Summary
このプロトコールは、差異的に異なる腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）スイマーおよびスマーマー細胞の単一細胞顕微鏡検査を可能にする。この方法は、単細胞分析のために容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生し、細胞培養の調製、スマーマー分化の誘導、試料調製および画像分析を包含する。
Abstract
タンパク質の細胞内局在を研究する能力は、多くの細胞プロセスの理解に不可欠です。これは、蛍光顕微鏡検査のための単一細胞を得る能力を必要とし、細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。例えば、ヒト病原体Vibrio parahaemolyticusは、表面接触時に固体表面上での増殖に特化した非常に細長いスマーマー細胞の亜集団に分化する液体状態の短い棒状のスイマー細胞として存在する。本稿では、 V.parahaemolyticusの 2つの異なる状態における単一細胞蛍光顕微鏡分析を行う方法を提示する。このプロトコールは、V.parahaemolyticusのスワマー細胞ライフサイクルへの分化を非常に再現性よく誘導し、固体表面上でのそれらの増殖を促進する。この方法は、tから伸びる分化したスマーマー細胞のフレアを生成する群れコロニーの縁である。注目すべきは、群れのフレアの先端では、スワマー細胞が細胞の単一層内に存在し、顕微鏡スライドおよびその後の単一細胞の蛍光顕微鏡画像化への容易な移行が可能になることである。さらに、細菌学の人口学的表現のための画像分析のワークフローが提示されている。原理の証明として、V.parahaemolyticusのスイマーおよびスマーマー細胞における走化性シグナル伝達アレイの細胞内局在の分析が記載されている。
Introduction
細菌は、常に外部環境の変化を経験し、それに応じて行動を変化させ適応させるためのいくつかの技術を開発してきた。そのような機構の1つは、変化した環境をよりよく補う別個の細胞型への分化を含む。分化は、しばしば、細胞周期の調節、細胞形態学、および細胞の時空間組織化における主要な変化を伴う。分化を受けることができる1つの生物は、腸炎ビブリオである 。 V.parahaemolyticusはVibrionaceaeに属し、これは通常新鮮なまたは塩水に棲むプロテオバクテリアのファミリーである。 Vibrionaceaeは環境に広く分布しており、Vibrio cholerae.Vを含むヒトに腸管感染を引き起こすいくつかの種を含む。腸炎菌は二形性生物であり、その変化に対応するための応答として2つの異なる細胞型に分化することができる外部環境。水性環境では、それは古い棒状のスイマー細胞として存在し、単一の極性鞭毛が古い細胞極に位置する。表面が接触すると、スマーマーセルへの分化が引き起こされる。スワマー細胞の分化には、2つの大きな変化が含まれる：細胞分裂の阻害によるスワマー細胞の形態形成、および第2の鞭毛系の誘導。この結果、蠕虫状の非常に細長い棒状のスマーマー細胞が形成され、スマーマーライフスタイルを続けることができ、分裂イベントは後代のスマーマー細胞を生じるか、または代わりにスイマー細胞に分化する。
スウォーマーの分化を誘導または影響するいくつかの因子が報告されている。一次刺激は、 V.腸炎菌が表面接触時の回転の阻害を検出する触覚センサとして極性鞭毛を使用するメカノセンシングによって駆動されると思われるが、他のいくつかの要因がウェル1 。実験室では、フェナミルを添加することにより、極性鞭毛の回転を人為的に阻害することができます。フェナミルは、ナトリウムチャネル駆動の鞭毛回転を阻止し、それによりスワマー分化を誘発します2 。さらに、初期の研究では、細胞を透明なプラスチックテープでシールしたペトリ皿中で増殖培地上で増殖させると、 ビブリオ・アルギノリチカスは固体培地上に集まるように誘導された。アルカリ性の濾紙は、これらの条件下での群れを防ぎ、したがって、1つまたは複数の揮発性酸が群れ誘導に関与している可能性があることを示唆している。従って、プラスチックテープでペトリ皿を密封することは、プレートのヘッドスペース内で、細胞代謝の副生成物として形成される揮発性酸の蓄積を可能にする可能性が高い。培地成分を加水分解することによって人工的に揮発性酸を生成するために、シールされていないペトリ皿中で増殖培地にH 2 O 2を添加した場合にも同じ効果が達成された
V.腸炎ビブリオの分化は、細胞分裂、細胞形態の調節、および鞭毛のような巨大分子機械の配置における主要な変化を伴うaおよび走化性装置 - 細胞周期に従ってタンパク質の特異的局在を必要とするプロセス。従って、このようなタンパク質の細胞内局在を研究する能力は、前述の細胞プロセスの理解に必須である。そのような研究を行うためには、単一細胞に対する蛍光顕微鏡法が必要である。これは、スマーマー細胞の場合のように、高密度細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。顕微鏡検査のために単一細胞を潜在的に生成する可能性がある液体培地中のスマーマー分化を誘導する試みがなされている。そして、転写レベルでは、これらの細胞は部分的にスワマー分化プログラムを誘導したが、固体培地上で増殖させた完全に分化したスマーマー細胞と同じ形態変化を受けなかった8 。この論文は、スワーマーを誘発する方法の堅牢で再現性のあるプロトコルを提供する寒天表面での分化。プロトコールは、単一細胞顕微鏡法およびその後の分析のために容易に入手可能な容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生する。さらに、このプロトコールは、スイマー細胞およびスワマー細胞型（セクション1,2,3,4）の両方において蛍光標識タンパク質の局在化研究を可能にする。さらに、このプロトコルは、細菌顕微鏡の人口統計的分析を可能にする蛍光顕微鏡検査（セクション5）から生成されたデータを処理および分析する方法に関する後続のワークフローを記述する。
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Protocol
1.エレクトロコンピテントV.腸炎ビブリオ菌細胞の調製およびスイマー細胞へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション
注記：プロトコルの次のセクションでは、エレクトロコンピテント細胞の調製とその後のスイマー細胞へのプラスミドDNAのエレクトロポレーションが可能です。蛍光タンパク質がプラスミドから異所的に発現される場合、この工程は重要である。
- 100μg/ mLのアンピシリンを含有する新鮮なLB寒天プレート上に-80℃のグリセロールストックからのV.parahaemolyticus細胞をストリークし、37℃で一晩インキュベートする。
- 翌日、200mLのLB培地にV.parahaemolyticusの単一コロニーを接種し、振盪条件下でOD 600が1.0に達するまで37℃でインキュベートする。それは、細胞培養物が所望の光学濃度に達するために通常5〜6時間のインキュベーションを要する。
- 直ちに細胞を氷上に移し、perf氷上で4℃の予冷した遠心分離機でさらにすべてのステップを行う。
- 細胞を4℃で10分間2,000 x gで収穫する。
- デカンテーションにより上清を捨て、25mLの氷冷273mMスクロース溶液（pH7.4、KOHで緩衝化した）に細胞ペレットを再懸濁する。
- 4℃で10分間、2000×gで細胞を再度採取する。さらに2回繰り返します。
- 洗浄した細胞ペレットを400μLの氷冷273mMスクロース溶液に再懸濁する。続いてグリセロールを15％vol / volの最終濃度に添加する。細胞はエレクトロポレーションの準備が完了していますが、後で使用するために-80℃で70μLのアリコートで凍結することもできます。
- エレクトロポレーションのために、エレクトロコンピテント細胞の70μLアリコートを100〜1,000ngのプラスミドDNAと混合し、混合物を氷冷エレクトロポレーションキュベット（0.2cmの電極ギャップ）に移す。 25μF、2400 V、200Ωの設定でエレクトロポレーションを行います。
- 中断する細胞をLBブロス600μL中のエレクトロポレーションキュベットに入れ、2mLチューブに移し、37℃で3時間振とうしながらインキュベートする。
- 細胞を2,000 xgで5分間遠心し、100μlのLBブロスにペレットを再懸濁する。必要な抗生物質を含む選択的LB寒天プレートに細胞懸濁液を広げ、37℃で一晩インキュベートする。
- 翌日、コロニー形成についてプレートをチェックする。増殖するコロニーはプラスミド上にコードされた正しい抗生物質耐性遺伝子を保有し、さらなる実験に使用することができる。
スワマー細胞分化誘導
注：以下のステップは、V.parahaemolyticusのスワマー細胞のライフサイクルへの分化を誘導する方法、および固体表面上の増殖を刺激する方法を記載する。
- スワンミングプレートを調製するために、4mLのハートインフュージョン（HI）寒天を100mLのddH 2 O中に懸濁する。
- HI寒天溶液を電子レンジで注意深く沸騰させ、粉末が溶解するまで瓶を随時振とうする。 121℃で20分間オートクレーブ処理する。
- オートクレーブ後、HI寒天を60〜65℃に冷却する。最終濃度50μM（100％エタノール中50mMのストック溶液）に2,2'-ビピリジルを添加する。 4mMの最終濃度（ddH 2 O中の4Mのストック溶液）にCaCl 2を添加する。必要に応じて、抗生物質を溶液に加えてプラスミドを維持する。
注：誘導性プラスミドを使用する場合は、最終濃度に誘導剤を加えてください。
注意：2,2'-ビピリジル：急性毒性（経口、経皮、吸入）。この化学物質を取り扱う際には、手袋および安全ゴーグルを使用する。 - 最後のHI寒天溶液30〜35mLを丸150mmペトリ皿に注ぎ、寒天を凝固させる。
- 細胞培養物をスポッティングする直前に、寒天プレートを37℃で少なくとも10分間乾燥させます（または液体残渣にdisappeared、しかしもはや）右上に開いた蓋があります。
注：乾燥時間は、使用したインキュベーターに大きく依存し、重度に乾燥したプレートは、 腸炎ビブリオの蔓延を許さない 。 （このステップは非常に重要です！）プレートは新しく使用する必要があり、2〜3時間以上経過してはいけません。古いプレートはあまりにも乾燥して群れを刺激することはありません。 - 単一コロニーの端から少量の細胞を5mLのLBブロスに接種する。 OD 600 = 0.8に達するまで37℃で振とう培養物をインキュベートする。通常、約2〜3時間かかる。その後、細胞はHIスウィング寒天プレート上にスポットされる準備が整う。
- HI寒天プレート（ 図1A ）の中央に細胞培養液1μLをスポットする。
- スポットを乾燥させる（ 図1B ）。
- 透明なプラスチックテープでプレートを密封し、しっかりと取り付けてください。そうでなければ、一晩のインキュベーション中に取り外す可能性があります（ 図1C ）。
注：これはシールが完璧であることが非常に重要です。適用時にテープに気泡や折れ曲がりが発生しないように注意してください。 - 24℃で一晩インキュベートする。これにより、鞭毛コロニー（ 図2 ）の周辺部から伸びる群発虫が発生した腸炎ビブリオの群集が形成される。
3.蛍光顕微鏡用のV.parahaemolyticus Swarmer細胞の調製
注：以下のプロトコールは、顕微鏡検査のための単一のスマーマー細胞を得るために、顕微鏡アガローススライドを調製する方法およびアガロースパッド上に猛烈なフレアの続くインプリンティングを記載する。
- 顕微鏡用アガローススライドを調製するには、20％vol / vol PBSおよび10％vol / vol LBブロス溶液100 mLに1 gのアガロースを加えます。注意深く電子レンジで溶液を沸騰させてアガロースを溶解させ、マグネチックスターラーで混合しながら65〜70℃に冷却します。
- 交流する場所リーン顕微鏡は作業台の完全な水平部分にスライドします。スライドの両端を汎用ラボ用ラベリングテープの2つの層で覆い、スライドを作業台に固定します。 2枚のテープの間隔は3cm程度にしてください。
注：テープの2つの層は、アガロースパッドの高さを決定する非常に小さな標高を作成します。細胞が顕微鏡分析のために同じ平面内にあることを確認するために作業空間が水平であることが重要です。 - 先に調製したアガロース溶液250μLを非被覆ガラス表面上にピペットで入れる。
- 2番目の顕微鏡スライドを底に1つの上と同じ向きに置き、少し残して残ったアガロースが側面に流れ出るようにします。
- アガロースを1〜2分間固化させ、次に水平方向の動きで上部ガラススライドを底部ガラススライドからゆっくりと引っ張ります。
- メスを使用し、メスに付着している残りのアガロースをすべて切り取ってください。顕微鏡スライドの両側をゆっくりとスライドさせ、顕微鏡スライドの端部からテープをゆっくりはずします。
注：アガローススライドはすぐに準備ができており、ゆっくりと乾燥が始まるので、できるだけ早く使用する必要があります。 - スマーマー細胞で顕微鏡検査を行うには、群集のコロニーの最も外側の端から3mm×10mmのスウォーミング寒天片を切り取ってください（ 図1D ）。スイマーセルを顕微鏡スライドに移す直前まで、スウォームプレートのテープシールを壊さないことは非常に重要です。テープを剥がすと、 鞭毛鞭毛虫細胞はスイマー細胞への分化を開始する。
注：群集の端から外へのカットをコロニーの内側に向けるようにしてください（ 図1D ）。この方法で、群れのコロニーの端に「水泳者の汚染」を防ぐことができます。 - 細胞がアガロースpaに面している顕微鏡アガローススライド上に群れの寒天片を転送d（ 図1E ）。これは、群れの細胞をアガロースパッド上にインプリントする。
- 約30秒待ってから、アガロースパッドから寒天片を注意深く取り除いてください（ 図1F ）。
- 細胞がインプリントされたアガロースパッド上にガラスカバースリップを置く。細胞は顕微鏡検査の準備ができています。
注：スマーマー細胞はゆっくりとスイマー状態への分化を開始するので、スマーマー細胞を直ちにイメージングすることが重要です。
4.蛍光顕微鏡検査のためのV.parahaemolyticusスイマー細胞培養物の調製
注：プロトコールのこのセクションでは、スイマー細胞型で蛍光顕微鏡検査を行うためにV.parahaemolyticusの培養液を調製する方法について説明します。
- 単一コロニーの端から少量の細胞を5mLのLBブロスに接種する。培養物を37℃で1時間、またはわずかな細胞増殖が見えるようになるまで振とうする。
- でこの段階は、必要であれば、目的のタンパク質の発現のための誘導剤を添加する。この実施例では、YFP-CheW9の発現を誘導するために、L-アラビノースを0.2％（w / vol）の最終濃度まで添加した。
- 培養物を37℃でさらに2時間振とうさせる。
- 顕微鏡のアガローススライドを準備するために、3.1-3.7のステップに従ってください。
- アガロースパッドの中央に細胞培養液1μLをスポットし、乾燥するまでインキュベートします。
- ガラスカバースリップを細胞が見つかったアガロースパッド上に置く。細胞は、蛍光顕微鏡下で画像化する準備が整っている。
5.画像解析
このプロトコルの部分では、画像分析のワークフロー、特に、人口統計解析のための単一細胞の蛍光データの抽出方法について説明します。
- 画像解析を開始する前に、すべての顕微鏡画像が16ビットTIF形式で保存されていることを確認してください。
- DIC（または位相コントラスト）および対応する蛍光チャネル画像をソフトウェアにロードします。
- 「表示/オーバーレイ画像」を選択して、両方のチャンネルのオーバーレイ画像を生成します。画像の数（「＃Images：」）を2に設定し、第1チャンネルのDIC画像と第2チャンネルの蛍光画像を選択します。
- ツールバーから「マルチライン」ツールを選択し、セルの中央から一方のポールから他方のポールにセルをマーキングします。生成されたすべての線（線オブジェクト）のリストを取得するには、「Measure / Region Measurements」を開きます。領域のラベル、距離、および平均強度のみを表示するように、領域の測定値を設定します。
- 「測定/キャリブレーション距離」のピクセルサイズを、顕微鏡セットアップに特有のピクセルサイズに較正し、「すべての開いている画像に適用」をクリックします。
- すべての領域（線オブジェクト）を蛍光チャネル画像に転送します。 「地域/トランスフソース画像（オーバーレイ画像）とデスティネーション画像（蛍光灯画像）を選択し、「すべての領域」を選択して「OK」を押します。
注記：後で正確な線（線オブジェクト、領域、ROI）を再生成するには、「領域/領域の保存」を開いて領域を保存します。 - "Measure / Region Measurements"を開いて "Open Log"を押して、すべての領域測定値をスプレッドシートにエクスポートします。データを開いてエクスポートすることを確認します。スプレッドシートをバックグラウンドで開くと、最後に "F9：Log Data"を押してデータをエクスポートします。
- セルに沿って蛍光焦点の位置を決定するには、 "Measure / Linescan"を開きます。セルの全幅が、以前に作成した領域で覆われるように、「線の幅」を値に設定します。ラインスキャングラフを右クリックし、「グラフデータを表示」を選択します。マウスを左クリックしてドラッグすると、ラインスキャンに沿って「Graph Data」ウィンドウには、2点間の対応するピクセル/距離が表示されます。青色の強調表示された行を選択し、内容をコピーします。
注：ラインスキャン強度プロファイル全体は、「ラインスキャン」ウィンドウで「ログデータ」を押すことでスプレッドシートに記録できます。抽出されたデータは、グラフやその他の統計分析での視覚化に使用できます。細胞周期にわたる局在化パターンは、細胞体に沿った細胞長および蛍光強度の人口統計学的表現で容易に視覚化することができる。これらの表現は、前に選択した同じROIを使用して取得できます。以下のステップは、 図3Cおよび4Cに示されるものと同様の人口統計を生成する方法の例を与える。- "Metamorph nd＆ROI files importer"を使用して、ソフトウェアで以前に作成されたフィジー/ ImageJのロード領域マーキング（.rgn）（ステップ5.6）;あるいは、分析される細胞の関心領域（ROI）は、組み込み「セグメント化された線」ツールを使用して、Fiji / ImageJで直接作成することができる。
- 「Analyze / Tools / ROI manager」を開き、すべてのアクティブなリスト項目をマークします。
- その後、 "More / Multi Plot"をクリックし、新しい "Multi Plot"ウィンドウで "List"を選択します。テーブルエントリをクリックして、「すべてコピー」を選択します。その後、新しいスプレッドシートに貼り付けます。
注：最も長いセル（対応する2つのXとYの列が最も多くの行を持つ）のデータがスプレッドシートの最後のものであることを確認してください。 - スプレッドシートを「CSV（カンマ区切り）（* .csv）」として保存します。
- Rスクリプトはここからダウンロードしてください。 "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10.スクリプトは長さ別に細胞を分類し、各細胞の蛍光強度の平均としてすべての細胞の蛍光強度プロファイルを正規化しますe。
- R [バージョン3.0.1のスクリプト "cell profiles function.R"全体を実行します。 11 ]。
- 30行目の "example plots.R"スクリプトを編集して、ファイルパスが以前に生成された.csvファイルが保存されているフォルダを参照するようにします。さらに、31行目のファイル名 "profile.csv"を、手順5.9.4で生成した.csvファイル用に選択したファイル名に変更します。その後、 "example plots.R"を実行し、 "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles"のドキュメントとスクリプトファイルのコメントに従って、人口統計解析を生成します。
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Representative Results
集団コロニーの分化誘導
図1は、 V.parahaemolyticus （ 図1A〜C）の 鞭打ちコロニーを産生することに関与する重要なステップのスキーマを提供する。スイマー培養物を群寒天にスポットし、24℃でインキュベートし、固体寒天表面上のスマーマー分化および増殖を誘導した。群れたコロニーの代表的な立体顕微鏡画像を図2に示します。ステレオ顕微鏡法によるイメージングでは、群コロニー周辺の外側に広がる群発発射が明確に示されます。より高い倍率は、群発発火において、細胞が単層または二層のみにグループ化されるのに対して、群のコロニーでは、複数の層に細胞が積み重なっていることを明らかにする（ 図2A ）。スウォームフレアは容易に転送することができます（ステップ3.8-3.11、
蛍光顕微鏡および画像解析
図1：スマーマー分化の誘導および顕微鏡画像化のための細胞の調製。 V.parahaemolyticusスマーマー細胞を産生するワークフローの簡略化された視覚化、および単一スマーマー細胞の顕微鏡分析用の顕微鏡スライドの調製。 （ A ）HI寒天プレートの中央にV.parahaemolyticusの OD 600 = 0.8細胞培養液1μLをスポットする。 （ B ）乾燥させて細胞を寒天表面に付着させるまで、スポットをインキュベートする。 （ C ）ペトリ皿を透明なテープでシールする。プレートを24℃で16時間インキュベートする。 （ D ）集団コロニーの外縁からHI寒天の小片を慎重に切り取る。 （ E ）切除をmicrに移すoscopyアガロースパッドで、スワマー細胞をアガロースパッドに向けます。 30秒の短いインキュベーション時間の後、スワマー細胞をアガロースパッド上にインプリンティングする。 （ F ）アガロースパッドから摘出した寒天を注意深く除去し、上に顕微鏡カバースリップを置く。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：腸炎ビブリオの鞭毛コロニーにおける細胞の組織 。 （ A ） V。腸炎ビブリオ菌群集の立体顕微鏡法。上のパネルは、拡大する倍率で群れのコロニーの外縁を表示します。下のパネルは、増加する倍率で中心とエッジとの間の群れするコロニーの領域を表示する。スウォーム - フレアは、群れコロニー。 （ B ）群集コロニーのそれぞれの示された位置から細胞を移した後のスワマーコロニー縁部（上パネル）および中心と周辺部（下パネル）との間の領域の代表的なDIC顕微鏡画像。スウォーム - フレアを、ステップ3.8〜3.11に記載されているように、顕微鏡アガロースパッド上に直接インプリンティングした。中心と周辺との間の領域からの細胞を、最初に群コロニーからこすり落とし、LBブロス中に再懸濁させた後、顕微鏡アガロースパッド上にスポットした。スケールバー=7.5μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：V.parahaemolyticusのスイマー細胞における走化性アレイの局在化。 （ A ）DI野生型V.parahaemolyticusのYFP- CheWを異所的に発現するスイマー細胞の蛍光顕微鏡画像である。 （ B ）スイマー細胞の細胞長の関数として、細胞極からの病巣の距離をプロットすることにより、YFP-CheW病巣分布を示すグラフ。 （ C ）YFP- CheWを発現するV.parahaemolyticusスイマー細胞の蛍光強度プロファイルの人口統計的分析。細胞は、細胞の長さによって分類され、相対蛍光強度を示す。スケールバー=5μm。パネルBおよびCは、参考文献9から適応される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：V.parahaemolyticusのスマーマー細胞における走化性アレイの局在化。 CheWを異所的に発現する野生型V. parahaemolyticusスマーマー細胞のDICおよび蛍光顕微鏡画像。 （ B ）スマーマー細胞の細胞長の関数として、細胞極からの病巣の距離をプロットすることにより、YFP-CheWフォーカス分布を示すグラフ。 （ C ）YFP-CheWを発現するV.parahaemolyticusスマーマー細胞の蛍光強度プロファイルの人口統計解析。細胞は、細胞の長さによって分類され、相対蛍光強度を示す。スケールバー=5μm。パネルBおよびCは、参考文献9から適応される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、 V. parahaemolyticus swarmer細胞の顕微鏡画像化方法とそれに続く下流分析を用いて、細胞内局在および研究された蛍光標識タンパク質の他の特徴を解明および定量する方法を報告する。顕微鏡検査画像処理および分析のためのいくつかのツールが存在するが、V.parahaemolyticusスウォーム細胞の分析は、大部分が高密度細胞集団内に通常存在し、細胞長の変動が大きいために依然として挑戦的である（14,15,16,17,18） 図2 ）。したがって、自動化された細胞の検出には時には欠陥があり、結果はやや信頼性がありません。このプロトコルは、 V.parahaemolyticusの鞭打ち細胞を増殖、画像化および分析するために設計されたパイプラインを概説しており、近接して成長する可変長の細胞の存在に対応する表面および下流の画像解析上の制御された増殖環境のような、これらの細胞の必要性が存在する。
目的のタンパク質をプラスミドから異所的に発現する能力は、いくつかの実験、 例えば顕微鏡検査研究または遺伝子欠失の補完のための蛍光標識タンパク質の発現にとって重要であり得る。ここでは、化学的にコンピテントな細胞を調製するプロセスおよびプラスミドDNAのV.parahaemolyticusへのエレクトロポレーションも記載されている。 V.parahaemolyticusにしばしば用いられるコンジュゲーションよりもエレクトロポレーションの利点は、 コンジュゲーションを可能にするためにプラスミド骨格を修飾する必要がないことである。それにもかかわらず、いくつかの予防措置が講じられるべきである。ステップ1.2で説明したように、OD 600 = 1.0の細胞密度に到達することは非常に重要です。より低い光学密度では、細胞はエレクトロポラティより高い密度では、プラスミドは細胞によって取り込まれない。さらに、 V.parahaemolyticus細胞の過酷な遠心分離（ステップ1.4-1.6）は、電気穿孔効率を大幅に低下させる。エレクトロコンピテントセルを生成するために、洗浄工程中に細胞ペレットを注意深く再懸濁することも重要である。
細胞培養の準備は簡単ではありませんが、培養密度は非常に重要です。一般に、早期指数増殖期（OD 600 <0.5）の細胞培養物は、一晩のインキュベーション中に、指数関数的または初期の定常期の培養物よりも大きなスウォーミングコロニーを産生する。実験によっては、より大きな群れのコロニーが有益かもしれません。しかし、同一のHI寒天プレート上で増殖させた異なる株間のコロニーの拡大および形態を比較するためには、個々の鞭打ちコロニーの間に十分なスペースがあることが重要である。これはachである可能性がありますより高い光学密度の細胞培養物をスポットすることにより、通常はより小さな群れのコロニーを生じる。
スワイミング表現型の誘発は、細菌種間で著しく変化し、その再現性は、寒天および栄養組成、周囲温度、ならびに周囲および増殖培地の両方の含水量などの要因によって大きく影響される。結果として、プロトコールおよび外部環境のわずかな変化は、群分析結果およびスマーマー分化の誘導に有意に影響を及ぼす。緑膿菌（ Pseudomonas aeruginosa）および枯草菌（Bacillus subtilis）のような他の細菌種の蔓延を誘発するためのプロトコールが報告されている19 。このプロトコールに記載されているステップは、V.parahaemolyticusのスマーマー細胞型を確実に産生し、それらをコロニーの端に一層の群発性のフレアを生じる鞭打ちコロニーの形態で維持する。安定したV.parahaemolyticusのスマーマー細胞型での再現性のある実験 、HIスウォーミング寒天プレートの調製は、このプロトコールの最も重要な部分である。特に、すべての保育器が異なる動作をするため、乾燥工程に最適化が必要な場合があります。群れ行動に影響を及ぼし得る別の要因は、ペトリ皿に使用されるプラスチックのタイプである。実験室で行われた典型的なペトリ皿は、ポリスチレン（PS）で作られています。しかし、低密度ポリエチレン（PE LD）でできたペトリ皿を使用すると、群を抜いたアッセイで混合結果が生じました。記載されたステップに従うことは重要である。なぜなら、単一のスマーマー細胞顕微鏡検査を可能にする明確な周辺フレア形成を示す再現性のある鞭打ちコロニーが形成されるだけなのでである。
間違いなく、V.parahaemolyticusの鞭打ち細胞の蛍光顕微鏡検査によって得られた結果を表示するために、異なるアプローチをとることができる。インスタンスの場合e、広く使用されているプログラムMicrobeTracker 16は、もっともらしい代替手段です。 MATLABを必要としない、最近利用可能なMicrobeTrackerアプリケーションOufti 20もまた別の方法です。しかし、Ouftiでは差動インタフェースコントラスト（DIC）画像の使用は不可能であり、フェーズコントラスト撮像は、スマーマー細胞の細胞分節を識別するのに適していない。さらに、すべての顕微鏡が位相コントラスト撮像用に装備されているわけではなく、位相コントラスト撮像はあらゆる種類の顕微鏡検査分析には適していません。自由でImageJベースの別の有望なツールはMicrobeJ17ですが、位相コントラストと蛍光画像のみを使用することもできます。さらに、このプロトコルは、そのライフサイクルの特定の時点での細胞の画像化および分析のみを可能にする。しかし、タイムラプスイメージングとその後の画像解析を記述する優れたプロトコルは、細胞軌道とタンパク質動態21は、腸炎ビブリオにも適用される可能性が高い。
このプロトコルに記載されている手順に従うことで、科学者はスイマーおよびスワマー細胞型のV.parahaemolyticusの両方で信頼性の高い再現性のある単一細胞蛍光顕微鏡検査を行うことができます。このプロトコールは、 V.parahaemolyticusをそのスイマーからそのスマーマー細胞型に変換する頑強な方法を詳述している。スウォーミングコロニーの周辺のフレアからのスワマー細胞の単層をアガロースパッド上に刻印することにより、タンパク質の細胞内局在が観察され、画像解析のためのパイプラインは、細胞が増殖する細菌群内に存在する他の細菌種非常に近接しており、自動化された画像解析が有利でない可能性があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
この研究はマックス・プランク・ソサエティによって支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
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