Summary
Этот протокол позволяет одноклеточную микроскопию дифференциально различающихся пловцов Vibrio parahaemolyticus и роевых клеток. Этот метод дает популяцию клеток рояля, легко доступную для анализа одной клетки, и охватывает подготовку клеточных культур, индукцию дифференциации роянов, подготовку образцов и анализ изображений.
Abstract
Способность изучать внутриклеточную локализацию белков имеет важное значение для понимания многих клеточных процессов. В свою очередь, это требует способности получать отдельные клетки для флуоресцентной микроскопии, что может быть особенно сложным при визуализации клеток, которые существуют в сообществах бактерий. Например, человеческий патоген Vibrio parahaemolyticus существует в виде коротких стержнеобразных пловчих клеток в жидких условиях, которые при поверхностном контакте дифференцируются в субпопуляцию сильно вытянутых клеток рояля, специализированных для роста на твердых поверхностях. В данной статье представлен метод проведения одноячеистого флуоресцентного микроскопического анализа V. parahaemolyticus в двух его дифференциальных состояниях. Этот протокол очень воспроизводимо индуцирует дифференциацию V. parahaemolyticus в жизненный цикл свиной клетки и облегчает их пролиферацию на твердых поверхностях. Этот метод дает вспышки дифференцированных клеток рояля, простирающихся от tОн - край стаи-колонии. Примечательно, что на самом кончике роевых вспышек ячейки рояля существуют в одном слое клеток, что позволяет легко переносить их на предметный стек микроскопа и последующую флюоресцентную микроскопию изображений отдельных клеток. Кроме того, представлен рабочий процесс анализа изображений для демографического представления бактериальных обществ. В качестве доказательства принципа описан анализ внутриклеточной локализации хемотаксисных сигнальных массивов в клетках пловца и свиньи V. parahaemolyticus.
Introduction
Бактерии постоянно испытывают изменения в своей внешней среде и разработали несколько методов изменения и адаптации своего поведения. Один из таких механизмов включает дифференциацию в различные типы клеток, которые лучше дополняют измененную среду. Дифференциация часто включает в себя значительные изменения в регуляции клеточного цикла, морфологии клеток и пространственно-временную организацию клеток. Один организм, который может дифференцироваться, - Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus принадлежит к Vibrionaceae , который является семейством протеобактерий, которые обычно обитают в пресной или соленой воде. Vibrionaceae широко распространены в окружающей среде и включают в себя несколько видов, которые вызывают инфекции кишечного тракта у людей, в том числе Vibrio cholerae.В. Parahaemolyticus - диморфный организм и способен дифференцироваться в два разных типа клеток в ответ на изменение егоВнешняя среда. В водных средах он существует как короткая стержнеобразная плоская клетка с одиночным полярным жгутиком, расположенным на старом полюсе клетки. При поверхностном контакте запускается дифференциация в рояльную клетку. Дифференциация клеток Swarmer включает в себя два основных изменения: морфогенез стайчатых клеток через торможение клеточного деления и индукцию второй системы жгутиков. Это приводит к формированию перифричной и сильно вытянутой палочковидной рояльной клетки, которая может либо продолжить образ жизни рояля, где события деления приводят к появлению клеток рогатого потомства, либо, альтернативно, дифференцируются обратно в клетки пловца.
Сообщалось о нескольких факторах, вызывающих или влияющих на дифференцировку рояля. Первичный стимул, по-видимому, управляется механосенсингом, где V. parahaemolyticus использует полярный жгутик в качестве тактильного датчика, который обнаруживает ингибирование вращения при поверхностном контакте, но некоторые другие факторы задействованы в качествеСкважина 1 . В лаборатории вращение полярного жгутика может быть искусственно ингибировано добавлением фенамила, который блокирует вегетарианное вращение натриевого канала, тем самым вызывая дифференцировку рояля 2 . Кроме того, в более раннем исследовании Vibrio alginolyticus был индуцирован для роения на твердых средах, когда клетки размножались на ростовой среде в чашке Петри, запечатанной прозрачной пластиковой лентой. Насыщенная щелочью фильтровальная бумага препятствовала роению в этих условиях, поэтому предполагалось, что одна или несколько летучих кислот могут участвовать в индукции роения. Таким образом, герметизация чашки Петри пластиковой лентой, вероятно, позволила накапливать летучие кислоты, образующиеся в качестве побочных продуктов клеточного метаболизма, в пределах свободного пространства пластины. Тот же эффект был достигнут, когда H 2 O 2 был добавлен к ростовой среде в незапечатанных чашках Петри для искусственного получения летучих кислот путем гидролиза компонентов среды
V. parahaemolyticus дифференцировка включает в себя значительные изменения в регуляции клеточного деления, клеточной морфологии и позиционирования макромолекулярных машин, таких как flagellА и хемотаксис - процессы, для которых все требуют специфической локализации белков в соответствии с клеточным циклом. Таким образом, способность изучать внутриклеточную локализацию таких белков является существенной для понимания вышеупомянутых клеточных процессов. Для проведения таких исследований требуется флуоресцентная микроскопия на отдельных клетках. Это может быть особенно сложным при визуализации клеток, которые существуют в плотных бактериальных популяциях, как это имеет место для роевых клеток. Были попытки побудить дифференцировку рояля в жидких средах, которые могли бы потенциально генерировать отдельные клетки для микроскопических исследований. И хотя на уровне транскрипции эти клетки частично индуцировали программу размножения рояликов, они не подвергаются таким же отчетливым морфологическим изменениям, как полностью дифференцированные клетки свиньи, выращенные на твердой среде 8 . Эта статья предлагает надежный и воспроизводимый протокол метода, чтобы вызвать ройер се11 на поверхности агара. Протокол дает популяцию легкодоступных клеток свиньи, легко доступных для одноэлементной микроскопии и последующего анализа. Кроме того, протокол позволяет провести локализацию флуоресцентно меченых белков как в клетках пловец, так и в рояльных клетках (разделы 1, 2, 3, 4). Кроме того, протокол описывает последующий рабочий процесс о том, как обрабатывать и анализировать сгенерированные данные из экспериментов по флуоресцентной микроскопии, что позволяет проводить демографический анализ бактериальных сообществ (раздел 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение электро-компетентных клеток V. parahaemolyticus и электропорация плазмидной ДНК в клетках пловец
ПРИМЕЧАНИЕ. В следующем разделе протокола допускается подготовка электрокомпетентных клеток и последующая электропорация плазмидной ДНК в клетках пловец. Этот этап важен, если флуоресцентные белки эктопически экспрессируются из плазмиды.
- Вычерпывают клетки V. parahaemolyticus из запаса глицерина -80 ° С на свежий пластинчатый агар LB, содержащий 100 мкг / мл ампициллина, и инкубируют в течение ночи при 37 ° C.
- На следующий день инокулируют 200 мл среды LB одной колонией V. parahaemolyticus и инкубируют ее при 37 ° С в условиях встряхивания до достижения OD 600 1,0. Обычно для культивирования клеток требуется 5-6 ч инкубации, чтобы достичь желаемой оптической плотности.
- Немедленно переносите клетки на лед и очищайтеВсе дальнейшие этапы на льду и в предварительно охлажденных центрифугах с температурой 4 ° C.
- Убирают клетки при 4 ° С в течение 10 мин при 2000 х g.
- Отбрасывают супернатант декантацией и повторно суспендируют осадок клеток в 25 мл ледяного 273 мМ раствора сахарозы (рН 7,4, забуференный KOH).
- Урожай клетки снова при 4 ° С в течение 10 мин при 2000 х g. Повторите два раза.
- Повторно суспендируйте промытый осадок клеток в 400 мкл ледяного 273 мМ раствора сахарозы. Затем добавляют глицерин до конечной концентрации 15 об.% / Об. Клетки теперь готовы для электропорации, но также могут быть заморожены в аликвотах 70 мкл при -80 ° C для последующего использования.
- Для электропорации смешать 70 мкл аликвоту электрокомпетентных клеток с 100-1000 нг плазмидной ДНК и перенести смесь в ледяную кювету для электропорации (0,2 см электродный зазор). Выполните электропорацию со следующими настройками: 25 мкФ, 2400 В и 200 Ом.
- Приостановить действиеКлеток в кювете для электропорации в 600 мкл бульона LB, переносят в пробирку объемом 2 мл и инкубируют при встряхивании при 37 ° С в течение 3 часов.
- Спином вниз клеток на 2000 мкг в течение 5 мин и повторно суспендирования гранул в 100 мкл бульона LB. Распределить клеточную суспензию на селективные пластины агара LB, содержащие необходимые антибиотики, и инкубировать при 37 ° С в течение ночи.
- На следующий день проверьте пластины для образования колонии. Колонии, которые растут, несут правильный ген устойчивости к антибиотикам, кодируемый на плазмиде, и могут теперь использоваться для дальнейших экспериментов.
2. Индукция дифференциации клеток рояля
ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие этапы описывают, как вызвать дифференцировку V. parahaemolyticus в его жизненный цикл рояльной клетки и как стимулировать пролиферацию на твердых поверхностях.
- Приготовьте 4 г агара Heart Infusion (HI) в 100 мл ddH 2 O, чтобы подготовить ротационные пластины.
- Тщательно кипятите раствор HI-агара в микроволновой печи и время от времени встряхивайте бутылку до растворения порошка. Автоклав при 121 ° С в течение 20 мин.
- После автоклавирования охлаждают агар HI до 60-65 ° C. Добавить 2,2'-бипиридил до конечной концентрации 50 мкМ (исходный раствор 50 мМ в 100% этаноле). Добавить CaCl 2 до конечной концентрации 4 мМ (исходный раствор 4 М в ddH 2 O). Если необходимо, добавьте антибиотики в раствор для поддержания плазмид.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если вы планируете использовать индуцибельную плазмиду, добавьте индуцирующий агент к ее конечной концентрации.
ОСТОРОЖНО: 2,2'-Бипиридил: Острая токсичность (устные, кожные, ингаляционные). При работе с этим химикатом пользуйтесь перчатками и защитными очками. - Налейте 30 - 35 мл конечного раствора агара HI в круглую 150 - миллиметровую чашку Петри и дайте агару затвердеть.
- Прямо перед культивированием культуры клеток высушите чашку с агаром при 37 ° С в течение не менее 10 мин (или пока не останутся какие-либо жидкие остаткиНо не более) вверх-вправо с открытой крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ. Время высыхания сильно зависит от используемого инкубатора, и сильно высушенные пластины не позволят роиться V. parahaemolyticus . (Этот шаг очень важен!) Плиты должны быть свежими и не старше 2 - 3 часов. Старые пластины будут слишком сухими, чтобы стимулировать роение. - Прививают небольшое количество клеток от края одной колонии в 5 мл бульона LB. Инкубируйте культуру, встряхивая при 37 ° С до достижения OD 600 = 0,8, обычно это занимает 2-3 часа. После этого клетки готовы к нахождению на агаровых пластинках HI с копотью.
- Пятна 1 мкл клеточной культуры в центре комара HI-агара ( рис. 1А ).
- Дайте пятно высохнуть ( рис. 1B ).
- Заклейте пластину прозрачной пластиковой лентой и убедитесь, что она прочно прикреплена, иначе она может отсоединиться во время ночной инкубации ( рис. 1С ).
ПРИМЕЧАНИЕ.Очень важно, чтобы печать была совершенной. Избегайте образования воздушных пузырьков и складок на ленте при ее применении. - Инкубируйте планшет при 24 ° С в течение ночи. Это приведет к формированию стайной колонии V. parahaemolyticus с роевыми вспышками, идущими от периферии роевой колонии ( рис. 2 ).
3. Приготовление клеток рояля V. parahaemolyticus для флуоресцентной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ. В нижеследующем протоколе описывается, как приготовить микроскопические слайды агарозы и последующий отпечаток вспыхивающих вспышек на агарозной подушке для получения одиночных клеток рояля для микроскопии.
- Для приготовления агарозных слайдов для микроскопии добавляют 1 г агарозы к 100 мл 20% об. / Об. PBS и 10% об. / Об. LB бульонного раствора. Тщательно кипятите раствор в микроволновой печи для растворения агарозы и дайте ей остыть до 65-70 ° C при смешивании с магнитной мешалкой.
- Место переменного токаНежирный микроскоп скользит на совершенно ровную часть рабочего стола. Обрежьте оба конца слайда двумя слоями лабораторной маркировочной ленты общего назначения, фиксируя предметное стекло на рабочем столе. Расстояние между двумя частями ленты должно составлять около 3 см.
ПРИМЕЧАНИЕ. Два слоя ленты создают очень маленькую отметку, которая определит высоту агарозной прокладки. Важно, чтобы рабочее пространство было ровным, чтобы клетки были в одной плоскости для микроскопического анализа. - Налейте ~ 250 мкл ранее приготовленного раствора агарозы на незакрытую стеклянную поверхность.
- Теперь поместите второй слайд микроскопа в той же ориентации, что и нижний сверху, и слегка нажмите на него, чтобы остаточная агароза могла вытекать в стороны.
- Дайте агарозе затвердеть 1-2 минуты, а затем медленно потяните верхний предметный стекол от нижнего горизонтальным движением.
- Используя скальпель, отрежьте любую остаточную агарозу, которая прикреплена кСтороны слайда микроскопа и медленно удалите ленту с концов предметного стекла микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ. Слайд агарозы теперь готов и должен использоваться как можно скорее, так как он постепенно начнет высыхать. - Чтобы выполнить микроскопию на клетках рояля, вырежьте кусочек агара размером ~ 3 мм × 10 мм с самого внешнего края колошниковой колонии ( рис. 1D ). Очень важно не разрывать ленточное уплотнение рояльной пластины до тех пор, пока непосредственно перед переносом клеток рояля на предметное стекло микроскопа. После того как лента удалена, роившиеся клетки V. parahaemolyticus инициируют дифференцировку в клетки пловца.
ПРИМЕЧАНИЕ. Обязательно направляйте срезы с внешней стороны края колонии колонии внутрь колонии ( рис. 1D ). Таким образом, вы можете предотвратить «загрязнение пловца» в краю колошниковой колонии. - Перенесите кусок рояного агара на предметное стекло с агарозой для микроскопа и клетки, обращенные к агарозе.D ( фиг. 1E ). Это отпечатывает роющие клетки на агарозную подушку.
- Подождав ~ 30 с, аккуратно снимите агаровый кусочек с агарозной подушки ( рис. 1F ).
- Поместите покровное стекло на агарозную подушку, где отпечатаны клетки. Клетки теперь готовы к микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ. Важно сразу же отображать клетки рояля, так как клетки рояли медленно начинают дифференцировать состояние пловца.
4. Получение V. parahaemolyticus Plimmer Клеточные культуры для флуоресцентной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ. В этом разделе протокола описывается, как подготовить культуру V. parahaemolyticus для проведения флуоресцентной микроскопии на клетках типа пловца.
- Прививают небольшое количество клеток от края одной колонии в 5 мл бульона LB. Инкубируйте культуру, встряхивая при 37 ° С в течение 1 ч или пока не станет видно небольшое увеличение клеток.
- ВНа этой стадии, если необходимо, добавляют стимулирующий агент для экспрессии представляющих интерес белков. В этом примере L-арабинозу добавляли до конечной концентрации 0,2% (мас. / Об.), Чтобы индуцировать экспрессию YFP-CheW 9 .
- Инкубируйте культуру, встряхивая еще 2 ч при 37 ° С.
- Выполните шаги 3.1-3.7, чтобы приготовить микроскопические агарозные слайды.
- Пятна 1 мкл культуры клеток в центре площадки агарозы и позволить пятно инкубировать, пока он не высохнет.
- Поместите покровное стекло на агарозную подушку, где были замечены клетки. Клетки теперь готовы к отображению под флуоресцентным микроскопом.
5. Анализ изображений
Эта часть протокола описывает рабочий процесс анализа изображений, в частности, как извлекать данные флуоресценции одиночных ячеек для демографического анализа.
- Перед началом анализа изображения убедитесь, что все изображения микроскопии сохранены в 16-битном формате TIF,
- Загрузите DIC (или фазовый контраст) и соответствующие изображения флуоресцентного канала в программное обеспечение.
- Создайте оверлейное изображение обоих каналов, выбрав «Отобразить / Наложить изображения». Установите количество изображений («# Images:») на два и выберите изображение DIC в первом канале и флуоресцентное изображение во втором канале.
- Выберите инструмент «Multi-Line» на панели инструментов и отметьте ячейки от одного полюса до другого через середину ячейки. Чтобы получить список всех сгенерированных линий (линейных объектов), откройте «Измерение / измерение области». Настройте измерения региона, чтобы отображать только метку области, расстояние и среднюю интенсивность.
- Откалибруйте размер пикселя в разделе «Измерение / Калибровка расстояний» до размера пикселя, который является специфическим для вашей настройки микроскопа, и нажмите «Применить ко всем открытым изображениям».
- Перенесите все регионы (линейные объекты) на изображение флуоресцентного канала. В разделе «Регионы / трансферы»Er Регионы "выберите исходное изображение (оверлейное изображение) и конечное изображение (изображение флуоресцентного канала). Выберите« Все регионы »и нажмите« OK ».
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы позднее можно было повторно создавать точные строки (линейные объекты, области, ROI), откройте «Регионы / Сохранить регионы» и сохраните регионы. - Экспортируйте все измерения области в электронную таблицу, открыв «Measure / Region Measurements» и нажав «Open Log». Подтвердите открытие и экспорт данных. Как только электронная таблица откроется в фоновом режиме, окончательно экспортируйте данные, нажав «F9: Данные журнала».
- Чтобы определить положение флуоресцентных фокусов вдоль ячейки, откройте «Measure / Linescan». Установите для параметра «Ширина линии» значение так, чтобы вся ширина ячейки была покрыта областью, которую вы ранее создали. Щелкните правой кнопкой мыши график линейного сканирования и выберите «Показать данные графика». Щелчком левой кнопки мыши и перетаскиванием курсора мыши вдоль линии сканирования наТочки интереса, в окне «Графические данные» отобразится соответствующий пиксель / расстояние между двумя точками. Выберите синюю выделенную строку, а затем скопируйте содержимое.
ПРИМЕЧАНИЕ. Весь профиль интенсивности линейного сканирования можно записать в электронную таблицу, нажав «Log Data» в окне «Linescan». Извлеченные данные теперь можно использовать для визуализации на графиках или дальнейшего статистического анализа. Образцы локализации над клеточным циклом можно легко визуализировать в демографическом представлении длины клетки и интенсивности флуоресценции вдоль тела клетки. Эти представления могут быть получены с использованием той же выбранной ранее ROI. Следующие шаги приведут пример того, как создавать демографические данные, аналогичные тем, которые показаны на рисунках 3C и 4C .- В графических областях области загрузки Fiji / ImageJ (.rgn), ранее созданных в программном обеспечении (шаг 5.6), с использованием «Metamorph nd и импортера файлов ROI»;. Альтернативно, представляющие интерес области (ROI) анализируемых ячеек могут быть созданы непосредственно в Фиджи / ImageJ с помощью встроенного инструмента «Сегментированная линия».
- Откройте «Analyze / Tools / ROI manager» и пометьте все активные записи списка ».
- После этого нажмите «More / Multi Plot», а затем выберите «Список» в новом окне «Multi Plot». Нажмите на запись в таблице, затем выберите и «скопируйте все». Затем вставьте в новую таблицу.
ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, что данные самой длинной ячейки (двух соответствующих столбцов X и Y с наибольшим количеством строк) являются последними справа в электронной таблице. - Сохраните электронную таблицу как «CSV (с разделителями-запятыми) (* .csv)».
- Скачайте R-скрипты отсюда «https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles» 10. Сценарии сортируют ячейки по длине и нормализуют профили интенсивности флуоресценции всех клеток как среднее значение флуоресценции каждой клеткие.
- Запустите весь сценарий «профили ячеек function.R» в R [версия 3.0.1; 11 ].
- Отредактируйте сценарий «example plots.R» в строке 30 так, чтобы путь к файлу ссылался на папку, в которой сохранен ранее созданный CSV-файл. Кроме того, измените имя файла «profile.csv» в строке 31 на имя файла, выбранного для .csv-файла, сгенерированного на шаге 5.9.4. Затем запустите «example plots.R» и следуйте документации из «https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles», а также комментарии из файла сценария для демографического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Индукция дифференцировки и генерация колонии роя
На рисунке 1 представлена схема важных этапов, связанных с получением рояльных колоний V. parahaemolyticus ( Рисунок 1A-C ). Культуру пловца определяли на рожковом агаре и инкубировали при 24 o C, вызывая размножение и пролиферацию рояна по поверхности твердого агара. На рис. 2 представлен репрезентативный стереомикроскопический образ колонистой колонии. Стерео-микроскопическое изображение ясно показывает вспышки роя, распространяющиеся за пределы периферии роя-колонии. Более высокое увеличение показывает, что в рояльных вспышках клетки группируются только в моно- или двуслойных слоях, тогда как в середине клетки роя-колонии сложены в несколько слоев ( рис. 2А ). Swarm-вспышки могут быть легко перенесены (как описано в шагах 3.8-3.11,
Флуоресцентная микроскопия и анализ изображений
Рисунок 1: Индукция дифференциации Swarmer и подготовка клеток для микроскопии изображений. Упрощенная визуализация рабочего процесса для создания рояльных клеток V. parahaemolyticus и подготовка микроскопов для микроскопического анализа одиночных клеток рояля. ( A ) Мелкий 1 мкл OD 600 = 0,8 клеточной культуры V. parahaemolyticus в центре чашечки HI агара. ( B ) Инкубируйте пятно, пока оно не высохнет, и клетки будут прикреплены к поверхности агара. ( C ) Заклейте чашку Петри прозрачной лентой. Инкубируйте планшет при 24 ° C в течение 16 часов. ( D ) Аккуратно вырезать небольшой кусочек агара HI с внешнего края колошниковой колонии. ( E ) Переносите вырезание на micrOscopy агарозную подушечку с клетками свиньи, обращенными к агарозной подушке. После короткого времени инкубации в 30 с клетки роймера впечатывают в агарозную прокладку. ( F ) Осторожно удалите вырезанный агар из прокладки агарозы и поместите покровное стекло в микроскоп. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Организация клеток в колонии V. parahaemolyticus Swarming . ( A ) Стереомикроскопия колонии рояля V. parahaemolyticus . Верхние панели отображают внешний край колошниковой колонии с увеличением увеличения. На нижних панелях увеличена степень увеличения колориметрической зоны между центром и краем. Рояльные вспышки простираются от периферииРоя-колония. ( B ) Изображения микроскопии DIC на краю колонны рояля (верхняя панель) и область между центром и периферией (нижняя панель) после переноса клеток из соответствующих указанных мест колонии колонии. Рояльные вспышки отпечатывались непосредственно на микроскопическую агарозную подушку, как описано в шагах 3.8-3.11. Клетки из области между центром и периферией сначала очищали от колонии роя и ресуспендировали в бульоне LB перед тем, как были замечены на микроскопической агарозной подушке. Масштабный стержень = 7,5 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Локализация массивов хемотаксиса в пловчих клетках V. parahaemolyticus. ( A ) DIC и флуоресцентной микроскопии клеток пловца V. parahaemolyticus дикого типа, эктопически экспрессирующих YFP-CheW. ( B ) График, отображающий распределение фокусов YFP-CheW, путем построения графика расстояний фокусов от полюсов клеток в зависимости от длины клетки в клетках пловца. ( C ) Демографический анализ профилей интенсивности флуоресценции пловчих клеток V. parahaemolyticus , экспрессирующих YFP-CheW. Клетки сортируются по длине ячейки и отображают относительную интенсивность флуоресценции. Шкала шкалы = 5 мкм. Группа B и C адаптированы из ссылки 9 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Локализация массивов хемотаксиса в роговых клетках V. parahaemolyticus. A ) DIC и изображения флуоресцентной микроскопии клеток рояля дикого типа V. parahaemolyticus , эктопически экспрессирующих YFP-CheW. ( B ) График, отображающий распределение фокусов YFP-CheW, путем построения графика расстояний фокусов от полюсов ячейки в зависимости от длины ячейки в ячейках рояля. ( C ) Демографический анализ профилей интенсивности флуоресценции рояльных клеток V. parahaemolyticus , экспрессирующих YFP-CheW. Клетки сортируются по длине клетки и отображают относительную интенсивность флуоресценции. Шкала шкалы = 5 мкм. Панель B и C адаптированы из ссылки 9 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описывается метод микроскопии изображений рояльных клеток V. parahaemolyticus с последующим анализом, направленным на разрешение и количественную оценку субклеточной локализации и других особенностей изученных флуоресцентно меченных белков. Хотя существуют несколько инструментов для обработки и анализа изображений микроскопов 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , анализ VAR- клеток parahaemolyticus остается сложным в основном из-за того, что они обычно существуют в плотном клеточном сообществе, и существует высокая вариабельность длины клеток ( Рисунок 2 ). Поэтому автоматическое обнаружение ячеек иногда ошибочно, и, следовательно, результаты несколько ненадежны. Этот протокол описывает конвейер , предназначенный для выращивания , изображения и анализа роящихся клеток V. parahaemolyticus , который адаптирован к спецификацииКак контролируемая среда роста на поверхностном и последующем анализе изображений, которые учитывают наличие клеток переменной длины, которые растут в непосредственной близости.
Способность эктопически экспрессировать представляющий интерес белок из плазмиды может быть важна для нескольких экспериментов, например экспрессии флуоресцентно меченных белков для микроскопических исследований или комплементации делеционных генов. Здесь также описан процесс получения химически компетентных клеток и электропорации плазмидной ДНК в V. parahaemolyticus. Преимущество электропорации над конъюгированием, которое часто используется для V. parahaemolyticus , состоит в том, что плазмидная основа не нуждается в модификации, чтобы разрешить конъюгацию. Тем не менее, некоторые меры предосторожности должны быть приняты; Как описано в шаге 1.2, очень важно достичь плотности ячейки OD 600 = 1.0. При более низких оптических плотност х клетки будут лизировать электропоратиНа и при более высоких плотностях плазмида не поглощается клетками. Более того, слишком резкое центрифугирование клеток V. parahaemolyticus (шаги 1.4-1.6) резко снизит эффективность электропорации. Также важно тщательно повторно суспендировать осадок клеток во время стадий промывки для получения электрокомпетентных клеток.
Хотя приготовление клеточной культуры кажется тривиальным, плотность культуры очень важна для достижения роения. Как правило, клеточная культура на ранней фазе экспоненциального роста (OD 600 <0,5) будет давать большую колористую колонию во время инкубации в течение ночи, чем культура в поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазе. В зависимости от эксперимента большую колористую колонию может быть полезно. Однако, чтобы сравнить экспансию и морфологию колоний между различными штаммами, выращенными на одной и той же планшете HI-агарового агара, важно иметь достаточное пространство между отдельными колористыми колониями. Это может бытьТ. Е. Выявляя клеточную культуру с более высокой оптической плотностью, которая обычно приводит к меньшим колониям колонии.
Индукция рояного фенотипа значительно варьирует среди видов бактерий, и на воспроизводимость этого сильно влияют такие факторы, как состав агара и питательных веществ, температура окружающей среды и содержание влаги в окружающей среде и среде роста. Следовательно, незначительные изменения в протоколе и внешней среде существенно влияют на результаты анализа роя и индукцию дифференциации роя. Сообщалось о протоколах, вызывающих роение других видов бактерий, таких как Pseudomonas aeruginosa и Bacillus subtilis 19 . Шаги, описанные в этом протоколе, надежно продуцируют роговую клетку V. parahaemolyticus и сохраняют их в виде роющих колоний, которые производят однослойные скользящие вспышки на краю колонии. Для выполнения стабильных иВоспроизводимые эксперименты на рояльной клетке типа V. parahaemolyticus , подготовка агаровых пластин HI-рояля является наиболее важной частью этого протокола. В частности, этап сушки может потребовать оптимизации, поскольку каждый инкубатор будет работать по-разному. Другим фактором, который может повлиять на поведение рояля, является тип пластмасс, используемых в чашках Петри. Типичные блюда Петри, используемые в нашей лаборатории для проведения экспериментов с копотью, изготовлены из полистирола (PS). Однако использование чашек Петри, изготовленных из полиэтилена низкой плотности (PE LD), приводило к смешанным результатам в анализах роения. Крайне важно следовать описанным этапам, потому что только тогда будут сформированы воспроизводимые колористые колонии, которые проявляют отчетливое периферическое образование вспышек, что позволяет проводить микроскопию одиночной микроскопии.
Несомненно, могут быть использованы различные подходы для отображения результатов флуоресцентных микроскопических исследований рояльных клеток V. parahaemolyticus . Для экземпляраE, широко используемая программа MicrobeTracker 16 представляет собой правдоподобную альтернативу. Недавно появившееся приложение MicrobeTracker Oufti 20 , которое не требует MATLAB, также является еще одной альтернативой. Однако использование изображений с дифференциальным интерфейсом контраста (DIC) невозможно в Oufti, и визуализация с фазовым контрастом не подходит для выделения сегментации ячеек в ячейках рояля. Кроме того, не все микроскопы оборудованы для получения изображений с фазовым контрастом, и, в свою очередь, изображения фазового контраста не подходят для всех видов микроскопического анализа. Другим перспективным инструментом, который является бесплатным и основанным на ImageJ, является MicrobeJ 17 , но опять же можно использовать только фазовый контраст и флуоресцентные изображения. Кроме того, этот протокол позволяет только визуализацию и анализ ячеек в определенные моменты времени их жизненного цикла. Тем не менее, отличный протокол, описывающий покадровое изображение и последующий анализ изображений, который позволяет использовать один синглКлеточные траектории и динамика белка 21, вероятно, также могут быть применены к V. parahaemolyticus .
Следуя шагам, описанным в этом протоколе, ученые смогут выполнять надежную и повторно воспроизводимую одноячеечную флуоресцентную микроскопию как на пловец, так и на рояльную клетку V. parahaemolyticus . Этот протокол описывает надежный способ трансформировать V. parahaemolyticus из своего пловца в свой тип клеток роя . При впечатывании монослоя роясных клеток из периферийных вспышек колонистых колоний на площадку агарозы можно наблюдать внутриклеточную локализацию белков, трубопровод для анализа изображений, вероятно, может быть применен к другим бактериальным видам, которые существуют в сообществах бактерий, где клетки растут Очень близкая близость и ситуации, когда автоматизированный анализ изображений может оказаться нецелесообразным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов не объявлен.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана обществом Макса Планка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
