Summary
इस प्रोटोकॉल को अलग-अलग विब्रियो पैराहामोलिटिकस तैराक और सजीर कोशिकाओं के एकल सेल माइक्रोस्कोपी को सक्षम बनाता है। विधि सिंगल सेल विश्लेषण के लिए आसानी से उपलब्ध झिल्लीदार कोशिकाओं की आबादी का उत्पादन करती है और सेल संस्कृतियों की तैयारी, स्वर्गर भेदभाव, नमूना तैयार करने, और छवि विश्लेषण को शामिल करता है।
Abstract
कई सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ के लिए प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने की क्षमता आवश्यक है। बदले में, यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने की क्षमता की आवश्यकता होती है, जो विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब इमेजिंग कोशिकाएं जीवाणु समुदायों के भीतर मौजूद हों। उदाहरण के लिए, मानव रोगाणु विब्रियो पैराहामोलिटिकस द्रव स्थितियों में छोटे छड़ी के आकार का तैराक कोशिकाओं के रूप में मौजूद है, जो कि सतह के संपर्क पर ठोस सतहों पर विकास के लिए विशेष रूप से अत्यधिक बढ़ाव वाले स्वर्मर कोशिकाओं के उप-जनन में विभेद करते हैं। इस पत्र में वी। पैराहामोलिटिकस के दो विभेदक राज्यों में एकल कोशिका प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है। यह प्रोटोकॉल बहुत प्रजननशील रूप से वी। पैराहामोलिटिकस के भेदभाव को स्वर्गर कोशिका जीवन-चक्र में भेद करता है और ठोस सतहों पर उनके प्रसार को सुविधाजनक बनाता है। विधि टी से विस्तार विभेदित swarmer कोशिकाओं के flares पैदा करता हैवह झुंड-कॉलोनी का किनारा है विशेष रूप से, झुंड-ज्वाला के बहुत टिप पर, कोशिकाओं की एक परत में झुकाव वाले कोशिकाएं मौजूद होती हैं, जो एक खुर्दबीन स्लाइड और एकल कोशिकाओं के बाद के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए आसान स्थानांतरण की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, बैक्टीरियल सोसायटी के जनसांख्यिकीय प्रतिनिधित्व के लिए छवि विश्लेषण का कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया गया है। सिद्धांत के एक प्रमाण के रूप में, वी। परहामोल्यटिकस के तैराक और झिल्लीदार कोशिकाओं में चेमोटेक्सिस के सिग्नल एरे के इंट्राससेल्युलर स्थानीयकरण का विश्लेषण किया गया है।
Introduction
जीवाणु लगातार अपने बाहरी माहौल में परिवर्तन का अनुभव करते हैं और तदनुसार उनके व्यवहार को बदलने और उनका अनुकूलन करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया है। ऐसा ही एक तंत्र में भिन्न सेल प्रकारों में भेदभाव शामिल होता है जो बेहतर पर्यावरण के पूरक हैं। भेदभाव में अक्सर कोशिका चक्र, कोशिका आकृति विज्ञान, और कोशिकाओं के spatiotemporal संगठन के नियमन में बड़े बदलाव शामिल हैं। एक जीव है जो भेदभाव से गुज़र सकता है, विब्रियो पैराहामोलिटिकस है । वी। पैराहामोलिटिकस विब्रोनियासीई से संबंधित है, जो कि प्रोटीबैक्टीरिया का एक परिवार होता है जो आमतौर पर ताजा या नमक पानी में रहते हैं। वाइब्रोनेसाई को पर्यावरण में व्यापक रूप से वितरित किया जाता है और इसमें कई प्रजातियां शामिल हैं जो मनुष्यों में आंतों के संक्रमण का कारण बनती हैं, जिनमें विब्रियो कोलेरे भी शामिल हैं। पैराहामोलिटाइकस एक दिमालिक जीव है और दो अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम है जैसे कि इसके परिवर्तनों को समायोजित करने के लिए प्रतिक्रियाबाह्य परिवेश जलीय वातावरण में, यह एक छोटे छड़ी के आकार का तैराक कोशिका के रूप में होता है जिसमें पुराने कोशिका पोल पर स्थित एक ध्रुवीय फ्लैगेलम होता है। सतह संपर्क पर, एक swarmer सेल में भेद शुरू हो रहा है। सुगम सेल भेदभाव में दो बड़े बदलाव शामिल हैं: सेल डिवीजन के निषेध के माध्यम से झुकाव सेल morphogenesis, और एक दूसरे flagella प्रणाली की प्रेरण। इससे एक विकृत और अत्यधिक लम्बी छड़ी के आकार वाले स्विर्मर सेल के निर्माण में परिणाम आता है, जो या तो जीवन शैली का जीवन जारी कर सकता है, जहां विभाजन घटनाओं के परिणाम संतान संचरित कोशिकाओं में होते हैं या वैकल्पिक रूप से तैराक कोशिकाओं में वापस अंतर करते हैं।
कई कारकों को झुकाव के भेदभाव को प्रेरित करने या प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है प्राथमिक उत्तेजना तंत्र को संचालित करने के लिए प्रतीत होता है जहां वी। पैराहामोलिटिकस ध्रुवीय फ्लैगेलम को एक स्पर्श संवेदक के रूप में उपयोग करता है जो सतह संपर्क पर रोटेशन के निषेध का पता लगाता है, लेकिन कई अन्य कारक शामिल हैंअच्छी तरह से 1 प्रयोगशाला में, ध्रुवीय ध्वज का रोटेशन कृत्रिम रूप से फ़िनमिल को जोड़कर बाधित किया जा सकता है, जो सोडियम-चैनल चालित फ्लिगलर रोटेशन को अवरुद्ध करता है, जिससे स्वर्मर भेदभाव 2 प्रेरित होता है इसके अलावा, पहले के एक अध्ययन में, विब्रियो अलिजिनोलिटिकस को ठोस मीडिया पर झुकाव के लिए प्रेरित किया गया था जब कोशिकाओं को एक पेट्री डिश में विकास माध्यम पर प्रचारित किया गया था जो स्पष्ट प्लास्टिक टेप के साथ बंद हुआ था। क्षार-संतृप्त फिल्टर पेपर इन स्थितियों के तहत झुंड को रोका जा रहा है, इसलिए यह सुझाव दे रहा है कि एक या अधिक वाष्पशील एसिड को झुकाव के शामिल करने में शामिल किया जा सकता है। इस प्रकार, प्लास्टिक टेप के साथ पेट्री डिश को सील करने से संभवतः वोल्टिल एसिड के संचय के लिए अनुमति होती है, जिसे प्लेट के सिर वाले स्थान के भीतर सेलुलर चयापचय के द्वारा उत्पादित किया जाता है। उसी प्रभाव को हासिल किया गया, जब एच 2 ओ 2 को अप्रबंधित पेट्री डिश में विकास माध्यम में जोड़ दिया गया, ताकि कृत्रिम रूप से मीडिया घटकों द्वारा हाइड्रोलाइज़िंग द्वारा अस्थिर एसिड का उत्पादन किया जा सके।
वी। पैराहामोलिटेकस भेदभाव में सेल डिवीजन, सेलुलर आकृति विज्ञान, और मैक्रोमोलेक्यूलर मशीनों की स्थिति जैसे फ्लॉगरए और केमोटाक्सिस एपार्टसस - प्रक्रियाओं के लिए सभी को सेल चक्र के अनुसार प्रोटीन के विशिष्ट स्थानीयकरण की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, उपर्युक्त सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ के लिए ऐसे प्रोटीन के इंटरासेल्युलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने की क्षमता आवश्यक है। ऐसे अध्ययन करने के लिए एकल कोशिकाओं पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी आवश्यक है। यह विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब इमेजिंग कोशिकाएं घने बैक्टीरियल आबादी के भीतर मौजूद होती हैं, जैसे कि स्विर्मर कोशिकाओं के मामले हैं। तरल मीडिया में झुकावपूर्ण भेदभाव को प्रेरित करने के प्रयास किए गए हैं, जो संभवत: माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए एकल कक्ष उत्पन्न कर सकते हैं। और यद्यपि ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर इन कोशिकाओं ने आंशिक रूप से स्विर्मर-भेदभाव कार्यक्रम को प्रेरित किया है, वे एक ही अलग रूपिकी परिवर्तनों से गुज़रते नहीं हैं, क्योंकि ठोस माध्यम 8 पर विकसित होने वाले पूरी तरह भेदभाव वाले सेल। इस पत्र में झुमके सीई को प्रेरित करने के लिए एक विधि के एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रदान करता हैएक अगर सतह पर भेदभाव करेंगे प्रोटोकॉल एकल सेल माइक्रोस्कोपी और बाद के विश्लेषण के लिए आसानी से उपलब्ध आसानी से swarmer कोशिकाओं की आबादी पैदा करता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल दोनों तैराक और swarmer सेल-प्रकार (खंड 1, 2, 3, 4) में fluorescently लेबल प्रोटीन के स्थानीयकरण अध्ययन सक्षम बनाता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल, बाद के कार्यप्रवाह का वर्णन करता है कि कैसे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोगों से जनरेटेड डेटा को संसाधित करने और विश्लेषण करने के लिए, जो कि बैक्टीरियल सोसायटियों (अनुभाग 5) के जनसांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देता है।
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Protocol
1. इलेक्ट्रो-सक्षम वी। पैराहामोलिटिकस कोशिकाओं की तैयारी और तैराक कोशिकाओं में प्लाज्मिड डीएनए का इलेक्ट्रोप्रोरेज
नोट: प्रोटोकॉल के निम्न खंड में तैलीय कोशिकाओं में इलेक्ट्रो-सक्षम कोशिकाओं की तैयारी और प्लाज्मिड डीएनए के बाद के इलेक्ट्रोपोरोजन की अनुमति मिलती है। यह चरण महत्वपूर्ण है यदि फ्लोरोसेंट प्रोटीन एस्प्टोलिक रूप से एक प्लाज्मिड से व्यक्त किया जा रहा है।
- एक 80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल स्टॉक से वी। पैराहामोलिटिकस कोशिकाओं को बाहर निकालना, ताजे एलबी अगर प्लेट में 100 μg / एमएल एम्पीसिलीन होता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
- अगले दिन, वी। पैराहामोल्यटिकस की एक कॉलोनी के साथ 200 एमएल का एलबी माध्यम का टीका लगाना और 37 डिग्री सेल्सियस तक घुलनशील शर्तों के तहत ओडी 600 तक 1.0 तक पहुंचने तक पहुंचने में मदद करता है। आमतौर पर सेल संस्कृति के लिए वांछित ऑप्टिकल घनत्व तक पहुंचने के लिए 5-6 घंटे ऊष्मायन होता है।
- तुरंत कोशिकाओं को बर्फ और पेर्फ पर स्थानांतरित करेंOrm बर्फ पर और आगे 4 डिग्री सेल्सियस पूर्व ठंडा centrifuges में आगे कदम।
- कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम में फसल करें
- सतह पर तैरनेवाला को विचलन से हटा दें और 25 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे 273 एमएम सुक्रोज़ समाधान (पीएच 7.4, कोहेह के साथ बफर) में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
- कोशिकाओं को फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2000 x ग्रा में फसल करें दो अतिरिक्त समय दोहराएं।
- 400 μL बर्फ-ठंड 273 एमएम सूक्रोज समाधान में धोया सेल गोली को फिर से निलंबित। इसके बाद, ग्लाइसरॉल को 15% वॉल्यूम / वॉल्यूम की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें अब कोशिकाएं electroporation के लिए तैयार हैं, लेकिन बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 70 μL के अलियंत्रियों में भी जमी जा सकती हैं।
- Electroporation के लिए, 100-1000 एनजी प्लास्मिड डीएनए के साथ विद्युत-सक्षम कोशिकाओं के 70 μL विभाज्य पदार्थ को मिलाएं और मिश्रण को बर्फ-ठंडा इलेक्ट्रोप्रोरेज क्युवेट (0.2 सेमी इलेक्ट्रोड अंतर) में स्थानांतरित करें। निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ electroporation प्रदर्शन: 25 μF, 2400 वी और 200 Ω
- निलंबित करेंएलओपी ब्रोथ के 600 μL में इलेक्ट्रोपार्यण क्युवेट में कोशिकाओं, 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस 3 घंटे के लिए मिलाते समय सेते हैं।
- 5 मिनट के लिए 2,000 xg पर कोशिकाओं को स्पिन करें और 100 μL एलबी शोरबा में गोली फिर से निलंबित करें। आवश्यक एलबी एगर प्लेटों पर सेल-निलंबन फैलाएं जिसमें आवश्यक एंटीबायोटिक होते हैं और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- अगले दिन, कॉलोनी गठन के लिए प्लेट्स की जांच करें। प्लाज्मिड पर एन्कोड किए गए सही एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को ले जाने वाले कालोनियों और अब आगे के प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है।
2. घुटाई सेल भेदभाव का प्रेरण
नोट: निम्न चरणों का वर्णन है कि कैसे वी। पैराहामोलिटिकस के भेदभाव को अपने झुकाव सेल जीवन-चक्र में भेद करने और ठोस सतहों पर प्रसार को कैसे उत्तेजित किया जाए।
- हर्म इन्फ्यूजन (एचआई) एगर के 4 ग्राम को 100 मिलीलीटर डीडीएच 2 ओ में निस्तारित करने के लिए तैरने वाली प्लेटें तैयार करने के लिए।
- ध्यान से माइक्रोएव में हाई एगर का समाधान उबाल लें और समय-समय पर बोतल को हिलाएं जब तक पाउडर भंग न हो जाए। आटोक्लेव 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए
- आटोक्लेविंग के बाद, HI अगर को 60-65 डिग्री सेल्सियस तक शांत करें 50 सुक्ष्ममापी (100% इथेनॉल में 50 मिमी का स्टॉक समाधान) की अंतिम एकाग्रता में 2,2-बीपीआईडिल जोड़ें। 4 एमएम (डीडीएच 2 हे में 4 एम का स्टॉक समाधान) के अंतिम एकाग्रता में CaCl 2 जोड़ें। यदि आवश्यक हो, तो प्लास्मिड को बनाए रखने के लिए एंटीबायोटिक्स को समाधान में जोड़ें।
नोट: यदि एक inducible प्लाज्मिड का उपयोग करने की योजना बना रही है, तो उसे अंडाकार एजेंट को अपनी अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
सावधानी: 2,2-बीिपरीडिल: तीव्र विषाक्तता (मौखिक, त्वचीय, साँस लेना) इस रासायनिक को संभालने के दौरान दस्ताने और सुरक्षा चश्मे का उपयोग करें - 30 - 35 एमएल अंतिम हिल्गारिया के समाधान को गोल 150 मिमी पेट्री डिश में डालें और अगर जड़ें मजबूत करें।
- सेल संस्कृति खोलने से पहले ठीक है, अगर थाली को 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 10 मिनट (या जब तक किसी भी तरल अवशेषों के लिए disaखुली ढक्कन के साथ ऊपरी दाएं)
नोट: सुखाने के समय का उपयोग इनक्यूबेटर पर निर्भर करता है और भारी सूखे प्लेटें वी । पैराहामोलिटिकस के झुंड की अनुमति नहीं देगी । (यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है!) प्लेट्स को ताज़ा इस्तेमाल किया जाना चाहिए और 2 से अधिक आयु होनी चाहिए - 3 घंटे पुरानी प्लेटें सूखने को उत्तेजित करने के लिए बहुत सूखी होंगी - एक कॉलोनी के किनारे से छोटी मात्रा की कोशिकाओं को 5 एमएल एलबी शोरबा में रख दें। ओडी 600 = 0.8 तक पहुंचने वाले संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस तक मिलाते हुए, आमतौर पर लगभग 2-3 घंटे लगते हैं। उसके बाद, कोशिकाओं को हा स्वाद देने वाली अगर प्लेटों पर देखा जाने के लिए तैयार हैं।
- एक HI अगर सफ़ाई वाली प्लेट ( चित्रा 1 ए ) के केंद्र में सेल संस्कृति के 1 μL को स्पॉट करें।
- स्थान सूखा ( चित्रा 1 बी ) चलो।
- स्पष्ट प्लास्टिक टेप के साथ थाली को सील करें और सुनिश्चित करें कि यह मजबूती से जुड़ा हुआ है, अन्यथा यह रातोंरात ऊष्मायन ( चित्रा -1 सी ) के दौरान अलग हो सकता है।
नोट: यह हैबहुत महत्वपूर्ण है कि मुहर परिपूर्ण है जब इसे लागू किया जाता है तो टेप को हवा के बुलबुले और सिलवटों के निर्माण से बचें। - रात भर 24 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को सेते। इससे झुंड-कॉलोनी की परिधि ( चित्रा 2 ) से फैले झुंड- चक्कर के साथ वी। पैराहामोलिटिकस झुंड-कॉलोनी के गठन का नतीजा होगा।
3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए वी। पैराहामोलीटिकस स्वावर सेल की तैयारी
नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल माइक्रोस्कोपी के लिए एक तरर्म कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोपी एगरोज़ स्लाइड्स तैयार करने के लिए और एक एगरोज़ पैड पर स्वर्गिंग फ्लैरों के बाद की छाप को तैयार करने का वर्णन करता है।
- माइक्रोस्कोपी के लिए agarose स्लाइड तैयार करने के लिए, agarose के 1 ग्राम को 20% वॉल्यूम / वॉल्यूम पीबीएस के 100 एमएल और 10% वॉल्यूम / एलओबी शोरबा समाधान जोड़ें। एगरोज़ को भंग करने के लिए माइक्रोवेव में सावधानी से उबालें और इसे चुंबकीय उत्तेजक के मिश्रण के साथ 65-70 डिग्री सेल्सियस तक शांत कर दें।
- जगह एसीकाम करने वाले पीठ के एक पूर्ण स्तर खंड पर दुबला सूक्ष्मदर्शी स्लाइड। सामान्य प्रयोजन प्रयोगशाला लेबलिंग टेप की दो परतों के साथ स्लाइड के दोनों सिरों को कवर करें, स्लाइड को काम कर रहे बेंच में फिक्स करना टेप के दो टुकड़ों के बीच की दूरी लगभग 3 सेंटीमीटर होगी।
नोट: टेप की दो परतें बहुत छोटी ऊंचाई बनाते हैं, जो एगरोज़ पॅड की ऊंचाई निर्धारित करेगी। यह महत्वपूर्ण है कि कार्य स्थान स्तर है यह सुनिश्चित करने के लिए कि सेल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए समान विमान में होंगे। - पाइपेट ~ गैर-आच्छादित ग्लास सतह पर पहले तैयार एगरोज़ समाधान के 250 μL।
- अब नीचे एक पर-नीचे के रूप में एक ही ओरिएंटेशन में दूसरी सूक्ष्मदर्शी स्लाइड लगाकर थोड़ा नीचे दबाएं, ताकि अवशिष्ट एगरोज पक्षों से बाहर निकल सके।
- Agarose 1-2 मिनट जमना और फिर धीरे धीरे एक क्षैतिज आंदोलन में नीचे एक से ऊपर कांच स्लाइड खींचें।
- एक स्केलपेल का इस्तेमाल करके, किसी भी अवशिष्ट एजोज को काट दिया गया है जो कि जुड़ा हुआ हैमाइक्रोस्कोप स्लाइड के पक्ष और धीरे-धीरे माइक्रोस्कोप स्लाइड के छोर से टेप को हटा दें।
नोट: agarose स्लाइड अब तैयार है और जितनी जल्दी हो सके इस्तेमाल किया जाना चाहिए क्योंकि यह धीरे धीरे सूखना शुरू कर देगा। - स्विर्मर कोशिकाओं पर माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए, एक झुका हुआ कॉलोनी ( चित्रा 1 डी ) के सबसे बाहरी किनारे से एक 3 मिमी x 10 मिमी झुका हुआ अगर का टुकड़ा कट। यह बहुत महत्वपूर्ण है कि झुंड-प्लेट की टेप की सील को तोड़ने तक नहीं, जब तक कि सूक्ष्मदर्शी कोशिकाओं को सूक्ष्मदर्शी स्लाइड में स्थानांतरित करने से पहले। टेप हटा दिए जाने के बाद, वी। पैराहामोलिटिकस कोशिकाओं को झुकाव से तैराक कोशिकाओं में भेदभाव शुरू होता है।
नोट: कॉलोनी ( चित्रा 1 डी ) के अंदर से झुका हुआ कॉलोनी किनारे के बाहर से कटौती को सुनिश्चित करना सुनिश्चित करें। इस तरह से आप "तैराक संदूषण" को झुकाव वाले कॉलोनी के किनारे पर रोक सकते हैं। - एगरोस पा से सामना करने वाले कोशिकाओं के साथ सूक्ष्मदर्शी agarose स्लाइड पर घुमावदार का टुकड़ा स्थानांतरित करेंडी ( चित्रा 1 ई )। यह संवेदी कोशिकाओं को agarose पैड पर दर्शाता है।
- ~ 30 के इंतजार के बाद, agarose पैड ( चित्रा 1 एफ ) से ध्यान से अगर टुकड़ा को हटा दें।
- एगरोज पैड पर एक ग्लास कंसलिप को रखें जहां कोशिकाएं छापी हुई थीं। अब कोशिकाएं माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार हैं
नोट: तत्काल तैरने वाले कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि तैराक की कोशिकाओं को धीरे-धीरे भेदभाव शुरू करने के बाद तैरने वाले राज्य
4. वी। पैराहामोलिटिकस तैयारी तैर सेल-संस्कृतियों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए
नोट: प्रोटोकॉल का यह खंड वर्णन करता है कि तैराक कोशिका-प्रकार पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी करने के लिए वी। पैराहामोलिटिकस की संस्कृति तैयार करने के तरीके
- एक कॉलोनी के किनारे से छोटी मात्रा की कोशिकाओं को 5 एमएल एलबी शोरबा में रख दें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मिलाते हुए या थोड़े से सेल-विकास दिखाई देने लगते हुए संस्कृति को सेते हैं।
- परइस स्तर पर, यदि आवश्यक हो, तो ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए उत्प्रेरण एजेंट को जोड़ें। इस उदाहरण में, एल-अरबिनोज को 0.2% (w / vol) के अंतिम एकाग्रता में जोड़ा गया ताकि YFP-CheW 9 की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया जा सके।
- संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 2 घंटे के लिए मिलाते हुए सेते हैं।
- माइक्रोस्कोपी agarose स्लाइड तैयार करने के लिए चरणों 3.1-3.7 का पालन करें।
- Agarose पैड के केंद्र में सेल संस्कृति के 1 μL को स्पॉट करें और यह सूखे होने तक स्पॉट सेते।
- एगरोज पैड पर एक ग्लास कंसलिप रखें जहां कोशिकाओं को देखा गया। अब कोशिका प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत इमेज किए जाने के लिए तैयार हैं।
5. छवि विश्लेषण
प्रोटोकॉल का यह हिस्सा छवि विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है, विशेषकर जनसांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एकल कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति डेटा को कैसे निकालना।
- छवि विश्लेषण शुरू करने से पहले सुनिश्चित करें कि सभी माइक्रोस्कोपी छवियों को 16bit TIF प्रारूप में सहेजा गया है।
- सॉफ्टवेयर में डीआईसी (या चरण के विपरीत) और इसी फ्लोरोसेंट चैनल छवियों को लोड करें
- "प्रदर्शन / ओवरले चित्र" का चयन करके दोनों चैनलों की ओवरले छवि उत्पन्न करें चित्रों की संख्या निर्धारित करें ("# छवियाँ":) दो से, और पहले चैनल में डीआईसी छवि का चयन करें और दूसरे चैनल में फ्लोरोसेंट छवि का चयन करें।
- टूलबार से "मल्टी-लाइन" टूल का चयन करें और कक्ष के मध्य के माध्यम से एक ध्रुव से दूसरे तक कोशिकाओं को चिह्नित करें। सभी उत्पन्न लाइनों (रेखा ऑब्जेक्ट्स) की एक सूची प्राप्त करने के लिए "माप / क्षेत्र माप" खोलें केवल क्षेत्र लेबल, दूरी और औसत तीव्रता को प्रदर्शित करने के लिए क्षेत्र के माप को कॉन्फ़िगर करें।
- आपके माइक्रोस्कोप सेटअप के लिए विशिष्ट है और "सभी खुली छवियों पर लागू करें" पर क्लिक करें "पिक्सेल आकार में" माप / कैलोबेट दूरी "के अंतर्गत पिक्सेल आकार को कैलिब्रेट करें।
- सभी क्षेत्रों (रेखा ऑब्जेक्ट्स) को फ्लोरोसेंट चैनल छवि में स्थानांतरित करें "क्षेत्र / ट्रांसफ़ के तहतएर क्षेत्रों "स्रोत छवि (ओवरले छवि) और गंतव्य छवि (फ्लोरोसेंट चैनल छवि) का चयन करें।" सभी क्षेत्रों "का चयन करें और" ओके "दबाएं
नोट: बाद में सटीक लाइनें (लाइन ऑब्जेक्ट्स, क्षेत्र, आरओआई) का पुन: उत्पादन करने के लिए, "क्षेत्र / क्षेत्र सहेजें" खोलें और क्षेत्रों को बचाएं। - "माप / क्षेत्र माप" खोलकर और "ओपन लॉग" दबाकर सभी क्षेत्र के माप को स्प्रेडशीट में निर्यात करें डेटा को खोलने और निर्यात करने की पुष्टि करें। एक बार स्प्रैडशीट को पृष्ठभूमि में खोला जाता है, अंत में "एफ 9: लॉग डेटा" दबाकर डेटा निर्यात करें
- सेल के साथ फ्लोरोसेंट फ़ॉसी की स्थिति निर्धारित करने के लिए, "मापन / लाइन्सकेन" खोलें मान के लिए "लाइनस्केन चौड़ाई" को सेट करें ताकि एक सेल की पूरी चौड़ाई उस क्षेत्र के द्वारा कवर की गई हो जिसे आपने पहले बनाया था। रेखा-स्कैन ग्राफ़ पर राइट-क्लिक करें और "ग्राफ़ डेटा दिखाएं" चुनें बाएं-क्लिक करके और माउस-कोरसियर को लाइन-स्कैन करके खींचेंब्याज की स्थिति, "ग्राफ़ डेटा" विंडो में दो अंकों के बीच संबंधित पिक्सेल / दूरी प्रदर्शित होगी। नीली हाइलाइट की गई पंक्ति का चयन करें और फिर सामग्री की प्रतिलिपि बनाएँ।
नोट: "लाइन्सकेन" विंडो में "लॉग डेटा" दबाकर पूरी लाइन-स्कैन तीव्रता प्रोफ़ाइल को स्प्रैडशीट में लॉग किया जा सकता है। निकाले गए डेटा का उपयोग अब ग्राफ़ों या आगे सांख्यिकीय विश्लेषण में विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया जा सकता है। सेल चक्र के स्थान पर स्थानीयकरण पैटर्न आसानी से सेल की लंबाई के एक जनसांख्यिकीय प्रतिनिधित्व और सेल शरीर के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता में देखा जा सकता है। इन अभ्यावेदनों को उसी आरओआई के पहले से चयनित का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। निम्नलिखित चरणों में आंकड़े 3 सी और 4 सी में दिखाए गए लोगों के समान जनसांख्यिकी बनाने का उदाहरण दिया जाएगा।- फिजी / इमेजज लोड क्षेत्र चिह्नों (.rgn) में पहले "मेटामोर्फ एन डी एंड आरओआई फाइल आयातक" का इस्तेमाल करते हुए सॉफ़्टवेयर (चरण 5.6) में बनाया गया था;। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं का ब्याज (आरओआई) का विश्लेषण किया जा सकता है, फ़िजी / इमेजजे में बिल्ड-इन "सेगमेंटेड लाइन" उपकरण का उपयोग करके सीधे बनाया जा सकता है।
- "विश्लेषण / उपकरण / आरओआई प्रबंधक" खोलें और सभी सक्रिय सूची प्रविष्टियों को चिह्नित करें "।
- इसके बाद, "अधिक / मल्टी प्लॉट" पर क्लिक करें और फिर नई "मल्टी प्लॉट" विंडो में "सूची" का चयन करें। किसी तालिका प्रविष्टि पर क्लिक करें, फिर चुनें और "सभी को कॉपी करें" इसके बाद, एक नई स्प्रैडशीट में पेस्ट करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि सबसे लंबे सेल का डेटा (पंक्तियों की अधिकतम संख्या वाले दो संबंधित एक्स और वाई कॉलम) स्प्रैडशीट में दाईं ओर अंतिम है। - स्प्रैडशीट को "सीएसवी (कॉमा सीमांकित) (* .csv)" के रूप में सहेजें
- यहाँ से आर स्क्रिप्ट डाउनलोड करें "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10. स्क्रिप्ट लम्बाई से कोशिकाओं को सॉर्ट करते हैं और प्रत्येक सेल के फ्लोरेसेसेन के औसत के रूप में सभी कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोफाइल को सामान्य मानते हैंई।
- आर [संस्करण 3.0.1; में पूरी स्क्रिप्ट "सेल प्रोफाइल फ़ंक्शन। आर" चलाएं; 11 ]
- पंक्ति 30 में "उदाहरण प्लॉट्स। आर" स्क्रिप्ट को संपादित करें, जैसे कि फ़ाइल का पथ उस फ़ोल्डर को संदर्भित करता है जहां पहले से उत्पन्न। सीसीवी फ़ाइल सहेजी गई थी। साथ ही, चरण 5.9.4 में उत्पन्न .csv फ़ाइल के लिए चुना गया फ़ाइल नाम के लिए फ़ाइल नाम "profile.csv" को पंक्ति 31 में बदलें। बाद में, "उदाहरण प्लॉट्स। आर" चलाएं और "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" के साथ ही जनसांख्यिकीय विश्लेषण तैयार करने के लिए स्क्रिप्ट फ़ाइल से टिप्पणियां का पालन करें।
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Representative Results
भेदभाव और झुकाव कालोनियों की उत्पत्ति का प्रेरण
चित्रा 1 में वी। पैराहामोलिटिकस ( चित्रा 1 ए-सी ) की झुंड वाली उपनिवेशों के उत्पादन में शामिल महत्वपूर्ण कदमों का एक स्कीमा प्रदान करता है। तैराक संस्कृति पर झुंड-एगर पर देखा गया था और 24 डिग्री सेल्सियस पर सीधा लगाया गया था, ठोस आगर की सतह पर स्वर्गर भेदभाव और प्रसार को प्रेरित किया गया था। एक झुकाव कॉलोनी का एक प्रतिनिधि स्टीरियो-माइक्रोस्कोपी छवि चित्रा 2 में प्रस्तुत किया गया है । स्टीरियो-माइक्रोस्कोपी इमेजिंग स्पष्ट रूप से झुंड-कॉलोनी परिधि के बाहर फैले हुए झुंड-फूलों को दर्शाती है। उच्च बढ़ाई से पता चलता है कि झुंड-ज्वाला की कोशिकाओं में मोनो-या द्वि-परतों में ही वर्गीकृत किया जाता है, जबकि झुंड-कॉलोनी कोशिकाओं के बीच में कई परतों ( चित्रा 2 ए ) में खड़ी होती है। झुंड-फूलों को आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है (जैसा चरण 3.8-3.11 में वर्णित है,
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण
चित्रा 1: सूक्ष्म भेदभाव और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी के प्रेरण। वी। पैराहामोलिटिकस स्विर्मर कोशिकाओं का निर्माण करने के लिए वर्कफ़्लो का सरलीकृत विज़ुअलाइज़ेशन और सिंगल स्विर्मर कोशिकाओं के माइक्रोस्कोप विश्लेषण के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करना। ( ए ) स्पॉट 1 ओएल 600 = 0.8 कोशिका संस्कृति के वी। पैराहामोलिटिकस के बीच में एक HI अगर सुवर्ण थाली के केंद्र में। ( बी ) जब तक सूख न हो तब तक जगह को सेते और कोशिकाओं को अगर सतह से जुड़ा होता है ( सी ) स्पष्ट टेप के साथ पेट्री डिश सील। 16 घंटे के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को सेते। ( डी ) सावधानीपूर्वक कॉलोनी के बाहरी किनारे से होनी अगर का एक छोटा सा टुकड़ा ध्यान से उत्पादित करें। ( ई ) एक माइक्रोन पर छांटना स्थानांतरणओस्कोपी एगरोज पैड, एगारोज पैड का सामना करने वाले झिल्लीदार कोशिकाओं के साथ। 30 एस के छोटे से ऊष्मायन समय के बाद, तापी कोशिकाएं agarose पैड पर अंकित होती हैं। ( एफ ) अग्रसारक पैड से एक्जीज्ड एगर को सावधानीपूर्वक हटाएं और शीर्ष पर एक माइक्रोस्कोपी कंडोली रखें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: एक वी। पैराहामोलिटिकस स्विमिंग कॉलोनी में कोशिकाओं का संगठन । ( ए ) वी। पैराहामोलिटाइकस स्मरर कॉलोनी की स्टीरियो-माइक्रोस्कोपी। ऊपरी पैनल बढ़ते आवर्धन में बढ़ते कॉलोनी के बाहरी किनारे का प्रदर्शन करते हैं। नीचे के पैनल बढ़ते आवर्धन में केंद्र और किनारे के बीच झुका हुआ कॉलोनी का एक क्षेत्र प्रदर्शित करते हैं। झुंड-फ़्लेयर की परिधि से विस्तारझुंड-कॉलोनी ( बी ) स्विर्मर कॉलोनी किनारे (ऊपरी पैनल) के प्रतिनिधि डीआईसी माइक्रोस्कोपी की छवियों और केंद्र और परिधि के बीच का एक क्षेत्र (नीचे की पैनल) कोशिकाओं के स्वर्गिंग कॉलोनी के संबंधित संकेत स्थानों से स्थानान्तरण के बाद चरण 3.8-3.11 में वर्णित अनुसार झुंड-ज्वाला सीधे माइक्रोस्कोपी agarose पैड पर छापे गए थे। केंद्र और परिधि के बीच के क्षेत्र से कोशिकाओं को पहली बार झुंड-कॉलोनी से हटा दिया गया था और सूक्ष्मदर्शी agarose पैड पर देखा जाने से पहले, एलबी शोरबा में फिर से निलंबित किया गया था। स्केल बार = 7.5 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: वी। पैराहामोलिटिकस के तैराक कोशिकाओं में केमोटाक्सिस एरे के स्थानीयकरण। ( ए ) डीआईसी और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों जंगली प्रकार वी। पैराहामोलिटिकस तैराक कोशिकाओं ectopically YFP-CheW व्यक्त। ( बी ) तैनाती कोशिकाओं में सेल की लंबाई के एक समारोह के रूप में सेल डंडे से foci की दूरी की साजिश रचने द्वारा YFP-CheW foci वितरण प्रदर्शित ग्राफ। ( सी ) वी। पैराहामोलिटिकस तैराक कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफाइल का जनसांख्यिकीय विश्लेषण, YFP-CheW को व्यक्त करते हुए। सेल कोशिका की लंबाई से क्रमबद्ध होते हैं और रिश्तेदार फ्लोरोसेंट तीव्रता को प्रदर्शित करते हैं। स्केल बार = 5 सुक्ष्ममापी पैनल बी और सी 9 संदर्भ से अनुकूलित कर रहे हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4: वी। पैराहामोलीटिकस के स्वमर सेल में केमोटाक्सिस एरे के स्थानीयकरण। ए ) डीआईसी और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों जंगली-प्रकार वी। पैराहामोलिटिकस स्विर्मर सेल ectopically YFP-CheW व्यक्त ( बी ) ग्राफ़ को वाईफपी-चेड फॉसी डिस्ट्रिब्यूशन द्वारा फॉस्ट की दूरी को सेल डंडे से घूर्णन कोशिकाओं में सेल की लंबाई के एक फ़ंक्शन के रूप में फंसाकर प्रदर्शित किया जाता है। ( सी ) वाई। पीपी-चेड को व्यक्त करने वाले वी। पैराहामोलिटिकस स्विर्मर कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफाइल के जनसांख्यिकीय विश्लेषण कोशिकाओं को सेल की लंबाई के अनुसार सॉर्ट किया जाता है और रिलेश फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रदर्शित होती है। स्केल बार = 5 सुक्ष्ममापी पैनल बी और सी सेरेफरेंस 9 से अनुकूलित किए गए हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
यह पत्र वी। पैराहामोलिटिकस स्विर्मर कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए एक विधि की रिपोर्ट करता है, इसके बाद के अध्ययन के अनुसार, सेल्युलुलर स्थानीयकरण और अध्ययन किए गए फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन की अन्य विशेषताओं को हल करने और मापने के लिए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण किया गया है। हालांकि माइक्रोस्कोपी इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण 14 , 15 , 16 , 17 , 18 के लिए कई उपकरण विद्यमान हैं, वी। पैराहामोलिटिकस झुंड कोशिकाओं का विश्लेषण ज्यादातर चुनौतीपूर्ण है क्योंकि वे आम तौर पर एक घने सेल समुदाय के भीतर मौजूद होते हैं और सेल लंबाई में एक उच्च भिन्नता होती है ( चित्रा 2 )। इसलिए, स्वचालित सेल का पता लगाने कभी-कभी दोषपूर्ण होता है, और इस प्रकार परिणाम कुछ हद तक अविश्वसनीय होते हैं। यह प्रोटोकॉल पाइपलाइन की रूपरेखा तैयार करता है, जो छवि बढ़ती है और वी। पैराहामोलिटिकस के भक्षण कोशिकाओं का विश्लेषण करती है , जो कि युक्ति के अनुरूप हैइन कोशिकाओं की जरूरत है, जैसे कि एक सतह पर नियंत्रित विकास वातावरण और डाउनस्ट्रीम इमेज का विश्लेषण करता है जो चर लंबाई की कोशिकाओं की उपस्थिति को समायोजित करता है जो करीब निकटता में विकसित होते हैं।
प्लाज्मिड से एक प्रोटीन की दिलचस्पी को एक्टोपिक रूप से व्यक्त करने की क्षमता कई प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है, जैसे माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन की अभिव्यक्ति या जीन विलोपन के पूरक। यहां रासायनिक सक्षम कोशिकाओं को तैयार करने और वी। पैराहामोलिटिकस में प्लाज्मिड डीएनए के इलेक्ट्रोपोरेशन की प्रक्रिया को भी वर्णित किया गया है। संयुग्मन पर इलेक्ट्रोपोरेशन का लाभ, जिसे अक्सर वी। पैराहामोलिटिकस के लिए उपयोग किया जाता है, यह है कि संयुग्मन की अनुमति के लिए प्लाज्मिड रीढ़ की आवश्यकता नहीं है। फिर भी, कुछ सावधानी बरतनी चाहिए; जैसा चरण 1.2 में वर्णित है, यह ओडी 600 = 1.0 के सेल घनत्व तक पहुंचने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। कम ऑप्टिकल घनत्व वाले कोशिकाओं पर electroporati पर lyse होगापर और उच्च घनत्व पर प्लाज्मिड कोशिकाओं द्वारा नहीं लिया जाता है। इसके अलावा, वी। पैराहामोलिटिकस कोशिकाओं (चरण 1.4-1.6) के बहुत कठोर केन्द्रित होने से इलेक्ट्रोपायर क्षमता में काफी कमी आएगी। विद्युत-सक्षम कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए धोने के चरणों के दौरान सेल-गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है।
यद्यपि सेल संस्कृति की तैयारी में तुच्छ दिखती है, फिर भी वातावरण में घनत्व बहुत खराब होता है। आम तौर पर, प्रारंभिक घातीय वृद्धि चरण (ओडी 600 <0.5) में एक सेल संस्कृति देर से घातीय या प्रारंभिक स्थिर चरण में एक संस्कृति की तुलना में रातोंरात ऊष्मायन के दौरान एक बड़े झुंड कॉलोनी का उत्पादन करेगी। प्रयोग पर निर्भर करते हुए, एक बड़ा झुंड कॉलोनी फायदेमंद हो सकता है। हालांकि, एक ही HI अगर सजी हुई प्लेट पर उगाई जाने वाली विभिन्न उपभेदों के बीच कॉलोनी विस्तार और आकृति विज्ञान की तुलना करने के लिए, अलग-अलग झुमके वाले कालोनियों के बीच पर्याप्त स्थान उपलब्ध होना महत्वपूर्ण है। यह एच हो सकता हैउच्च ऑप्टिकल घनत्व की एक सेल संस्कृति को खोलकर, जो आम तौर पर छोटे झुमके वाले कालोनियों में परिणाम देगा।
झुकने वाले फेनोटाइप का प्रवर्धन बैक्टीरिया की प्रजातियों में काफी भिन्न होता है और इसके प्रति पुनरुत्पादन क्षमता बहुत महत्वपूर्ण है जैसे कि अगर और पोषक तत्व संरचना, परिवेश का तापमान, और दोनों परिवेश और विकास माध्यम की नमी सामग्री। नतीजतन, प्रोटोकॉल और बाहरी वातावरण में मामूली बदलाव काफी झुंड परख के परिणाम और झुंड भेदभाव का प्रेरण को प्रभावित करते हैं। स्यूडोमोनस एरुगिनोसा और बैसिलस सब्टिलिस जैसे अन्य जीवाणु प्रजातियों के झुकाव को प्रेरित करने के लिए प्रोटोकॉल 19 को सूचित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित कदम भरोसेमंद सेल-प्रकार के वी। पैराहामोलिटिकस का उत्पादन करेंगे और उन्हें स्वाभाविक कालोनियों के रूप में बनाए रखेंगे जो कॉलोनी के किनारे पर एकल स्तरित झुंड के फूलों का उत्पादन करते हैं। स्थिर और प्रदर्शन करने के लिएवी । पैराहामोलीटिकस के झुंड सेल-प्रकार पर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों , HI स्विमिंग अगर प्लेटों की तैयारी इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है। विशेष रूप से, सुखाने के कदम को अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि हर इनक्यूबेटर अलग तरीके से प्रदर्शन करेगा। एक और पहलू जो स्वाभाविक व्यवहार को प्रभावित कर सकता है पेट्री डिश में इस्तेमाल किए गए प्लास्टिक का प्रकार है। हमारी प्रयोगशाला में झरने के प्रयोग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ठेठ पेट्री डिश पोलीस्टायर्न (पीएस) से बने होते हैं। हालांकि, कम घनत्व वाले पॉलीथिलीन (पीई एलडी) से बने पेट्री डिश का उपयोग करते हुए मूसलधारित परिणाम में मिश्रित परिणाम उत्पन्न होते हैं। वर्णित कदमों का पालन करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि केवल तब ही प्रत्यारोपणशील झुमके वाली कॉलोनियां जो अलग-अलग परिधीय भड़कना होती हैं, का निर्माण होता है, जिससे एकल स्वर्मर सेल माइक्रोस्कोपी सक्षम होता है।
निस्संदेह, वी। पैराहामोलिटिकस वार्मिंग कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी अध्ययनों द्वारा प्रदान किए गए परिणामों को प्रदर्शित करने के लिए विभिन्न तरीकों को लिया जा सकता है। इंस्टान के लिएई, व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया कार्यक्रम माइक्रोबाइ ट्रैकर 16 एक सहज विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है हाल ही में उपलब्ध माइक्रोबायट्रेकर एप्लिकेशन, Oufti 20 , जिसमें MATLAB की आवश्यकता नहीं है, यह एक और विकल्प भी है। हालांकि, ओफ्टी में विभेदक अंतरफलक विपरीत (डीआईसी) छवियों का उपयोग संभव नहीं है, और चरण के विपरीत इमेजिंग को थर्मर सेल में सेल सेगमेंटेशन के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, सभी सूक्ष्मदर्शी चरण के विपरीत इमेजिंग के लिए सुसज्जित नहीं हैं और बदले चरण के विपरीत इमेजिंग सभी प्रकार के माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। एक और होनहार उपकरण है, जो मुफ़्त है और छविज-आधारित, माइक्रोबजे 17 है , लेकिन अभी तक केवल चरण के विपरीत और फ्लोरोसेंट छवियों का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल केवल उनके जीवन-चक्र के विशिष्ट समय-बिंदुओं पर इमेजिंग और कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है। हालांकि, समय-चूक इमेजिंग और बाद के चित्र विश्लेषण का वर्णन करने वाला एक उत्कृष्ट प्रोटोकॉल, जो निम्न एकल के लिए अनुमति देता हैकोशिका trajectories और प्रोटीन गतिशीलता 21 को भी वी । पैराहामोलिटिकस पर लागू किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों के बाद, वैज्ञानिकों को वी । पैराहामोलिटिकस के तैराक और तापीय कोशिका-प्रकार दोनों पर विश्वसनीय और पुनः प्रोड्यूबल एकल कोशिका प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी करने में सक्षम होगा। यह प्रोटोकॉल अपने तैराक से वी। पैराहामोलिटिकस को अपने स्विर्मर सेल-प्रकार में बदलने के लिए एक मजबूत तरीका बताता है। एगारोज पैड पर झुकाव वाले कॉलोनियों के परिधीय ज्वारों से घिरने वाले कोशिकाओं के मोनोलायर को सुधारने से, प्रोटीन के इंटरेसेल्युलर स्थानीयकरण को देखा जा सकता है, छवि विश्लेषण के लिए पाइप लाइन को अन्य जीवाणु प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है जो कि जीवाणु समुदायों में मौजूद होते हैं जहां कोशिकाएं बढ़ती हैं बहुत करीब निकटता और परिस्थितियों में स्वचालित छवि विश्लेषण एक लाभ के लिए नहीं हो सकता है।
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Disclosures
ब्याज के कोई संघर्ष घोषित नहीं हुआ।
Acknowledgments
यह काम मैक्स प्लैंक सोसाइटी द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
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