Summary
이 프로토콜은 차별적으로 구별되는 Vibrio parahaemolyticus 헤모글로빈 과 swarmer 세포의 단일 세포 현미경 검사를 가능하게합니다. 이 방법은 단일 세포 분석을 위해 쉽게 얻을 수있는 덩어리 세포 집단을 생산하고 세포 배양의 준비, 스웜머 분화의 유도, 샘플 준비 및 이미지 분석을 다루고있다.
Abstract
단백질의 세포 내 지방화를 연구하는 능력은 많은 세포 과정을 이해하는 데 필수적입니다. 이것은 세균 공동체 내에 존재하는 세포를 영상화 할 때 특히 어려울 수있는 형광 현미경 검사를 위해 단일 세포를 얻을 수있는 능력을 필요로합니다. 예를 들어, 인간 병원체 Vibrio parahaemolyticus 는 액상 조건에서 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재하며, 표면 접촉시 고체 표면에서의 성장을 위해 특수화 된 고도로 연장 된 스웜머 세포의 하위 모집단으로 분화한다. 이 논문은 V. parahaemolyticus 의 두 가지 미분 상태에서 단일 세포 형광 현미경 분석을 수행하는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 V.parahaemolyticus의 분열 세포주기를 매우 재현 가능하게 유도하여 고체 표면에 대한 증식을 촉진합니다. 상기 방법은 t로부터 연장되는 분화 된 스머머 셀의 플레어를 생성한다그는 군집 식민지의 가장자리에있다. 특히, 떼죽음의 끝에는 세포의 단일 층에 스머머 세포가 존재하기 때문에 현미경 슬라이드 및 단일 세포의 후속 형광 현미경 이미징으로 쉽게 전송할 수 있습니다. 또한, 박테리아 사회의 인구 통계 학적 표현을위한 이미지 분석의 워크 플로우가 제시됩니다. 원리의 증거로서, V.parahaemolyticus의 수영 세포 및 스머머 세포에서의 화학 주성 신호 전달 배열의 세포 내 국소화 분석 이 기재되어있다.
Introduction
박테리아는 끊임없이 외부 환경에 변화를 경험하고 이에 따라 행동을 변경하고 적응시키는 여러 기술을 개발했습니다. 그러한 메커니즘 중 하나는 변경된 환경을보다 잘 보완하는 별개의 세포 유형으로의 분화를 포함한다. 분화에는 종종 세포주기의 조절, 세포 형태학 및 세포의 시공간적 조직화에 주요 변화가 따른다. 분화를 겪을 수있는 한 가지 유기체는 부비강염 ( Vibrio parahaemolyticus) 입니다. V. parahaemolyticus 는 Vibrionaceae 에 속하며, 이는 일반적으로 신선한 물이나 소금물에 서식하는 proteobacteria 계열입니다. Vibrionaceae 는 환경 에 널리 분포하며 Vibrio cholerae.V를 포함하여 사람에서 장관 감염을 일으키는 몇 종을 포함 합니다. parahaemolyticus 는 이형 체 (dimorphic organism)이며, 그 변이 형 생물체에 대한 변화를 수용하기위한 반응으로서 2 가지 별개의 세포 유형으로 분화 할 수있다외부 환경. 수성 환경에서, 그것은 오래 막대 기둥에 위치한 단 극성 편모가있는 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재합니다. 표면 접촉시, 스머머 셀로의 분화가 유발된다. Swarmer 세포 분화는 두 가지 주요 변화를 포함한다 : 세포 분열의 억제를 통한 swarmer 세포 형태 형성 및 두 번째 편모 계의 유도. 그 결과 분열이 일어나고 매우 길어진 봉 모양의 swarmer 세포가 형성되는데, 분열 현상은 분열 현상을 일으켜 자손 swarmer 세포가되거나 swimer 세포로 다시 분화된다.
swarmer differentiation을 유도하거나 영향을 미치는 몇 가지 요인이보고되었다. 1 차 자극은 V. parahaemolyticus 가 표면 편에 회전의 억제를 감지하는 촉각 센서로 극모를 사용하는 메토 노 센싱 (mechanosensing) 에 의해 구동되는 것처럼 보이지만 몇 가지 다른 요인이우물 1 . 연구실에서는 북극 편모의 회전이 phenamil의 첨가에 의해 인위적으로 억제 될 수 있는데, 이는 나트륨 채널 구동 편모의 회전을 차단하여 스머머 분화를 유도한다. 또한, 초기 연구에서, Vibrio alginolyticus 는 투명한 플라스틱 테이프로 봉인 된 페트리 접시의 성장 배지에서 세포가 증식 될 때 고체 배지에서 떼 지어 유도되었다. 알칼리가 포화 된 여과지는 이러한 조건에서 휩쓸 기를 방지하여 하나 이상의 휘발성 산이 휩쓸 기의 유도에 관여 할 수 있음을 암시합니다. 따라서, 페트리 접시를 플라스틱 테이프로 밀봉하면 판의 헤드 공간 내에 세포 대사의 부산물로 형성된 휘발성 산이 축적 될 가능성이 높습니다. H2O2를 밀봉되지 않은 배양 접시에서 성장 배지에 첨가하여 배지 성분을 가수 분해하여 휘발성 산을 인위적으로 생산할 때도 동일한 효과가 나타났다
베로니카 parahemolyticus 의 분화는 세포 분열의 조절, 세포 형태 및 깃대와 같은 거대 분자 기계의 위치의 주요 변화를 포함한다화학 주성기구 (chemotaxis apparatus) - 세포주기에 따라 단백질의 특정 위치를 요구하는 과정. 따라서, 그러한 단백질의 세포 내 국지화를 연구하는 능력은 전술 한 세포 과정의 이해에 필수적이다. 이러한 연구를 수행하기 위해서는 단일 세포에서 형광 현미경 검사가 필요합니다. 이것은 swarmer 세포의 경우처럼 밀도가 높은 세균 집단 내에 존재하는 세포를 영상화 할 때 특히 어려울 수 있습니다. 현미경 연구를 위해 잠재적으로 단일 세포를 생성 할 수있는 액체 배지에서 스머머 분화를 유도하려는 시도가 있었다. 그리고 전사 수준에서이 세포들은 부분적으로 swarmer-differentiation 프로그램을 유도하지만 고체 배지에서 완전히 분화 된 swarmer 세포와 동일한 형태 학적 변화를 겪지는 않습니다 8 . 이 논문은 강력하고 재현성있는 방법을 제안한다.한천 표면의 차별화. 이 프로토콜은 단일 셀 현미경 검사 및 후속 분석을 위해 쉽게 접근 할 수있는 스머머 세포 집단을 쉽게 생성합니다. 또한, 프로토콜은 수영과 swarmer 세포 유형 (섹션 1, 2, 3, 4) 모두에서 형광 라벨 단백질의 현지화 연구를 가능하게합니다. 또한이 프로토콜은 박테리아 사회의 인구 통계 학적 분석을 가능하게하는 형광 현미경 실험에서 생성 된 데이터를 처리하고 분석하는 방법에 대한 후속 작업 과정을 설명합니다 (섹션 5).
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Protocol
1. Electro-competent V. parahaemolyticus 세포의 준비 및 형질 전환 체 세포의 전기 영동
참고 : 프로토콜의 다음 섹션에서는 electro-competent 세포의 준비 및 수영 세포에 플라스미드 DNA의 electroporation을 수행 할 수 있습니다. 이 단계는 형광 단백질이 플라스미드로부터 정상적으로 발현되는 경우 중요합니다.
- 37 ° C에서 밤새 100 μg / ML 암피실린과 부화가 포함 된 신선한 LB 한천 플레이트에 -80 ° C 글리세롤 주식에서 V.의 parahaemolyticus 세포를 스트레칭.
- 다음날, V. parahaemolyticus 의 단일 식민지로 LB 배지 200 ML을 접종하고 OD 600 이 1.0에 도달 할 때까지 흔들어주는 조건하에 37 ° C에서 배양합니다. 보통 세포 배양이 원하는 광학 밀도에 도달하기 위해 5 ~ 6 시간의 배양이 필요합니다.
- 즉시 얼음과 퍼프로 세포를 옮긴다.얼음과 4 ℃ 사전 냉각 원심 분리기에서 모든 추가 단계를 수행하십시오.
- 4 ℃에서 10 분간 2,000 x g에서 세포 수확.
- decantation하여 상등액을 버리고 얼음 - 차가운 273 MM 자당 솔루션 (산도 7.4, KOH로 버퍼링) 25 ML의 세포 펠렛을 다시 일시 중단합니다.
- 4에서 다시 세포를 수확 2000 x 10 분 10 분. 두 번 더 반복하십시오.
- 얼음 추위 273 MM 자당 솔루션 400 μL에 씻어 셀 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 이어서 글리세롤을 15 % vol / vol의 최종 농도로 첨가한다. 세포는 이제 electroporation을위한 준비가되어 있지만 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 70 μL의 일정량으로 동결 될 수 있습니다.
- electroporation 들어, 플라스미드 DNA의 100 ~ 1,000 NG와 electro-competent 세포의 70 μL 나누기를 섞어 얼음처럼 차가운 electroporation cuvette (0.2 cm 전극 간격)에 혼합물을 전송하십시오. 25 μF, 2400 V 및 200 Ω 설정으로 전기 천공을 수행하십시오.
- 일시 중지LB broth의 600 μL에 electroporation 큐벳의 세포, 2 ML 튜브에 전송하고 3 시간 37 ° C에서 떨고있는 동안 품어.
- 5 분 2,000 XG에서 세포를 스핀하고 LB 국물의 100 μL에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 필요한 항생제가 들어있는 선택적인 LB 한천 플레이트에 세포 현탁액을 퍼 내고 밤새 37 ° C에서 품을 수 있습니다.
- 다음날 식민지 형성에 대한 접시를 확인하십시오. 자라는 콜로니는 플라스미드에 코드화 된 올바른 항생제 내성 유전자를 가지고 있으며 이제 더 많은 실험에 사용될 수 있습니다.
2. Swarmer 세포 분화의 유도
주 : 다음 단계는 V.parahaemolyticus의 분화 세포 수명주기로의 분화 를 유도하는 방법과 고체 표면에서의 증식을 자극하는 방법을 설명합니다.
- 뭉툭한 판을 준비하기 위해 심장 주입 (HI) 한천 4 g을 100 mL ddH 2 O에 현탁하십시오.
- 조심스럽게 마이크로파에서 HI 한천 용액을 끓여서 분말이 용해 될 때까지 때때로 병을 흔든다. 121 ℃에서 20 분간 오토 클레이브한다.
- 고압 증기 멸균 후, HI 한천을 60-65 ° C로 냉각시킵니다. 50 μM (100 % 에탄올 중 50 mM의 원액)의 최종 농도로 2,2'- 비 피리 딜을 첨가한다. 4 mM의 최종 농도 (ddH 2 O에서 4 M의 원액)에 CaCl 2 를 첨가한다. 필요한 경우 플라스미드를 유지하기 위해 항생제를 용액에 첨가하십시오.
참고 : 유도 성 플라스미드를 사용하려는 경우 유도제를 최종 농도에 첨가하십시오.
주의 : 2,2'- 바이 피리 딜 : 급성 독성 (경구, 피부, 흡입). 이 화학 물질을 취급 할 때는 장갑과 안전 안경을 착용하십시오. - 둥근 150mm 배양 접시에 최종 HI 한천 솔루션 30 - 35 ML을 부어하고 한천이 고형하자.
- 세포 배양 물을 발견하기 직전에 적어도 10 분 동안 37 ℃에서 한천 평판을 말린 다음 (또는 액체 잔류 물이 disa를 가질 때까지)ppeared하지만 더 이상은 아닙니다) 열린 뚜껑이있는 오른쪽 위.
참고 : 건조 시간은 사용 된 인큐베이터에 따라 크게 달라지며 건조 된 판은 V.parahaemolyticus의 덤불을 허용하지 않습니다. (이 단계는 매우 중요합니다!) 플레이트는 신선한 상태로 사용해야하며 2 ~ 3 시간 이상 경과되어서는 안됩니다. 오래된 플레이트는 너무 마르기 때문에 떼 지어 모이게됩니다. - 단일 식민지의 가장자리에서 소량의 LB를 5 mL의 LB 배지에 접종하십시오. OD 600 = 0.8이 될 때까지 37 ° C에서 흔들어주는 배양 물을 배양하십시오. 보통 2-3 시간 정도 걸립니다. 그 후에, 세포는 HI 떼 지어 다니는 한천 플레이트에 얼룩을지게 될 준비가되었습니다.
- HI agar swarming plate ( 그림 1A )의 중앙에 1 μL의 세포 배양 물을 놓습니다.
- 현장을 말리십시오 ( 그림 1B ).
- 플레이트를 투명한 플라스틱 테이프로 밀봉하고 단단히 부착되었는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 밤새 배양하는 동안 분리 될 수 있습니다 ( 그림 1C ).
참고 :인감이 완벽하다는 점이 매우 중요합니다. 공기 방울이 형성되는 것을 피하고 테이프를 적용 할 때 접 힙니다. - 24 ° C 밤새 플레이트를 품어. 이것은 군집 (swarm-colony)의 주변에서 뻗어 나온 떼 지어 발적과 함께 V. parahaemolyticus 군집 (swarm-colony)의 형성을 초래할 것이다 ( 그림 2 ).
3. 형광 현미경 검사를위한 V. parahaemolyticus Swarmer 세포의 준비
참고 : 다음 프로토콜은 현미경에 대한 단일 swarmer 세포를 얻기 위해 아가로 오스 패드에 득실 거리는 플레어의 현미경 아가로 오스 슬라이드 및 후속 임 프린팅을 준비하는 방법을 설명합니다.
- 현미경 검사를 위해 아가로 오스 슬라이드를 준비하려면 20 % vol / vol PBS와 10 % vol / vol LB broth 용액 100 mL에 1 g의 아가로 오스를 첨가하십시오. 조심스럽게 전자 레인지에서 용액을 끓여 아가로 오스를 녹이고 자기 교반기로 혼합하면서 65-70 ° C로 식히십시오.
- 장소 AC기울기를 가진 현미경 슬라이드를 작업대의 완벽하게 수평 부분에 올려 놓습니다. 슬라이드의 양쪽 끝을 범용 실험실 라벨 테이프로 덮고 슬라이드를 작업대에 고정시킵니다. 두 테이프 사이의 거리는 약 3cm가되어야합니다.
참고 : 테이프의 두 레이어는 아가로 오스 패드의 높이를 결정하는 매우 작은 높이를 만듭니다. 세포가 현미경 분석을 위해 동일한 평면에 있는지 확인하기위한 작업 공간의 높이는 중요합니다. - 이전에 준비한 아가로 오스 용액 250 μL을 피복되지 않은 유리 표면에 피펫 팅하십시오.
- 이제 두 번째 현미경 슬라이드를 아래쪽 상단과 동일한 방향으로 놓고 약간 아래로 눌러 잔여 아가로 오스가 측면으로 흘러 나오도록하십시오.
- 아가로 오스가 1 ~ 2 분 동안 고형화되도록 한 다음 천천히 상단 유리 슬라이드를 수평 이동으로 하단 유리에서 빼냅니다.
- 메스를 사용하여 잔류 아가로 오스를 제거하십시오.현미경 슬라이드의 측면과 천천히 현미경 슬라이드의 끝 부분에서 테이프를 제거합니다.
참고 : 아가로 오스 슬라이드는 이제 준비가되었으며 천천히 건조하기 시작하므로 최대한 빨리 사용해야합니다. - 스머머 세포에서 현미경 검사를 수행하려면 떼 지어 서식하는 콜로니 ( 그림 1D )의 가장 바깥 쪽 가장자리에서 ~ 3mm x 10mm의 무리한 한천 조각을 잘라내십시오. 스 마머 셀을 현미경 슬라이드로 옮기기 직전까지 떼 지음 판의 테이프 씰을 끊지 않는 것이 매우 중요합니다. 일단 테이프가 제거되면, V. parahaemolyticus의 떼죽음 세포가 수영 세포로 분화를 시작합니다.
참고 : 떼 지어 서식하는 모서리 바깥 쪽에서부터 식민지 안쪽까지 컷을 향하게하십시오 ( 그림 1D ). 이런 식으로 당신은 군집하는 식민지의 가장자리로 "헤엄 치는 사람 오염"을 방지 할 수 있습니다. - 세포가 아가로 오스 PA를 마주보고 현미경 아가로 오스 슬라이드에 무리 한천의 조각을 전송d ( 도 1E ). 이것은 덤불 세포를 아가로 오스 패드 위에 각인시킵니다.
- ~ 30 초 기다린 후, 아가로 오스 패드 ( 그림 1F )에서 한천 조각을 조심스럽게 제거하십시오.
- 세포가 각인 된 아가로 오스 패드 위에 유리 coverslip을 놓습니다. 세포는 이제 현미경 검사를 할 준비가되었습니다.
참고 : swarmer 세포가 수영 선수 상태로 천천히 분화를 시작하기 때문에 swarmer 세포를 즉시 이미지화하는 것이 중요합니다.
4. 형광 현미경 검사를위한 V. parahaemolyticus 수영 세포 배양의 준비
참고 : 프로토콜의이 섹션은 수영 세포 유형에 형광 현미경 검사 를 수행하기 위해 V.parahaemolyticus의 문화를 준비하는 방법을 설명합니다.
- 단일 식민지의 가장자리에서 소량의 LB를 5 mL의 LB 배지에 접종하십시오. 37 ° C에서 1 시간 동안 또는 약간의 세포 성장이 보일 때까지 흔들어주는 배양 물을 인큐베이션한다.
- 에서필요한 경우이 단계에서 관심 단백질의 발현 유도제를 추가합니다. 이 실시 예에서, L- 아라비 노스는 YFP-CheW 9의 발현을 유도하기 위해 0.2 % (w / vol)의 최종 농도로 첨가되었다.
- 37에서 추가 2 시간 동안 흔들어 문화를 품어 ° C.
- 현미경 검사 아가로 오스 슬라이드를 준비하려면 3.1-3.7 단계를 수행하십시오.
- 아가로 오스 패드 중앙에 1 μL의 세포 배양 물을 놓고 마를 때까지 배양하십시오.
- 세포가 발견 된 아가로 오스 패드 위에 유리 coverslip을 놓습니다. 세포는 이제 형광 현미경으로 이미징 준비가되었습니다.
5. 이미지 분석
프로토콜의이 부분은 이미지 분석을위한 작업 흐름, 특히 인구 통계 학적 분석을 위해 단일 셀의 형광 데이터를 추출하는 방법을 설명합니다.
- 이미지 분석을 시작하기 전에 모든 현미경 이미지가 16 비트 TIF 형식으로 저장되었는지 확인하십시오.
- DIC (또는 위상차) 및 해당 형광 채널 이미지를 소프트웨어에로드하십시오.
- "디스플레이 / 오버레이 이미지"를 선택하여 두 채널의 오버레이 이미지를 생성하십시오. 사진 수 ( "# Images :")를 2로 설정하고 첫 번째 채널의 DIC 이미지와 두 번째 채널의 형광 이미지를 선택하십시오.
- 툴바에서 "Multi-Line"도구를 선택하고 셀 가운데를 통해 한 극에서 다른 극으로 셀을 표시하십시오. 생성 된 모든 선 (선 객체)의 목록을 가져 오려면 "측정 / 지역 측정"을 엽니 다. 영역 레이블, 거리 및 평균 강도 만 표시하도록 영역 측정을 구성하십시오.
- "Measure / Calibrate Distance"아래의 픽셀 크기를 현미경 설정에 맞는 픽셀 크기로 조정하고 "열려있는 모든 이미지에 적용"을 클릭하십시오.
- 모든 영역 (라인 객체)을 형광 채널 이미지로 전송합니다. "지역 / Transf영역 "에서 소스 이미지 (오버레이 이미지)와 대상 이미지 (형광 채널 이미지)를 선택하고"All Regions "를 선택하고"OK "를 누릅니다.
참고 : 정확한 선 (선 객체, 지역, ROI)을 나중에 다시 생성하려면 "영역 / 영역 저장"을 열고 영역을 저장하십시오. - "측정 / 지역 측정"을 열고 "로그 열기"를 눌러 모든 지역 측정 값을 스프레드 시트로 내 보냅니다. 데이터를 열고 내보내려면 확인하십시오. 스프레드 시트가 백그라운드에서 열리면 마침내 "F9 : 데이터 기록"을 눌러 데이터를 내 보냅니다.
- 셀을 따라 형광 초점의 위치를 결정하려면 "Measure / Linescan"을 엽니 다. 셀의 전체 너비가 이전에 만든 영역으로 덮여 지도록 "선폭"을 값으로 설정합니다. 라인 스캔 그래프를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "그래프 데이터 표시"를 선택하십시오. 라인 - 스캔을 따라 마우스 - 커서를 마우스 왼쪽 - 클릭하고 끌어서"Graph Data"창에는 두 지점 사이의 해당 픽셀 / 거리가 표시됩니다. 파란색으로 강조 표시된 행을 선택한 다음 내용을 복사하십시오.
참고 : 전체 라인 스캔 강도 프로파일은 "라인 스캔"창에서 "로그 데이터"를 눌러 스프레드 시트에 기록 할 수 있습니다. 추출 된 데이터는 이제 그래프 또는 추가 통계 분석에서 시각화에 사용할 수 있습니다. 세포주기에 걸친 현지화 패턴은 세포체와 세포의 길이에 따른 인구 통계 학적 표현으로 쉽게 시각화 될 수 있습니다. 이러한 표현은 이전에 선택된 동일한 투자 수익 (ROI)을 사용하여 얻을 수 있습니다. 다음 단계는 그림 3C 및 4C에 표시된 것과 유사한 인구 통계를 생성하는 방법의 예를 제공합니다.- "Metamorph nd & ROI 파일 임포터"를 사용하여 소프트웨어 (단계 5.6)에서 이전에 생성 된 피지 / ImageJ로드 영역 표시 (.rgn); 또는 분석 할 셀의 관심 영역 (ROI)을 빌드 인 "세그먼트 선"도구를 사용하여 Fiji / ImageJ에서 직접 만들 수 있습니다.
- "Analyze / Tools / ROI manager"를 열고 모든 활성 목록 항목을 표시하십시오. "
- 그런 다음 "More / Multi Plot"을 클릭 한 다음 새로운 "Multi Plot"창에서 "List"를 선택하십시오. 표 항목을 클릭 한 다음 "모두 복사"를 선택하십시오. 그런 다음 새 스프레드 시트에 붙여 넣습니다.
참고 : 스프레드 시트에서 가장 긴 셀 (가장 많은 행이있는 두 개의 해당 X 및 Y 열)이 마지막 것임을 확인하십시오. - 스프레드 시트를 "CSV (쉼표로 구분) (* .csv)"로 저장하십시오.
- 여기에서 R 스크립트를 다운로드하십시오. "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles"10. 스크립트는 길이별로 세포를 분류하고 모든 세포의 형광 강도 프로파일을 각 세포의 형광등의 평균으로 정규화합니다이자형.
- 전체 스크립트 "cell profiles function.R"을 R [버전 3.0.1; 11 ].
- 30 번째 줄에있는 "예제 plots.R"스크립트를 편집하여 파일 경로가 이전에 생성 된 .csv 파일이 저장된 폴더를 참조하도록합니다. 또한 31 행의 "profile.csv"파일 이름을 5.9.4 단계에서 생성 한 .csv 파일에 대해 선택한 파일 이름으로 변경하십시오. 그런 다음 "example plots.R"을 실행하고 스크립트 파일의 설명뿐만 아니라 "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles"의 설명서를 따라 인구 통계 분석을 생성하십시오.
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Representative Results
맹목적인 식민지의 분화 및 생성 유도
그림 1 은 V. parahaemolyticus ( 그림 1A-C )의 군집 콜로니 생산에 관련된 중요한 단계의 스키마를 제공합니다. Swarmmer 한천 배지를 24 ℃에서 배양하여 고형 한천 표면에서 스머머 분화 및 증식을 유도 하였다. 떼 지어 서식하는 콜로니의 대표적인 입체 현미경 이미지가 그림 2 에 나와 있습니다. 스테레오 현미경 이미징은 떼 지어 식민지 주변에서 뻗은 떼어 내기를 명확하게 보여줍니다. 더 높은 배율은 떼 지어 번쩍이는 곳에서 세포가 단층 또는 이중층으로 만 분류되는 반면 군집 - 식민지의 중간에서는 세포가 여러 층으로 쌓여 있음을 보여줍니다 ( 그림 2A ). 스웜 - 플레어는 쉽게 전송 될 수 있습니다 (3.8-3.11,
형광 현미경 및 이미지 분석
그림 1 : Swarmer의 분화 유도 및 Microscopy Imaging을위한 세포 준비. 단일 swarmer 세포의 현미경 분석을위한 현미경 슬라이드 준비 및 V. parahaemolyticus swarmer 세포 생성을위한 작업 흐름의 단순화 된 시각화. ( A ) HI agar swarming plate의 중앙에 V. parahaemolyticus 의 OD 600 = 0.8 세포 배양액 1 μL를 넣는다 . ( B ) 말라가 세포가 한천 표면에 첨부 될 때까지 자리를 품어. ( C ) 깨끗한 테이프로 페트리 접시를 밀봉하십시오. 24 시간 플레이트를 16 시간 동안 배양한다. ( D ) 무리 지어 식민지의 외곽 가장자리에서 HI 한천의 작은 조각을 조심스럽게 잘라 낸다. ( E ) 절단을 micr로 옮긴다.oscopy 아가로 오스 패드 swaroer 세포와 아가로 오스 패드를 마주보고. 30 초 짧은 잠복기 시간 후 swarmer 세포는 아가로 오스 패드에 각인됩니다. ( F ) 조심스럽게 agarose 패드에서 excised 한천을 제거하고 위에 현미경 coverslip을 놓습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : V. parahaemolyticus Swarming Colony의 세포 조직 . ( 가 ) V. parahaemolyticus swarmer colony의 입체 현미경 검사 . 상부 패널은 득실 거리는 식민지의 바깥 가장자리를 확대 배율로 표시합니다. 하단 패널은 증가하는 배율에서 중심과 가장자리 사이의 떼 지어 서식하는 지역을 표시합니다. 스웜 - 플레어는군집. ( B ) 군집 콜로니 가장자리 (상단 패널) 및 떼 지어 식민지의 각 표시된 위치에서 세포의 전송 후 중심과 주변 (하단 패널) 사이의 영역의 대표 DIC 현미경 이미지. 떼죽음은 단계 3.8-3.11에서 설명한 바와 같이 현미경 아가로 오스 패드 위에 직접 각인되었다. 중심과 주변부 사이의 영역으로부터의 세포를 먼저 군집 콜로니로부터 긁어내어 현미경 아가로 오스 패드 상에 놓기 전에 LB 브로 쓰에 재현 탁시켰다. 눈금 막대 = 7.5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : V. parahaemolyticus 의 수영 세포에서 화학 주성 배열의 국산화. ( A ) DI야생형 V.parahaemolyticus의 형광 현미경 이미지는 YFP-CheW를 외이도로 표현한다. ( B ) 수영 세포의 세포 길이의 함수로 세포 기둥에서 초점 거리를 플로팅하여 YFP - CheW 초점 분포를 표시 그래프. ( C ) YFP - CheW를 표현 V. parahaemolyticus 수영 세포의 형광 강도 프로파일의 인구 통계 학적 분석. 세포는 세포 길이별로 정렬되고 상대적인 형광 강도를 표시합니다. 스케일 바 = 5 μm. 패널 B와 C는 참고 문헌 9 에서 채택했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 4 : V. parahaemolyticus 의 Swarmer 세포에있는 주 화성 배열의 지방화. A ) 야생형 V. parahaemolyticus swarmer 세포의 DIC 및 형광 현미경 이미지. ( B ) swarmer 세포의 세포 길이의 함수로 세포 기둥에서 초점 거리를 플로팅하여 YFP - CheW 초점 분포를 표시 그래프. ( C ) YFP - CheW를 표현 V. parahaemolyticus swarmer 세포의 형광 강도 프로파일의 인구 통계 학적 분석. 셀은 셀 길이별로 정렬되고 상대적 형광 강도를 표시합니다. 스케일 바 = 5 μm. 패널 B와 패널 C는 참고 문헌 9에서 변경 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문은 V. parahaemolyticus swarmer 세포의 현미경 검사법에 대한 방법을보고하고, subcellular localization과 연구 된 형광 표지 단백질의 다른 특징을 분석하고 정량화하기위한 하향 분석을 수행 하였다. 현미경 검사 이미지 처리 및 분석을위한 몇 가지 도구가 있지만 14 , 15 , 16 , 17 , 18 의 V. parahaemolyticus swarming 세포의 분석은 주로 밀도가 높은 세포 집단 내에 존재하고 세포 길이의 높은 변화 그림 2 ). 따라서 자동 셀 감지가 잘못되어 결과가 다소 신뢰할 수 없습니다. 이 프로토콜은 V. parahaemolyticus의 떼죽음 세포를 성장, 이미지 및 분석하도록 설계된 파이프 라인을 개략적으로 설명합니다.가까운 거리에서 성장하는 가변 길이의 세포의 존재를 수용하는 표면 및 하류의 이미지 분석상의 제어 된 성장 환경과 같은 이러한 세포의 필요성.
플라스미드로부터 목적 단백질을 ectopically 발현하는 능력은 몇 가지 실험, 예를 들면 현미경 검사 또는 유전자 결실 보충을위한 형광 표지 단백질의 발현에 중요 할 수있다. 여기에 화학적으로 유능한 세포를 준비하고 V.parahaemolyticus에 플라스미드 DNA를 전기 천공하는 과정이 기술 되어있다. V.parahaemolyticus에 종종 사용되는 접합에 대한 일렉트로 포 레이션의 이점은 플라스미드 백본이 접합을 가능하게하기 위해 변형 될 필요가 없다는 것이다. 그럼에도 불구하고 몇 가지 예방 조치가 취해 져야한다. 단계 1.2에서 설명한대로 OD 600 = 1.0의 세포 밀도에 도달하는 것이 매우 중요합니다. 낮은 광학 밀도에서 세포는 electroporati에 lyse 것입니다더 높은 밀도에서 플라스미드는 세포에 흡수되지 않는다. 또한, V. parahaemolyticus 세포 (단계 1.4-1.6)의 너무 가혹한 원심 분리는 전기 천공 효율을 대폭 감소시킬 것이다. 전기 유능한 세포를 생성하기 위해 세척 단계에서 세포 펠렛을 조심스럽게 다시 매달아 놓는 것도 중요합니다.
세포 배양의 준비는 사소한 것 같지만, 밀도는 굉장히 중요합니다. 일반적으로, 초기 지수 성장 단계 (OD 600 <0.5)의 세포 배양은 하룻밤 배양하는 동안 늦은 지수 또는 초기 정지 단계의 배양액보다 큰 군집 콜로니를 생성합니다. 실험에 따라 더 큰 군집 식민지가 도움이 될 수 있습니다. 그러나 동일한 HI agar swarming plate에서 자라는 서로 다른 균주 간의 콜로니 확장과 형태를 비교하기 위해서는 각기 다른 집단의 콜로니간에 충분한 공간을 확보하는 것이 중요합니다. 이것은 ach 일 수있다.보통 더 작은 뭉툭한 식민지를 초래할 높은 광학 밀도의 세포 배양 물에 얼룩을지게한다.
떼 지어 나타나는 표현형의 유도는 박테리아 종에 따라 크게 다르며, 재현성은 한천 및 영양소 조성, 주변 온도 및 주변 환경과 성장 매개체의 수분 함량과 같은 요소에 의해 크게 영향을받습니다. 결과적으로, 프로토콜 및 외부 환경의 사소한 변화는 떼주기 분석 결과 및 스머머 분화의 유도에 크게 영향을 미친다. Pseudomonas aeruginosa 및 Bacillus subtilis 와 같은 다른 박테리아 종의 떼죽음을 유도하기위한 프로토콜 이보고되었다. 이 프로토콜에 설명 된 단계는 안정적으로 V. parahaemolyticus의 군집 세포 유형을 생성하고 식민지의 가장자리에 단일 계층의 득실 거리는 플레어를 생성하는 군집 식민지 형태로 유지합니다. 안정적이고V. parahaemolyticus의 swarmer cell-type에 대한 재현성있는 실험 , HI 군집 한천 플레이트의 준비가이 프로토콜의 가장 중요한 부분입니다. 특히, 모든 보육 기관이 다르게 수행하므로 건조 단계에 최적화가 필요할 수 있습니다. 붐비는 행동에 영향을 줄 수있는 또 다른 요소는 페트리 접시에 사용되는 플라스틱 유형입니다. 실험실에서 사용되는 일반적인 페트리 접시는 폴리스티렌 (PS)으로 만들어집니다. 그러나, 저밀도 폴리에틸렌 (PE LD)으로 만든 페트리 접시를 사용하여 떼죽음 분석에서 혼합 된 결과를 산출했습니다. 그것은 단 한 swarmer 세포 현미경을 가능하게 독특한 딱딱한 주변 플레어 형성을 보여주는 재현 할 수있는 군집이 식민지가 형성되기 때문에 설명 된 단계를 수행하는 것이 중요합니다.
의심 할 여지없이, V. parahaemolyticus swarming 세포에 대한 형광 현미경 검사 결과를 표시하기 위해 다른 접근법을 사용할 수 있습니다. 인스턴스 용e, 널리 사용되는 프로그램 MicrobeTracker 16은 그럴듯한 대안을 나타냅니다. MATLAB을 필요로하지 않는 최근 사용 가능한 MicrobeTracker 응용 프로그램 인 Oufti 20 도 또 다른 대안입니다. 그러나 Oufti에서는 DIC (Differential Interface Contrast) 이미지를 사용할 수 없으며 위상차 이미징은 스머머 셀에서 셀 세분화를 식별하는 데 적합하지 않습니다. 또한, 모든 현미경이 위상 콘트라스트 이미징을 위해 장착 된 것은 아니며, 위상 콘트라스트 이미징은 모든 종류의 현미경 분석에 적합하지 않습니다. 자유롭고 ImageJ 기반의 또 다른 유망한 도구는 MicrobeJ17이지만 위상차 및 형광 이미지 만 사용할 수도 있습니다. 또한,이 프로토콜은 생명주기의 특정 시점에서 세포의 이미징 및 분석을 허용합니다. 그러나 시간 경과 이미징과 후속 이미지 분석을 설명하는 우수한 프로토콜은 단일세포 궤도와 단백질 역학은 V. parahaemolyticus 에도 적용될 수있다.
이 프로토콜에 설명 된 단계에 따라 과학자는 V. parahaemolyticus 의 수영기 및 스웜 셀 (swarmer) 세포 유형 모두에서 신뢰성 있고 재현성있는 단세포 형광 현미경 검사를 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 V. parahaemolyticus 를 수영 선수에게서 그 swarmer cell-type으로 바꾸는 강력한 방법을 자세히 설명합니다. 쇄도하는 콜로니의 주변 플레어에서 swaroer 세포의 단일 층을 아가로 오스 패드 위에 각인함으로써 단백질의 세포 내 국소화를 관찰 할 수 있으며 이미지 분석을위한 파이프 라인은 세포가 자라는 세균 공동체 내에 존재하는 다른 세균 종에 적용될 수있다. 매우 근접성이 있으며 자동화 된 이미지 분석이 이점이되지 않을 수도 있습니다.
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Disclosures
아무런 이해 상충이 없다고 선언했다.
Acknowledgments
이 작업은 Max Planck Society에서 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
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