YFP-CheW תחת האמרגן L-arabinose inducible היה electroporated לתוך V. parahaemolyticus כמתואר בסעיף 1 של הפרוטוקול. עבור מיקרוסקופיה, שחיין ותאים swarmer היו מוכנים כמתואר בסעיפים 4 ו -3 בהתאמה. כפי שתואר לעיל YFP-CheW היה מקומי ב חד קוטבית ( איור 3 א , חצים אדומים) ו דו קוטבית בצורה ( איור 3 א , חצים צהובים) 12 , 13 . לפיכך, זיהוי של תא התא aד וריאציה של YFP חלבונים לוקליזציה באורכים שונים מציעים תובנה גדולה כיצד דפוס לוקליזציה evolves כמו מחזור מחזור התא. נתונים אלה לאחר מכן ניתן להציג בחלקים פיזור בקורלציה המשתנים "אורך התא" ו "המרחק של מוקדים לעמוד התא" (איור 3 ב). כדי למנוע אי-ודאות בזיהוי גובה, אשר נפוץ בעת שימוש בכלים אוטומטיים לזיהוי תאים, התאים נבחרים באמצעות ציור ידני של שורה מקוטב אחד לאחר באמצעות האפשרות "Multi-line" ב- MetaMorph או "Line Segmented" קוד פתוח פלטפורמת ImageJ. לאחר מכן, את הפרופילים אינטנסיביות של האזור הנבחר של עניין (ROI) ניתן לאסוף, המאפשר זיהוי של הנקודה שבה YFP חלבון המוצג בעוצמה הגבוהה ביותר שלה גם את אורך הכולל של התא. פרופילים הקרינה של תאים בודדים נותחו כמתואר בסעיף 5 והוצגו על ידי זומם את המרחק של מוקדים לתאי התאכפונקציה של אורך התא ( איור 3 ב ). ניתוח זה מראה בבירור כי תאים קצרים רק להציג תבנית לוקלי חד קוטבית של YFP-CheW, ואילו בתאים ארוכים YFP-CheW הוא דו קוטבי מקומי. יתר על כן, דפוסי לוקליזציה על מחזור התא ניתן לדמיין בקלות ייצוג דמוגרפי של אורך התא ואת עוצמות פלואורסצנט לאורך הגוף התא. ייצוגים אלה ניתן להשיג באמצעות ROIs אותו נבחר בעבר בעת הכנת מגרשים פיזור. לפיכך, ניתוח דמוגרפי של פרופיל פלואורסצנטי כולו הסלולר כמתואר בשלב 5.9 ( איור 3 ג ) בוצע. ניתוח זה מראה בבירור דפוס דומה של לוקליזציה YFP-CheW, עם YFP-CheW להיות uni-polarly מקומי בתאים קצר bi-polarly מקומי בתאים ארוכים יותר. לפיכך, המציין תא מחזור תלוי לוקליזציה, שבו YFP-CheW הוא מקומי Uni- פולארלי בתאי מחולק לאחרונה (קצר), ולאחר מכן מקבל rוגורמים לקוטב הנגדי מאוחר יותר במחזור התא (תאים ארוכים), וכתוצאה מכך לוקליזציה דו קוטבית. ניתוח אנלוגי בוצע על תאים swarmer ( איור 4 ). ניתוח מבוסס אוכלוסיה מראה הבדלים גדולים לוקליזציה של YFP-CheW בתאים swarmer בהשוואה לזה של סוג שחין תא. YFP-CheW הוא תמיד דו קוטבית מקומי ( איור 4 א , חצים צהובים) וחשוב YFP-CheW גם צורות אשכולות ממוקם באופן אקראי לאורך אורך התא ( איור 4A , חצים כתומים). לפיכך, ישנם שינויים משמעותיים לוקליזציה תאיים של chemotaxis איתות מערכים במהלך בידול של V. parahaemolyticus . דוגמה זו מראה כי השיטה המתוארת מאפשרת הפקה של האוכלוסייה התא swarmer כי הוא זמין בקלות עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא בודד. יתר על כן, הוא מראה כי צינור המתואר לניתוח תמונה מאפשר ניתוח דמוגרפי של הארגון תאייםTion של V. parahaemolyticus תאים swarmer .

איור 1
איור 1: השראה של הבדל Swarmer והכנת תאים עבור דימות מיקרוסקופיה. הדמיה פשוטה של ​​זרימת העבודה לייצר תאים V. parahaemolyticus swarmer ואת הכנת שקופיות מיקרוסקופ לניתוח מיקרוסקופיה של תאים יחיד swarmer. ( א ) נקודה 1 μL של OD 600 = 0.8 התרבות תאים של V. parahaemolyticus במרכז צלחת אגר HI אגר. ( ב ) לדגור את המקום עד שהוא מיובש ותאים מחוברים למשטח אגר. ( ג ) חותם את צלחת פטרי עם קלטת ברורה. דגירה את הצלחת על 24 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. ( ד ) בזהירות הבלו חתיכה קטנה של אגר HI מן הקצה החיצוני של המושבה נחיל. ( ה ) להעביר את החתך על micrOscopy כרית agarose עם תאים swarmer מול כרית agarose. לאחר זמן הדגירה קצר של 30 s התאים swarmer הם imprinted על משטח agarose. ( F ) בזהירות להסיר אגר נכרת מן כרית agarose ומקום coverslip מיקרוסקופית על גבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור מס '2: ארגון התאים במושבה התוססת V. Parahaemolyticus . ( A ) מיקרוסקופיה סטריאו של מושבה V. parahaemolyticus נחיל . לוחות העליון להציג את הקצה החיצוני של המושבה נחיל הגדלת ההגדלה. הפאנלים התחתונים מציגים שטח של המושבה המתנחשלת בין המרכז לקצה הגדלת ההגדלה. התנפחות נחילים מתרחבת מהפריפריה שלמושבת הנחילים. ( B ) נציג תמונות מיקרוסקופיה DIC של קצה המושבה swarmer (פאנל העליון) ואזור בין המרכז לפריפריה (הפאנל התחתון) לאחר העברת תאים מן המקומות המתאימים של המושבה נחיל. את נחילי- flares היו imprinted ישירות על משטח מיקרוסקופי agarose כמתואר בשלבים 3.8-3.11. תאים מן האזור שבין המרכז לפריפריה הורדו תחילה מהמושבה נחיל מחדש מושעה מרק LB, לפני שנצפתה על משטח מיקרוסקופ agarose. קנה מידה בר = 7.5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: לוקליזציה של מערכים Chemotaxis בתאי שחיינים של V. parahaemolyticus. ( א ) DIC ו תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של wild-type V. parahaemolyticus תאים שחיינים ectopically להביע YFP-CheW. ( B ) גרף המציג YFP-CheW הפצה foci על ידי זומם את המרחק של מוקדים מקטבים התא כפונקציה של אורך התא בשחיינים תאים. ( ג ) ניתוח דמוגרפי של פרופילים עוצמת הקרינה של V. parahaemolyticus תאים שחיינים להביע YFP-CheW. תאים ממוינים לפי אורך התא ומציגים עוצמת פלואורסצנטי יחסית. סולם בר = 5 מיקרומטר. לוח B ו- C מותאמים מהתייחסות 9 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: לוקליזציה של מערכי Chemotaxis בתאי Swarmer של V. parahaemolyticus. A ) DIC ותמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של wild-type V. parahaemolyticus תאים swarmer ectopically להביע YFP-CheW. ( ב ) גרף המציג YFP-CheW הפצה foci על ידי זומם את המרחק של מוקדים מקטבים התא כפונקציה של אורך התא בתאי swarmer. ( ג ) ניתוח דמוגרפי של פרופילים עוצמת הקרינה של תאים V. parahaemolyticus swarmer להביע YFP-CheW. תאים ממוינים לפי אורך התא ולהציג עוצמת פלואורסצנטי יחסית. סולם בר = 5 מיקרומטר. לוח B ו- C מותאמים מ -9 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מדווח על שיטת הדמיה מיקרוסקופית של תאים V. parahaemolyticus swarmer , ואחריו מנתח במורד המיועד לפתור לכמת את לוקליזציה subcellular ותכונות אחרות של חלבונים שנחקרו fluorescently שכותרתו. למרות מספר כלים קיימים לעיבוד תמונה מיקרוסקופית וניתוח 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , ניתוח של תאים בתאי V. parahaemolyticus נשאר מאתגר בעיקר משום שהם בדרך כלל קיימים בתוך קהילה תא דחוס ויש וריאציה גבוהה באורך התא ( איור 2 ). לכן, זיהוי תא אוטומטי הוא לפעמים פגום, ולכן התוצאות לא מהימן במקצת. פרוטוקול זה מתאר צינור שנועד לגדול, התמונה ולנתח תאים swarming של V. parahaemolyticus , אשר מותאם לפי המפרטIfic הצרכים של תאים אלה, כגון סביבת צמיחה מבוקרת על פני השטח ומנתח התמונה מנתח כי להכיל את נוכחותם של תאים באורכים משתנה אשר לגדול בסמיכות.

היכולת ectopically לבטא חלבון של עניין מ פלסמיד יכול להיות חשוב עבור מספר ניסויים, למשל ביטוי של חלבונים שכותרתו fluorescently למחקרים מיקרוסקופיה או השלמה של מחיקות גנים. כאן תהליך הכנת תאים המוסמכים כימית electroporation של ה- DNA פלסמיד לתוך V. parahaemolyticus מתואר גם. היתרון של electroporation על הצמידה, אשר משמש לעתים קרובות V. parahaemolyticus , היא כי עמוד השדרה פלסמיד לא צריך להיות שונה כדי לאפשר הצמידה. עם זאת, יש לנקוט אמצעי זהירות מסוימים; כמתואר בשלב 1.2, חשוב מאוד להגיע צפיפות התא של OD 600 = 1.0. ב התחתון צפיפויות אופטי תאים יהיה lyse על electroporatiעל ובצפיפות גבוהה יותר פלסמיד הוא לא נלקח על ידי התאים. יתר על כן, צנטריפוגה קשה מדי של תאים V. parahaemolyticus (צעדים 1.4-1.6) יהיה להפחית באופן דרסטי את יעילות electroporation. כמו כן חשוב לחזור בזהירות להשעות את תא גלולה במהלך השלבים כביסה לייצר תאים אלקטרו מוכשר.

למרות הכנה של תרבות התא נשמע טריוויאלי, צפיפות תרבות חשוב מאוד עבור הביצועים swarming. בדרך כלל, תרבות התא בשלב מוקדם של צמיחה מעריכית (OD 600 <0.5) תייצר מושבה נחילה גדולה יותר במהלך הדגירה לילה מאשר תרבות בשלב מאוחר מעריכי או בשלב נייח. בהתאם לניסוי, מושבה נחילה גדול עשוי להיות מועיל. עם זאת, כדי להשוות הרחבת המושבה המורפולוגיה בין זנים שונים גדל על צלחת HAR אגר זהה HI, חשוב שיהיה מספיק מקום פנוי בין מושבות נחיל הפרט. זה יכול להיות כואבנמדד על ידי זיהוי תרבות התא של צפיפות אופטית גבוהה אשר בדרך כלל התוצאה מושבות נחיל קטן.

אינדוקציה של פנוטיפ נחיל משתנה באופן משמעותי בין מינים חיידקים ואת reproducibility זה מושפע מאוד גורמים כגון אגר הרכב התזונתי, טמפרטורת הסביבה, ואת תכולת הלחות של שני הסביבה ואת המדיום הצמיחה. כתוצאה מכך, שינויים קלים בפרוטוקול הסביבה החיצונית להשפיע באופן משמעותי על תוצאות assay נחיל אינדוקציה של בידול swarmer. פרוטוקולים להזרמת מינים חיידקיים אחרים כגון Pseudomonas aeruginosa ו- Bacillus subtilis דווחו 19 . השלבים המתוארים בפרוטוקול זה יהיה אמין לייצר את סוג התא swarmer של V. parahaemolyticus ולשמור אותם בצורה של מושבות swarming המייצרים יחיד מתנשא התפרצויות בשולי המושבה. כדי לבצע יציבה וניסויים לשחזור על סוג תא swarmer של V. parahaemolyticus , הכנת הצלחות אגר HI נחיל הוא החלק החשוב ביותר של פרוטוקול זה. במיוחד, שלב הייבוש עשוי לדרוש אופטימיזציה, כמו כל חממה יבצע אחרת. גורם נוסף שיכול להשפיע התנהגות swarming הוא סוג של פלסטיק המשמש בצלחות פטרי. מנות פטרי טיפוסי המשמש במעבדה שלנו לבצע ניסויים נחיל עשויים פוליסטירן (PS). עם זאת, באמצעות צלחות פטרי עשוי פוליאתילן בצפיפות נמוכה (PE LD) מיוצר תוצאות מעורבות מבחני נחיל. זה חיוני כדי לעקוב אחר הצעדים המתוארים, כי רק מושבות נחילה לשחזור מכן המציגים היווצרות אבוקה נפרדת היקפיים יהוו, המאפשרים מיקרוסקופ יחיד swarmer התא.

אין ספק, גישות שונות ניתן לנקוט כדי להציג את התוצאות שניתנו על ידי מחקרים מיקרוסקופ פלואורסצנטי של V. parahaemolyticus התאים swarming. עבור instancE, את תוכנית בשימוש נרחב MicrobeTracker 16 מייצג חלופה מתקבלת על הדעת. לאחרונה זמין MicrobeTracker יישום Oufti 20 , אשר אינו דורש MATLAB, היא גם חלופה אחרת. עם זאת, השימוש דיפרנציאלי ממשק בניגוד (DIC) תמונות אינו אפשרי Oufti, ו בניגוד הדמיה בניגוד אינו מתאים להבחין פילוח התא בתאי swarmer. יתר על כן, לא כל המיקרוסקופים מצוידים הדמיה בניגוד שלב ו בתורו הדמיה בניגוד שלב אינו מתאים לכל מיני סוגים של ניתוח מיקרוסקופיה. עוד כלי מבטיח, שהוא חופשי ו ImageJ מבוססי, הוא MicrobeJ 17 , אבל שוב רק ניגודיות פאזה ותמונות ניאון ניתן להשתמש. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר רק הדמיה וניתוח של תאים בנקודות זמן ספציפיות של מחזור החיים שלהם. עם זאת, פרוטוקול מעולה המתאר זמן לשגות הדמיה ואת ניתוח התמונה הבאים, אשר מאפשר הבא יחידמסלולים תא דינמיקה חלבון 21 סביר להניח גם להחיל V. parahaemolyticus .

בעקבות הצעדים המתוארים בפרוטוקול זה יאפשר למדענים לבצע אמין מחדש reducible תא בודד תא פלואורסצנטי על השחיין וגם ניב סוג התא של V. parahaemolyticus . פרוטוקול זה מפרט דרך חזקה להפוך V. parahaemolyticus מן השחיינית שלה לתוך סוג התאים swarmer שלה. על ידי הטבעה monolayer של תאים swarmer מן ההתלקחויות ההיקפיים של מושבות נחפז על משטח agarose, לוקליזציה תאיים של חלבונים ניתן לצפות, צינור לניתוח התמונה יכול להיות מיושם ככל הנראה על מיני חיידקים אחרים הקיימים בקהילות חיידקי שבו תאים לגדול ב קרבה רבה ומצבים שבהם ניתוח תמונות אוטומטי לא יכול להיות יתרון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

שום ניגוד אינטרסים לא הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מקס פלאנק החברה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media components
LB medium Roth X968.3
Difco Agar, granulated BD 214510 For preparation of LB agar with LB medium
Difco Heart Infusion Agar BD 244400 For preparation of HI agar swarming plates
Agarose NEEO, ultra quality Roth 2267.3 For preparation of microscopy agarose pads
Name Company Catalog Number Comments
Additives
L-arabinose Roth 5118.3 Used to induce pBAD derivatives
2,2`-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305-25G For preparation of HI agar swarming plates
Calcium chloride dihydrate Roth 5239.1 For preparation of HI agar swarming plates
Ampicillin sodium salt Roth K029.3
Chloramphenicol Roth 3886.3
PBS buffer - - Standard recipe for Phosphate-buffered saline
D(+) Sucrose Roth 4621.1 For preparation of electrocompetent cells
Glycerol Roth 3783.5 For preparation of electrocompetent cells
Name Company Catalog Number Comments
Hardware
Petri dish 150 mm x 20 mm with cams Sarstedt 82.1184.500 For preparation of HI agar swarming plates
kelvitron t (B 6420) Heraeus - Used for drying HI agar swarming plates
Gene Pulser Xcell Microbial System BioRad 1652662 Used for elctroporation of plasmid DNA
Name Company Catalog Number Comments
Software
MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) Molecular Devices - Used for microscopy image analysis
Excel Microsoft - Used for microscopy data analsis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
  2. Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
  3. Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
  4. Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
  5. Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
  6. Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
  7. McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
  8. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
  9. Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
  10. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
  11. Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
  12. Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
  13. Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
  14. Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
  15. Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  16. Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
  17. Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
  18. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
  19. Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
  20. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
  21. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).

Tags

אימונולוגיה גליון 123, מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתוח תא בודד הבחנה נחיל שחייה לוקליזציה חלבון
אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; שחיין ותאי נחיל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heering, J., Alvarado, A.,… More

Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells. J. Vis. Exp. (123), e55842, doi:10.3791/55842 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter