Summary
Bu protokol, farklı olarak farklı Vibrio parahaemolyticus yüzücü ve swarmer hücrelerinin tek hücreli mikroskobu sağlar. Yöntem, tek hücreli analiz için kolayca bulunabilen bir swarmer hücreleri popülasyonu üretir ve hücre kültürlerinin hazırlanmasını, swarmer farklılaşmasının indüksiyonunu, numunenin hazırlanmasını ve görüntü analizini kapsar.
Abstract
Proteinlerin hücre içi lokalizasyonunu inceleme kabiliyeti birçok hücresel sürecin anlaşılması için gereklidir. Buna karşılık, bu, bakteri toplulukları içinde varolan hücreleri görüntülerken özellikle zorlayıcı olabilen floresan mikroskopisi için tekli hücreler elde etme yeteneğini gerektirir. Örneğin, insan patojeni Vibrio parahaemolyticus sıvı koşullar altında kısa çubuk şeklindeki yüzücü hücreler olarak bulunur ve yüzey teması üzerine katı yüzeyler üzerinde büyümek için uzmanlaşmış oldukça genişlemiş swarmer hücrelerin bir alt popülasyonuna ayrılır. Bu yazıda V. parahaemolyticus'un iki farklı durumundaki tek hücreli floresans mikroskobu analizini gerçekleştirmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, V. parahaemolyticus'un daha canlı bir hücre yaşam döngüsüne çok reproducibly farklılaşmasına neden olur ve katı yüzeyler üzerindeki proliferasyonunu kolaylaştırır. Metod, t lekelerinden uzanan farklı swarmer hücrelerinin fişeklerini üretir.O sürü koloni kenarında. Özellikle, sürü alevlerinin ucunda, daha sürükleyici hücreler, tek bir hücrenin katmanında bulunur; bu da, bir mikroskop lamına kolay aktarılmalarına ve daha sonra tek hücrelerin izlenmesi için flüoresans mikroskobu görüntülemelerine olanak tanır. Ek olarak, bakteri toplumlarının demografik temsili için görüntü analizinin iş akışı sunulmaktadır. Prensip olarak, V. parahaemolyticus'un yüzücü ve swarmer hücrelerindeki kemotaksis sinyal dizilerinin hücre içi lokalizasyonunun analizi açıklanmaktadır.
Introduction
Bakteriler sürekli olarak dış ortamlarında değişiklikler yaşarlar ve davranışlarını buna göre değiştirmek ve uyarlamak için çeşitli teknikler geliştirdiler. Böyle bir mekanizma, değişen çevreyi daha iyi tamamlayan farklı hücre türlerine farklılaşmayı içerir. Farklılaşma çoğunlukla hücre döngüsünün düzenlenmesinde, hücre morfolojisindeki ve hücrelerin zamansal organizasyonunda büyük değişiklikler içerir. Farklılaşabilen bir organizma Vibrio parahaemolyticus'tur . V. parahaemolyticus genellikle taze veya tuzlu suda yaşayan bir proteobakteriler ailesi olan Vibrionaceae'ye aittir. Vibrionaceae , çevrede yaygın olarak bulunur ve insanlarda bağırsak yolları enfeksiyonlarına neden olan çeşitli türleri içerir; ayrıca Vibrio cholerae.V de dahildir. Parahaemolyticus dimorfik bir organizmadır ve değişikliklere uyum sağlamak için iki farklı hücre tipine cevap olarak cevap verebilirDış çevre. Sulu ortamlarda, eski hücre direğine yerleştirilmiş tek bir polar flagellum ile kısa çubuk şeklinde bir yüzücü hücre bulunur. Yüzey teması üzerine, daha yapışkan bir hücrede farklılaşma tetiklenir. Swarmer hücre farklılaşması iki önemli değişiklik içerir: hücre bölünmesinin önlenmesi yoluyla swarmer hücre morfogenezi ve ikinci bir flagella sisteminin indüksiyonu. Bu, bölünmüş olayların döl hücreleri hücrelerinde sonuçlandığı veya alternatif olarak yüzücüler hücrelerine geri dönüştürebildiği, kiraz yaşam biçimine devam edebilen, peritrik ve oldukça uzatılmış uzunlamasına çubuk şeklinde bir swarmer hücresinin oluşumuyla sonuçlanır.
Swarmer farklılaşmasını başlatan veya etkileyen çeşitli faktörlerin bildirildiği bildirilmiştir. Birincil uyarı, V. parahaemolyticus'un , polar lekeliği, yüzey temasında rotasyonun inhibisyonunu tespit eden bir dokunmatik sensör olarak kullandığı mekanosensing tarafından yönlendirilir gibi görünür; ancak, diğer birçok faktör,Iyi 1 . Laboratuarda, polar flagellumun dönüşü, sodyum kanalına bağlı bayraker rotasyonunu bloke eden fenamil ilavesiyle yapay olarak inhibe edilebilmekte ve böylelikle swarmer diferansiyasyonunu indükleyebilmektedir 2 . Ayrıca, daha önceki bir çalışmada, hücreler berrak plastik bantlarla mühürlenmiş bir Petri kabı içindeki büyüme ortamı üzerinde çoğaldığında Vibrio alginolyticus , katı medyada sürüklenmeye teşvik edildi. Alkali doymuş filtre kağıdı, bu koşullar altında yığılmayı engelledi ve bu nedenle, bir veya daha fazla uçucu asitin, kınlama indüksiyonunda rol oynayabileceğini düşündürdü. Böylece, Petri kabını plastik bant ile sızdırmazlık, plakanın baş alanı içinde, hücresel metabolizmanın yan ürünleri olarak oluşan uçucu asitlerin birikmesine muhtemelen izin verdi. Aynı etki, ortam bileşenlerini hidrolize ederek yapay olarak uçucu asitler üretmek için H2O2 büyütülmüş ortama yapıştırılmamış Petri kaplarında ilave edildiğinde elde edilmiştir
V. parahaemolyticus farklılaşması, hücre bölünmesinin düzenlenmesinde, hücresel morfolojide ve flagell gibi makromoleküler makinelerin konumlandırılmasında büyük değişiklikler içerirA ve kemotaks aparatları - bunların hepsi, proteinlerin hücre döngüsüne göre spesifik lokalizasyonunu gerektiren süreçler. Dolayısıyla, bu proteinlerin hücre içi lokalizasyonunu inceleme kabiliyeti, yukarıda sözü edilen hücresel süreçlerin anlaşılması için gereklidir. Bu tür çalışmaları yapmak için tekli hücrelerde flüoresan mikroskobu gereklidir. Swarmer hücrelerinde olduğu gibi, yoğun bakteri popülasyonlarında bulunan hücreleri görüntülerken bu özellikle zorlayıcı olabilir. Mikroskopi çalışmaları için potansiyel olarak tek hücreler üretebilen sıvı ortamda swarmer farklılaşmasına neden olan girişimler yapılmıştır. Transkripsiyonel bir seviyede bu hücreler kısmen swarmer-differentiation programını başlatmış olsalar da, katı ortam 8 üzerinde yetiştirilen tam olarak ayırt edilmiş swarmer hücreleri gibi aynı morfolojik değişikliklere maruz kalmazlar. Bu makale, swarmer ce'yi indüklemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır.Bir agar yüzeyinde farklılaşma. Protokol, tek hücreli mikroskopi ve takip eden analiz için kolaylıkla erişilebilen bir swarmer hücreleri popülasyonu hazırlar. Ayrıca, protokol hem yüzücü hem de swarmer hücre türlerinde (bölüm 1, 2, 3, 4) floresan etiketli proteinlerin yerini belirleme çalışmalarını mümkün kılar. Ek olarak, protokol, bakteri toplumlarının demografik analizine olanak tanıyan flüoresan mikroskopi deneylerinden elde edilen verilerin nasıl işleneceği ve analiz edileceği üzerine sonraki iş akışını tanımlamaktadır (bölüm 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elektro-yetkili V. parahaemolyticus Hücrelerinin Hazırlanması ve Plasmid DNA'nın Yüzücü Hücrelere Elektroporasyonu
NOT: Protokolün aşağıdaki bölümü, elektro-yetkili hücrelerin hazırlanmasına ve ardından plazmid DNA'nın yüzücüler hücrelerine elektroporasyonuna olanak tanır. Floresan proteinler bir plasmidden ektopik olarak eksprese ediliyorsa, bu adım önemlidir.
- V. parahaemolyticus hücrelerini -80 ° C gliserol stoğundan, 100 μg / mL ampisilin ihtiva eden taze bir LB agar plakasına çekin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, tek bir V. parahaemolyticus koloni ile 200 mL LB besiyeri inoküle edin ve 0. 600'lük bir OD 600 ulaşana kadar çalkalama koşullarında 37 ° C'de inkübe edin. Hücre kültürünün arzulanan optik yoğunluğa erişmesi genellikle 5-6 saat inkübasyon gerektirir.
- Hücreleri derhal buz ve çevreye aktarınBuz üzerindeki ve 4 ° C'lik ön soğutmalı santrifüjlerdeki diğer tüm adımları izleyin.
- Hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'de hasat edin.
- Süpernatantı boşaltma ile atın ve buz püskürtülmüş 273 mM sükroz çözeltisinin (pH 7.4, KOH ile tamponlanmış) 25 mL'de hücre peletini yeniden askıya alın.
- Hücreleri yeniden 4 ° C'de 10 dakika 2000 x g'de hasat edin. İki kez daha tekrarlayın.
- Yıkanmış hücre topağını buz soğukluğunda 273 mM sükroz çözeltisinin 400 μL'sinde yeniden süspanse edin. Ardından, gliserolü% 15 hacim / hacim bir nihai konsantrasyona ilave edin. Hücreler elektroporasyona hazırdır, ancak daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de 70 μL'lik bölümler halinde dondurulabilir.
- Elektroporasyon için, elektro-yetkili hücrelerin 70 uL'lik bir bölümünü 100 - 1,000 ng plazmid DNA'yla karıştırın ve karışımı buz gibi bir elektroporasyon küvetine (0.2 cm elektrot boşluğu) aktarın. Aşağıdaki ayarlarla elektroporasyon yapın: 25 μF, 2400 V ve 200 Ω.
- Askıya alHücrelerini elektroporasyon küvetinde 600 μL LB suyu, 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve 37 ° C'de 3 saat çalkalarken inkübe edin.
- 5 dakika süreyle 2,000 xg'de hücreleri aşağı döndürün ve pelet 100 mcL LB suyu içinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu gerekli antibiyotikleri içeren seçici LB agar plakalarına yayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, plakaları koloni oluşumu açısından kontrol edin. Büyümüş olan koloni, plazmit üzerinde kodlanmış doğru antibiyotik direnç genini taşır ve şimdi daha ileri deneyler için kullanılabilir.
2. Swarmer Hücre Farklılaşmasının Teşvik Edilmesi
NOT: Aşağıdaki adımlar, V. parahaemolyticus'un daha yaşlı hücre yaşam döngüsüne nasıl farklılaştıracağını ve katı yüzeylerde proliferasyonun nasıl uyarılabileceğini açıklar.
- 4 gr kalp infüzyonu (HI) Agar'ı 100 ml ddH2O içinde askıya alıp kuyruk plakalarını hazırlayın.
- Mikrodalga fırında HI agar solüsyonunu dikkatlice kaynatın ve toz çözülene kadar şişeyi sık sık çalkalayın. Otoklav, 121 ° C'de 20 dakika süreyle.
- Otoklavdan sonra, HI agarını 60-65 ° C'ye soğutun. Nihai bir konsantrasyona 50 uM (% 100 etanol içinde 50 mM stok çözeltisi) olan 2,2'-Bipiridil ekleyin. CaCl2'yi son konsantrasyon 4 mM'ye ekleyin (ddH20 içinde 4 M stok solüsyonu). Gerekirse plazmidleri korumak için çözeltiye antibiyotik ekleyin.
NOT: İndüklenebilir bir plazmid kullanmayı planlıyorsanız, nihai konsantrasyonuna indükleyici ajan ekleyin.
DİKKAT: 2,2'-Bipiridil: Akut toksisite (oral, dermal, inhalasyon). Bu kimyasalla çalışırken eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. - 30 - 35 mL son HI agar solüsyonunu 150 mm'lik yuvarlak bir petri kabına dökün ve agarın katılaşmasına izin verin.
- Hücre kültürünü tespit etmeden hemen önce, agar plakasını 37 ° C'de en az 10 dakika boyunca kurutun (veya herhangi bir sıvı tortunun zedelenmesine kadar)Sağduyulu, fakat artık) sağ-açık ve açık bir kapaklı.
NOT: Kuruma süreleri kullanılan kuluçka makinesine büyük ölçüde bağlıdır ve ağır kurutulmuş plakalar V. parahaemolyticus'un toplanmasına izin vermez. (Bu adım çok önemlidir!) Tabaklar taze kullanılmalıdır ve 2 - 3 saatten eski olmamalıdır. Eski plakalar, sürülmeyi teşvik etmek için çok kuru olacaklardır. - Tek bir koloni kenarından az miktarda hücre 5 mL LB suyu içine inoküle edin. OD 600 = 0.8 olana kadar kültürü 37 ° C'de çalkalayarak inkübe edin, genellikle 2-3 saat sürer. Bundan sonra, hücreler HI swarming agar plakaları üzerinde lekelenmeye hazırdır.
- HI agar swarming plakasının merkezinde 1 μL hücre kültürü yapın ( Şekil 1A ).
- Durun noktasını açın ( Şekil 1B ).
- Plakayı şeffaf plastik bantla kapatın ve sıkıca tutturulduğundan emin olun, aksi takdirde gece kuluçka sırasında ayırın ( Şekil 1C ).
NOT: ÖyleMühürün mükemmel olması çok önemlidir. Kabarcık oluşumundan kaçının ve uygulandığında banda katlanır. - Plakayı gece boyunca 24 ° C'de inkübe edin. Bu, sürü kolonisinin çevresinden uzanan sürü alevleri olan bir V. parahaemolyticus sürü kolonisinin oluşmasına neden olacaktır ( Şekil 2 ).
3. Flüoresan Mikroskopisi için V. parahaemolyticus Swarmer Hücrelerinin Hazırlanması
NOT: Aşağıdaki protokol, mikroskopi için tekli swarmer hücreleri elde etmek için mikroskopik agaroz slaytlarının hazırlanması ve ardından bir agaroz pedinin üzerine sürükleyici fişeklerin basılması işlemini anlatmaktadır.
- Mikroskopi için agaroz slaytlar hazırlamak için,% 20 hacim / hacim PBS ve% 10 hacim / hacim LB çorba solüsyonu 100 mL'ye 1 g agaroz ekleyin. Mikrodalga içindeki çözeltiyi özenle kaynatın ve agarozu çözün ve bir manyetik karıştırıcı ile karıştırırken 65-70 ° C'ye soğumasını bekleyin.
- Ac yerleştirYalın mikroskop lamı, çalışma tezgahının mükemmel seviyede bir bölümüne kaydırın. Sürgüyü iki ucunu genel amaçlı laboratuar etiketleme bandı ile örtün ve slaydı çalışma tezgahına sabitleyin. İki bant arasındaki mesafe yaklaşık 3 cm olmalıdır.
NOT: İki bant katman, agaroz pedinin yüksekliğini belirleyecek çok küçük bir yükseklik oluşturur. Hücrelerin mikroskopi analizleri için aynı düzlemde olmasını sağlamak için çalışma alanının düz olması önemlidir. - Pipet Kaplanmamış cam yüzey üzerine ~ 250 uL önceden hazırlanmış agaroz çözeltisi.
- Şimdi, ikinci bir mikroskop slaydı üstteki alttaki ile aynı yönde yerleştirin ve hafifçe bastırın, böylece artık agaroz yanlara akabilir.
- Agaroz 1-2 dakika katılaşır ve daha sonra yatay bir hareketle alttaki cam slaytını yavaş yavaş çekin.
- Bir neşter kullanarak, içine herhangi bir kalıntı agarozMikroskop kaydırın ve yavaş yavaş mikroskop lamı uçlarından bandı çıkarın.
NOT: Agaroz slayt hazırdır ve mümkün olduğunca çabuk kullanılmalıdır, çünkü yavaşça kurumaya başlar. - Swarmer hücreleri mikroskopi yapmak için, bir swarming koloni ( Şekil 1D ) en dış kenarından ağlayan bir agar ~ 3 mm x 10 mm parçası kesin. Swarmer hücrelerinin mikroskop lamına aktarılmasından hemen önce, kütük plakasının bant sızdırmazlığını kesmemeniz çok önemlidir. Bant kaldırıldıktan sonra, V. parahaemolyticus hücrelerini toplayıp yüzücüler hücrelerine farklılaşmaya başlarlar.
NOT: Kesiklikleri, gagalama koloni kenarının dışından koloninin içine doğru yönlendirdiğinizden emin olun ( Şekil 1D ). Bu şekilde, yüzen koloni kenarına "yüzücü kirlenmesini" önleyebilirsiniz. - Agaroz pa bakan hücreleri ile bir mikroskop agaroz slayt swarming agar parçası aktarınD ( Şekil 1E ). Bu, agaroz pedine kınan hücreleri basar.
- 30 saniye bekledikten sonra, agar parçasını agaroz pedinden dikkatle çıkarın ( Şekil 1F ).
- Hücrelerin basıldığı agaroz pedine bir cam lamel yerleştirin. Hücreler mikroskop için hazır.
NOT: Swarmer hücreleri hemen yüzücüye yansıtmak önemlidir, çünkü swarmer hücreleri yavaşça yüzücü durumuna farklılaşma başlatır.
4. Fluoresans Mikroskopisi için V. parahaemolyticus Yüzücünün Hücre Kültürlerinin Hazırlanması
NOT: Protokolün bu bölümü, yüzücü hücre tipi üzerinde floresans mikroskopisi yapmak için V. parahaemolyticus kültürü hazırlamayı açıklamaktadır.
- Tek bir koloni kenarından az miktarda hücre 5 mL LB suyu içine inoküle edin. Kültürü 37 ° C'de çalkalayan 1 saat süreyle veya hafif hücre büyümesi görünene kadar inkübe edin.
- atBu aşamada, gerekirse, ilgilenilen proteinlerin ekspresyonu için indükleyici ajan ekleyin. Bu örnekte, YFP-CheW 9'un ekspresyonunu başlatmak için L-arabinoz, nihai konsantrasyon% 0.2'ye (ağırlık / hacim) ilave edildi.
- Kültürü 37 ° C'de 2 saat ek sallayarak inkübe edin.
- Mikroskopi agaroz slaytları hazırlamak için 3.1-3.7 adımlarını izleyin.
- Agaroz pedinin merkezinde 1 μL hücre kültürü yapın ve kuru olana kadar noktayı inkübe edin.
- Hücrelerin lekeli olduğu agaroz pedine bir cam lamel yerleştirin. Hücreler floresan mikroskop altında görüntülenmeye hazır durumda.
5. Görüntü Analizi
Protokolün bu kısmı, görüntü analizi için bir iş akışı, özellikle de demografik analiz için tekli hücrelerin flüoresans verilerini nasıl çıkaracağını açıklıyor.
- Görüntü analizine başlamadan önce, tüm mikroskopik görüntülerin 16 bit TIF formatında kaydedildiğinden emin olun.
- DIC'yi (veya faz kontrastı) ve ilgili floresan kanalı görüntülerini yazılıma yükleyin.
- "Görüntü / Döşeme görüntüleri" ni seçerek her iki kanalın bir kaplama görüntüsü oluşturun. Resim sayısını ("# Görüntüler:") iki olarak ayarlayın ve ilk kanaldaki DIC görüntüsünü ve ikinci kanaldaki flüoresan resmi seçin.
- Araç çubuğundan "Multi-Line" aracını seçin ve hücrelerin ortasından bir kutuptan diğerine işaretleyin. Oluşturulan tüm satırların (çizgi nesneleri) listesini elde etmek için "Ölçü / Bölge Ölçümleri" ni açın. Bölge ölçümlerini yalnızca bölge etiketini, mesafeyi ve ortalama yoğunluğu görüntülemek üzere yapılandırın.
- "Ölçü / Kalibrasyon Mesafeleri" altındaki piksel boyutunu, mikroskop kurulumunuza özgü piksel boyutuna ayarlayın ve "Tüm Açık Resimler'e Uygula" yı tıklayın.
- Tüm bölgelerin (çizgi nesneleri) flüoresan kanal görüntüsüne aktarın. "Bölgeler / Transf" altında(Bölünmüş görüntü) ve hedef görüntü (floresan kanal görüntüsü) seçin ve "Tüm Bölgeler" i seçin ve "Tamam" düğmesine basın.
NOT: Daha sonra kesin çizgileri (çizgi nesneleri, bölgeleri, ROI) yeniden üretmek için "Bölgeler / Bölgeleri Kaydet" bölümünü açın ve bölgeleri kaydedin. - "Ölçü / Bölge Ölçümleri" ni açarak ve "Günlüğü Aç" a basarak tüm bölge ölçümlerini elektronik tabloya dışa aktarın. Verileri açmak ve vermek için onaylayın. E-tablo arka planda açıldıktan sonra, verileri "F9: Log Data" tuşuna basarak nazımıza aktarın.
- Hücre boyunca floresan odakların konumunu belirlemek için "Ölçüm / Linescan" açın. "Linescan Width" değerini bir hücrenin tüm genişliği önceden oluşturduğunuz bölge tarafından kapsanacak bir değere ayarlayın. Satır tarama grafiğini sağ tıklatın ve "Grafik Verilerini Göster" i seçin. Fareyi sol tıklayıp çizgiyle tarama çizgisine sürükleyerek"Grafik Verileri" penceresinde iki nokta arasındaki ilgili piksel / mesafe görüntülenir. Mavi vurgulanmış satırı seçin ve ardından içeriği kopyalayın.
NOT: Tüm çizgi tarama yoğunluğu profili "Linescan" penceresindeki "Günlük Verileri" ne basarak bir e-tabloya kaydedilebilir. Ayıklanan veriler şimdi grafiklerdeki görselleştirme veya daha ileri istatistiksel analiz için kullanılabilir. Hücre döngüsü üzerindeki yerelleştirme kalıpları, hücre uzunluğu ve hücre gövdesi boyunca bulunan floresan yoğunluklarının demografik bir temsilinde kolaylıkla görselleştirilebilir. Bu gösterimler daha önce seçilen aynı ROI'leri kullanarak elde edilebilir. Aşağıdaki adımlar, Şekil 3C ve 4C'de gösterilenlere benzer demografik bilgilerin nasıl oluşturulacağına ilişkin bir örnek verecektir.- Yazılımda daha önce yaratılan Fiji / ImageJ yük bölge işaretleri (.rgn) (5.6. Adımda) "Metamorph & ROI files importover";. Alternatif olarak, analiz edilecek hücrelerin ilgi alanlarını (ROI'leri) doğrudan inşa edilen "Segmented Line" aracını kullanarak Fiji / ImageJ'de yaratabilirsiniz.
- "Çözümle / Araçlar / ROI yöneticisi" ni açın ve tüm aktif liste girişlerini işaretleyin ".
- Ardından, "Daha Fazla / Çok Çizim" seçeneğini tıklayın ve ardından yeni "Çok Çizim" penceresinde "Liste" yi seçin. Bir tablo girişini tıklayın, ardından seçin ve "Tümünü kopyala" yı seçin. Ardından, yeni bir e-tabloya yapıştırın.
NOT: En uzun hücrenin (en çok sayıda satır bulunan iki karşılık gelen X ve Y sütun) verilerin e-tabloda sağdaki son hücre olduğundan emin olun. - E-tabloyu "CSV (Virgülle sınırlandırılmış) (* .csv)" olarak kaydedin.
- R komut dosyalarını buradan indirin "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10. Komut dizileri hücreleri uzunluğa göre sıralamakta ve tüm hücrelerin flüoresan yoğunluk profillerini her hücrenin flüoresan ortalamaları olarak normalleştirmektedire.
- Tüm komut dosyasını "hücre profilleri function.R" dosyasını R [sürüm 3.0.1; 11 ].
- 30 satırındaki "example plots.R" komut dosyasını, dosya yolu önceden oluşturulmuş .csv dosyasının kaydedildiği klasöre yönlendirilecek şekilde düzenleyin. Ayrıca, 31. satırdaki "profile.csv" dosya adını adım 5.9.4'te oluşturulan .csv dosyası için seçilen dosya adına değiştirin. Daha sonra, demografi analizi oluşturmak için "example plots.R" dosyasını çalıştırın ve "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" adresindeki belgeleri ve komut dosyası dosyasındaki yorumları takip edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklılaşma ve toplayıcı koloni üretiminin teşvik edilmesi
Şekil 1 , V. parahaemolyticus'un toplayıcı kolonilerinin üretilmesiyle ilgili önemli adımların bir şemasını sunmaktadır ( Şekil 1A-C ). Sürücüler kültürü sürü-agar üzerinde gözlendi ve 24 o C'de inkübe edildi, katı agar yüzeyi üzerinde swarmer farklılaşması ve çoğalması sağladı. Bir sürü koloninin temsili bir stereo-mikroskopik görüntüsü Şekil 2'de sunulmuştur. Stereo-mikroskopik görüntüleme, sürü koloni çevresinin dışına doğru uzanan yılan fişeklerini açıkça gösterir. Yüksek büyütme, sürü alevlerinde, hücrelerin yalnızca tek veya iki katmanlı olarak gruplandırıldığını; oyma koloninin ortasında hücrelerin çoklu katmanlar halinde istiflendiğini ortaya çıkarmaktadır ( Şekil 2A ). Sürü parmak ucu kolayca taşınabilir (3.8-3.11,
Floresan mikroskopi ve görüntü analizi
Şekil 1: Swarmer Türevinin İndüksiyonu ve Mikroskopi Görüntüleme İçin Hücrelerin Hazırlanması. V. parahaemolyticus swarmer hücrelerini üretmek için iş akışının basitleştirilmiş görselleştirilmesi ve tek swarmer hücrelerin mikroskopik analizi için mikroskop lamlarının hazırlanması. ( A ) Bir HI agar swarming plakasının ortasında V. parahaemolyticus'un bir OD 600 = 0.8 hücre kültüründen 1 uL'lik bir noktaya dikkat edin. ( B ) Nokta kurutuluncaya kadar ve hücreler agar yüzeyine yapıştırılana kadar inkübe edin. ( C ) Petri kabuğunu şeffaf bantla kapatın. Plakayı 24 ° C'de 16 saat inkübe edin. ( D ) HI agarın küçük bir parçasını kınan koloninin dış kenarından özenle boşaltın. ( E ) Eksizyonu mikraya aktarınOscopy agaroz pedinde agaroz pedine bakan swarmer hücreleri bulunur. 30 saniye kısa bir inkübasyon süresinden sonra, bağaltıcı hücreler agaroz pedine baskı yapılır. ( F ) Agaroz pedinden eksize edilmiş agarı dikkatli bir şekilde çıkarın ve üzerine bir mikroskop lamel yerleştirin. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Bir V. parahaemolyticus Swarming Kolonisinde Hücrelerin Organizasyonu . ( A ) V. parahaemolyticus swarmer kolonisinin stereo-mikroskopisi. Üst paneller, büyüyen bir büyümede bir yılan kolonisinin dış kenarını gösterir. Alt paneller, büyüyen büyütmede, merkez ile kenar arasındaki kınan koloninin bir alanını görüntüler. Sürü parmakları çevre kenarından uzanırSürü kolonisi. ( B ) Temsilci DIC mikroskopi swarming koloni ve ilgili belirtilen bölgelerden hücrelerin transfer sonra swarmer koloni kenar (üst panel) ve merkez ve çevre (alt panel) arasında bir alan görüntüleri. Sürü alevleri, 3.8-3.11. Adımlarda anlatıldığı gibi mikroskopi agaroz pedine doğrudan imprinted edildi. Merkez ile çevre arasında kalan hücreler, önce bir mikroskopi agaroz pedinde lekelenmeden önce sürü koloniden sıyırıldı ve LB suyu içinde yeniden askıya alındı. Ölçek çubuğu = 7.5 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: V. parahaemolyticus'un Yüzücü Hücrelerindeki Kemotaksis Dizilerinin Lokalizasyonu. ( A ) DIC ve YFP-CheW'yi ektopik olarak eksprese eden vahşi tip V. parahaemolyticus yüzücü hücrelerin flüoresans mikroskobu görüntüleri. ( B ) YFP-CheW odak dağılımını gösteren grafik, yüzücüler hücrelerindeki hücre uzunluğunun bir fonksiyonu olarak hücre kutuplarından odak uzaklıklarını çizerek. ( C ) YFP-CheW'yi ifade eden V. parahaemolyticus yüzücü hücrelerin flüoresan yoğunluk profillerinin demografik analizi. Hücreler, hücre uzunluğuna ve göreli floresan yoğunluğuna göre sıralanır. Ölçek çubuğu = 5 μm. Panel B ve C referans 9'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: V. parahaemolyticus'un Swarmer Hücrelerindeki Kemotaksis Dizilerinin Lokalizasyonu. A ) YFP-CheW'yi ektopik olarak eksprese eden vahşi tip V. parahaemolyticus swarmer hücrelerinin DIC ve fluoresan mikroskopi görüntüleri. ( B ) Yeşim hücrelerindeki hücre uzunluğunun bir fonksiyonu olarak hücre kutuplarından odakların mesafesini çizerek YFP-CheW odak dağılımını gösteren grafik. ( C ) YFP-CheW ifade V. parahaemolyticus swarmer hücrelerinin floresans yoğunluğu profillerinin demografik analizi. Hücreler hücre uzunluğuna göre sıralanır ve floresan yoğunluğunu gösterir. Ölçek çubuğu = 5 μm. Panel B ve C, referans 9'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, V. parahaemolyticus swarmer hücrelerinin mikroskopik görüntülemesi için bir yöntem ve bunun ardından, çalışılan floresanla işaretlenmiş proteinlerin subselüler lokalizasyonunu ve diğer özelliklerini çözmek ve nicelleştirmek üzere akış aşağı analizler sunulmaktadır. Mikroskopi görüntü işleme ve analizi için 14 , 15 , 16 , 17 , 18 için çeşitli araçlar mevcut olmakla birlikte, V. parahaemolyticus hücrelere saldıran hücrelerin analizi çoğunlukla , yoğun bir hücre topluluğu içerisinde varoldukları ve hücre uzunluğunda yüksek bir değişime sahip oldukları için meydan okumaktadır ( Şekil 2 ). Bu nedenle, otomatik hücre algılama bazen hatalı ve sonuç olarak biraz güvenilmez. Bu protokol, spektruma göre uyarlanmış V. parahaemolyticus'un kınan hücrelerini büyütmek , görüntülemek ve analiz etmek için tasarlanmış bir boru hattını özetlemektedirBir yüzeydeki kontrollü bir büyüme ortamı ve yakın mesafede büyüyen değişken uzunluklarda hücrelerin varlığını barındıran aşağı doğru görüntü analizleri gibi bu hücrelerin ihtiyaçlarını karşılamaktır.
Bir proteinden ektopik olarak bir proteinin ekspresyon yeteneği, örneğin , mikroskopi çalışmaları veya gen delesyonlarının tamamlanması için floresanla işaretlenmiş proteinlerin ekspresyonu gibi birkaç deney için önemlidir. Burada kimyasal olarak yetkili hücrelerin hazırlanma prosesi ve plasmid DNA'nın V. parahaemolyticus içine elektroporasyonu da tarif edilmiştir. V. parahaemolyticus için sıklıkla kullanılan konjügasyona karşı elektroporasyonun avantajı , plasmid omurgasının konjügasyona izin verecek şekilde modifiye edilmesi gerekmemesidir. Bununla birlikte, bazı tedbirler alınmalıdır; Adım 1.2'de açıklandığı gibi OD 600 = 1.0 hücre yoğunluğuna ulaşmak çok önemlidir. Daha düşük optik yoğunluklarda, hücreler elektroporasyondan sonra çözünürlerYüksek yoğunluklarda plazmid hücreler tarafından alınmaz. Ayrıca, V. parahaemolyticus hücrelerinin aşırı sert santrifüjü (basamaklar 1.4-1.6), elektroporasyon verimliliğini önemli ölçüde düşürecektir. Elektro-yetkili hücreler oluşturmak için yıkama aşamaları sırasında hücre pelletini özenle askıya alma da önemlidir.
Her ne kadar bir hücre kültürünün hazırlanması önemsiz görünse de, kültür yoğunluğu, kümelenme performansı için çok önemlidir. Genel olarak, ilk üstel büyüme fazında (OD 600 <0.5) bir hücre kültürü, geç üssel veya erken durağan fazdaki bir kültürden daha fazla kuluçka süresi boyunca daha büyük bir sarmalama kolonisi üretecektir. Deneylere bağlı olarak, daha büyük bir bataklık kolonisi faydalı olabilir. Bununla birlikte, aynı HI agar swarming plakasında yetiştirilen farklı suşlar arasındaki koloninin genişlemesi ve morfolojisini karşılaştırmak için, bireysel yırtıcı koloniler arasında yeterli boşluk bulunması önemlidir. Bu çok saçma olabilirDaha yoğun optik yoğunlukta bir hücre kültürünün bulunmasıyla ortaya çıkmış ve bu genellikle daha küçük kınayan kolonilere neden olacaktır.
Sürükleyici fenotipin indüksiyonu bakteriyel türler arasında önemli derecede değişir ve çoğalabilirliği, agar ve besin bileşimi, ortam sıcaklığı ve her iki çevrenin ve büyüme ortamının nem içeriği gibi faktörlerden oldukça etkilenir. Sonuç olarak, protokoldeki ve dış ortamdaki ufak değişiklikler, swarm testi sonuçlarını ve swarmer farklılaşmasını indüklemeyi önemli ölçüde etkiler. Pseudomonas aeruginosa ve Bacillus subtilis gibi diğer bakteri türlerinin akın etmesine neden olan protokoller 19 bildirilmiştir . Bu protokolde açıklanan adımlar, güvenilir bir şekilde V. parahaemolyticus'un swarmer hücre türünü üretir ve bunları, koloninin kenarında tek katmanlı yılan fişekleri üreten toplayıcı koloniler şeklinde tutacaktır . Istikrarlı veV. parahaemolyticus'un swarmer hücre tipi üzerinde tekrarlanabilir deneyler , HI swarming agar plakalarının hazırlanması bu protokolün en önemli parçasıdır. Özellikle kurutma basamağı optimizasyon gerektirebilir, çünkü her kuluçka makinesi farklı performans gösterecektir. Swarming davranışını etkileyebilecek bir diğer faktör de Petri tabaklarında kullanılan plastik türüdür. Laboratuarımızda swarming deneyleri yapmak için kullanılan tipik Petri kapları polistirenden (PS) yapılır. Bununla birlikte, düşük yoğunluklu polietilenden (PE LD) yapılmış Petri tabakları kullanılarak karışık sonuçlar ortaya çıktı. Açıklanan adımları izlemek çok önemlidir, çünkü sadece o zaman, tek perdeli hücre mikroskobu sağlayan, belirgin çevresel parlama oluşumu gösteren tekrarlanabilir swarming kolonileri oluşacaktır.
Kuşkusuz, V. parahaemolyticus hücrelerini saran floresan mikroskopi çalışmalarıyla elde edilen sonuçların görüntülenmesi için farklı yaklaşımlar yapılabilir . Instanc içinE, yaygın olarak kullanılan MicrobeTracker 16 programı makul bir alternatifi temsil etmektedir. Yakın zamanda erişilebilen ve MATLAB gerektirmeyen MicrobeTracker uygulaması Oufti 20 de bir başka alternatif. Bununla birlikte, Oufti'de diferansiyel arayüz kontrast (DIC) görüntülerin kullanılması mümkün değildir ve faz kontrast görüntüleme swarmer hücrelerde hücre parçalanmasının ayırt edilmesine uygun değildir. Ayrıca, tüm mikroskoplar faz kontrastlı görüntüleme için donatılmış değildir ve bunun yerine faz kontrast görüntüleme her türlü mikroskopik analiz için uygun değildir. Bedava ve ImageJ tabanlı diğer umut verici bir araç olan MicrobeJ 17 , yine de sadece faz kontrastı ve flüoresan görüntüleri kullanılabilir. Dahası, bu protokol sadece yaşam döngüsünün belirli zaman noktalarında hücrelerin görüntülenmesine ve analiz edilmesine izin verir. Bununla birlikte, zaman atlamalı görüntülemeyi ve takip eden görüntü analizini tanımlayan mükemmel bir protokol,Hücre yörüngeleri ve protein dinamikleri 21 muhtemelen V. parahaemolyticus'a uygulanabilir .
Bu protokolde açıklanan adımları takiben, bilim adamları V. parahaemolyticus'un hem swimmer hem de swarmer hücre tipi üzerinde güvenilir ve yeniden üretilebilir tek hücreli floresan mikroskopisi yapmalarını sağlayacaktır . Bu protokol, V. parahaemolyticus'ı yüzücüsünden swarmer hücre türüne dönüştürmenin sağlam bir yolunu ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Swarming hücrelerin tek katmanını yüzen kolonilerin çevresel alevlenmelerinden bir agaroz pedine imprinting ederek, proteinlerin hücre içi lokalizasyonu gözlenebilir; görüntü analizi için boru hattı, muhtemelen hücrelerin büyüdüğü bakteri toplulukları içinde bulunan diğer bakteri türlerine uygulanabilir. Otomatik görüntü analizinin avantaja sahip olmayabileceği çok yakın ve durumlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan edilmedi.
Acknowledgments
Bu çalışma Max Planck Topluluğu tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
