Summary
Denne protokol muliggør enkeltcellemikroskopi af de forskelligt adskilte Vibrio parahaemolyticus svømmer- og sværmerceller. Fremgangsmåden frembringer en population af swarmerceller, der er let tilgængelige til enkeltcelleanalyse og dækker fremstilling af cellekulturer, induktion af swarmer differentiering, prøvepræparation og billedanalyse.
Abstract
Evnen til at studere intracellulær lokalisering af proteiner er afgørende for forståelsen af mange cellulære processer. Til gengæld kræver dette evnen til at opnå enkelte celler til fluorescensmikroskopi, hvilket kan være særligt udfordrende, når billeddannende celler, som eksisterer inden for bakterielle samfund. For eksempel eksisterer det humane patogen Vibrio parahaemolyticus som korte stavformede svømmerceller i flydende forhold, som ved overfladekontakt differentieres i en subpopulation af stærkt langstrakte sværmerceller specialiseret til vækst på faste overflader. Dette papir præsenterer en metode til at udføre single cell fluorescensmikroskopi analyse af V. parahaemolyticus i sine to differentierede tilstande. Denne protokol inducerer meget reproducerbar differentiering af V. parahaemolyticus i en livscyklus for sværmerceller og letter deres spredning over faste overflader. Fremgangsmåden frembringer flares af differentierede swarmerceller, der strækker sig fra tHan kant af sværm-koloni. Især i spidsen af sværgflekserne findes sværmerceller i et enkelt lag af celler, hvilket muliggør deres nemme overførsel til et mikroskopglas og efterfølgende fluorescensmikroskopi afbildning af enkeltceller. Derudover er workflow af billedanalyse til demografisk repræsentation af bakterielle samfund præsenteret. Som et principprincip beskrives analysen af den intracellulære lokalisering af kemotaxis-signaleringsarrayer i svømmer- og svømmerceller af V. parahaemolyticus.
Introduction
Bakterier oplever konstant ændringer i deres ydre miljø og har udviklet flere teknikker til at ændre og tilpasse deres adfærd i overensstemmelse hermed. En sådan mekanisme indebærer differentiering i forskellige celletyper, der bedre supplerer det ændrede miljø. Differentiering involverer ofte store ændringer i reguleringen af cellecyklussen, cellemorfologi og den spatiotemporale organisation af cellerne. En organisme der kan undergå differentiering er Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus tilhører Vibrionaceae , som er en familie af proteobakterier, der normalt beboer frisk eller saltvand. Vibrionaceae er bredt fordelt i miljøet og omfatter flere arter, der forårsager intestinale infektioner hos mennesker, også inklusive Vibrio cholerae. V. Parahaemolyticus er en dimorf organisme og er i stand til at differentiere i to forskellige celletyper som et svar for at imødekomme ændringer i detsEksternt miljø. I vandige omgivelser eksisterer den som en kort stangformet svømmercelle med et enkelt polært flagellum placeret ved den gamle cellepæl. Ved overfladekontakt udløses differentiering i en sværmercelle. Swarmer celledifferentiering involverer to store ændringer: swarmercellemorfogenese gennem inhibering af celledeling og induktion af et andet flagella system. Dette resulterer i dannelsen af en peritrich og stærkt forlænget stangformet sværmercelle, som enten kan fortsætte sværmerens livsstil, hvor divisionshændelser resulterer i afkom swarmerceller eller alternativt differentierer tilbage til svømmerceller.
Flere faktorer er blevet rapporteret at inducere eller påvirke swarmer differentiering. Den primære stimulus ser ud til at være drevet af mekanosensing, hvor V. parahaemolyticus bruger polar flagellum som en taktil sensor, som detekterer inhibering af rotationen ved overfladekontakt, men flere andre faktorer er involveret somBrønd 1 I laboratoriet kan rotation af det polære flagellum inhiberes kunstigt ved tilsætning af phenamil, som blokerer den natriumkanal-drevne flagellære rotation og derved fremkalde sværmer differentiering 2 . Desuden blev Vibrio alginolyticus i et tidligere forsøg induceret at sværmme på fast medium, når celler blev formeret på vækstmedium i en Petri-skål forseglet med klart plastikbånd. Alkalisk-mættet filterpapir forhindret sværmer under disse betingelser, hvilket tyder på, at en eller flere flygtige syrer kan være involveret i induktion af sværmer. Således forsegles petriskålen med plastikbånd, der sandsynligvis er tilladt for akkumulering af flygtige syrer, dannet som biprodukter af cellulær metabolisme inden for pladens hovedplade. Den samme effekt blev opnået, når H202 blev tilsat til vækstmediet i uforseglede petriskåle med henblik på kunstigt at fremstille flygtige syrer ved hydrolysering af mediekomponenter
V. parahaemolyticus differentiering indebærer store ændringer i reguleringen af celledeling, cellulær morfologi og positionering af makromolekylære maskiner såsom flagellA og chemotaxis apparater - processer, som alle kræver den specifikke lokalisering af proteiner i overensstemmelse med cellecyklussen. Evnen til at studere den intracellulære lokalisering af sådanne proteiner er således afgørende for forståelsen af de ovennævnte cellulære processer. For at udføre sådanne undersøgelser kræves fluorescensmikroskopi på enkeltceller. Dette kan være særligt udfordrende, når billeddannelsesceller findes inden for tætte bakteriepopulationer, som det er tilfældet med sværmerceller. Der har været forsøg på at fremkalde sværmer differentiering i flydende medier, som potentielt kunne danne enkeltceller til mikroskopi undersøgelser. Og selvom disse celler på et transkriptionsniveau delvis har induceret swarmer-differentieringsprogrammet, undergår de ikke de samme særskilte morfologiske forandringer som fuldt differentierede swarmerceller dyrket på fast medium 8 . Dette papir tilbyder en robust og reproducerbar protokol for en metode til at inducere sværmerLl differentiering på en agaroverflade. Protokollen producerer en population af let tilgængelige sværmerceller, der er tilgængelige for enkeltcellemikroskopi og efterfølgende analyse. Desuden muliggør protokollen lokaliseringsstudier af fluorescensmærkede proteiner i både svømmer- og sværmercelletyperne (sektioner 1, 2, 3, 4). Desuden beskriver protokollen den efterfølgende arbejdsgang om, hvordan man behandler og analyserer de genererede data fra fluorescensmikroskopi eksperimenter, som muliggør demografisk analyse af bakterielle samfund (afsnit 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af elektrokompetente V. parahaemolyticusceller og elektroporation af plasmid-DNA i svømmerceller
BEMÆRK: Følgende afsnit i protokollen tillader fremstilling af elektrokompetente celler og den efterfølgende elektroporation af plasmid-DNA i svømmerceller. Dette trin er vigtigt, hvis fluorescerende proteiner eksploderes ectopisk fra et plasmid.
- Strim ud V. parahaemolyticus celler fra en -80 ° C glycerol stamme på en frisk LB agar plade indeholdende 100 μg / ml ampicillin og inkuber natten over ved 37 ° C.
- Den følgende dag inokulerer 200 ml LB-medium med en enkelt koloni af V. parahaemolyticus og inkuberer den ved 37 ° C under omrystningsbetingelser, indtil en OD 600 på 1,0 er nået. Det tager sædvanligvis 5-6 timer inkubering for cellekulturen at nå den ønskede optiske densitet.
- Overfør straks cellerne til is og perfOrm alle yderligere trin på is og i 4 ° C forkølede centrifuger.
- Høst cellerne ved 4 ° C i 10 minutter ved 2000 x g.
- Kassér supernatanten ved dekantering og suspender cellepelleten igen i 25 ml iskold 273 mM sucroseopløsning (pH 7,4, bufret med KOH).
- Høst cellerne igen ved 4 ° C i 10 minutter ved 2000 x g. Gentag to ekstra gange.
- Suspender den vaskede cellepellet i 400 μl iskold 273 mM sucroseopløsning. Derefter tilsættes glycerol til en slutkoncentration på 15% vol / vol. Cellerne er nu klar til elektroporation, men kan også fryses i alikvoter på 70 μl ved -80 ° C til senere anvendelse.
- Til elektroporation blandes en 70 μl alikvot af elektrokompetente celler med 100-1000 ng plasmid DNA og overfører blandingen til en iskold elektroporationskuvette (0,2 cm elektrodeafstand). Udfør elektroporation med følgende indstillinger: 25 μF, 2400 V og 200 Ω.
- SuspenderCeller i elektroporationskuvetten i 600 μl LB bouillon, overføres til et 2 ml rør og inkuberes under omrystning ved 37 ° C i 3 timer.
- Spin ned cellerne ved 2.000 xg i 5 minutter og suspender pelleten igen i 100 μl LB bouillon. Spred cellesuspensionen på selektive LB-agarplader indeholdende de nødvendige antibiotika og inkuber ved 37 ° C natten over.
- Den følgende dag skal du kontrollere pladerne til kolonidannelse. Kolonier, der vokser, bærer det korrekte antibiotikaresistensgen kodet på plasmidet og kan nu anvendes til yderligere forsøg.
2. Induktion af svarmercelledifferentiering
BEMÆRK: Følgende trin beskriver, hvordan man inducerer differentiering af V. parahaemolyticus i sin livscyklus for sværmerceller og hvordan man stimulerer proliferation på faste overflader.
- Suspender 4 g Heart Infusion (HI) Agar i 100 ml ddH 2 O for at forberede de sværmende plader.
- Kog forsigtigt HI-agaropløsningen i mikrobølgeovnen og ryst flasken fra tid til anden, indtil pulveret er opløst. Autoklav ved 121 ° C i 20 minutter.
- Efter autoklavering afkøles HI-agaren til 60-65 ° C. Tilsæt 2,2'-bipyridyl til en slutkoncentration på 50 μM (stamopløsning af 50 mM i 100% ethanol). Tilsæt CaCl2 til en slutkoncentration på 4 mM (stamopløsning af 4 M i ddH20). Tilføj om nødvendigt antibiotika i opløsningen for at opretholde plasmider.
BEMÆRK: Hvis du planlægger at bruge et inducerbart plasmid, tilsæt induktionsmiddel til dets endelige koncentration.
FORSIGTIG: 2,2'-Bipyridyl: Akut toksicitet (oral, dermal, indånding). Brug handsker og sikkerhedsbriller ved håndtering af dette kemikalie. - Hæld 30 - 35 ml af den endelige HI agaropløsning i en rund 150 mm petriskål, og lad agaret størkne.
- Lige før spotting af cellekulturen tørres agarpladen ved 37 ° C i mindst 10 minutter (eller indtil eventuelle flydende rester har disaPpeared, men ikke længere) op til højre med et åbent låg.
BEMÆRK: Tørretider afhænger meget af den anvendte inkubator, og stærkt tørrede plader tillader ikke svampning af V. parahaemolyticus . (Dette trin er meget vigtigt!) Plader skal bruges friske og bør ikke være ældre end 2 - 3 timer. Gamle plader bliver for tørre til at stimulere sværmer. - Inokulere en lille mængde celler fra kanten af en enkelt koloni til 5 ml LB bouillon. Inkuber kulturen omrystning ved 37 ° C indtil OD 600 = 0,8 nås, det tager normalt omkring 2-3 timer. Derefter er cellerne klar til at blive spottet på HI swarming agarplader.
- Spot 1 μl cellekultur i midten af en HI-agar swarming plade ( Figur 1A ).
- Lad pletten tørre ( figur 1B ).
- Sæt pladen med klart plastikbånd og sørg for, at det er fastgjort, ellers kan det løsne sig under inkubation natten over ( Figur 1C ).
BEMÆRK: Det erMeget vigtigt, at forseglingen er perfekt. Undgå dannelsen af luftbobler og folder på båndet, når det påføres. - Inkuber pladen ved 24 ° C natten over. Dette vil resultere i dannelsen af en V. parahaemolyticus sværmkolonie med sværgeflares, der strækker sig fra periferien af sværmkolonien ( figur 2 ).
3. Fremstilling af V. parahaemolyticus swarmerceller til fluorescensmikroskopi
BEMÆRK: Følgende protokol beskriver, hvordan man fremstiller mikroskopi-agaroseskinner og den efterfølgende prægning af sværmende blusser på en agarosepude for at opnå single swarmerceller til mikroskopi.
- For at fremstille agaroseskinner til mikroskopi, tilsættes 1 g agarose til 100 ml af en 20% vol / vol PBS og 10% vol / vol LB bouillonopløsning. Kog forsigtigt opløsningen i mikrobølgeovnen for at opløse agarosen og lad den køle ned til 65-70 ° C under blanding med en magnetisk omrører.
- Placer acMagert mikroskop dias på en perfekt niveau sektion af en arbejdsbænk. Dæk begge ender af diaset med to lag med almindeligt laboratoriemærkningstape, og fastgør diaset til arbejdsbænken. Afstanden mellem de to stykker tape skal være omkring 3 cm.
BEMÆRK: De to lag af tape skaber en meget lille højde, som bestemmer højden af agarosepuden. Det er vigtigt, at arbejdsområdet er niveau for at sikre, at cellerne kommer i samme plan til mikroskopianalyse. - Pipet ~ 250 μL af den tidligere fremstillede agaroseopløsning på den ikke-dækkede glasoverflade.
- Placer nu et andet mikroskopglas i samme retning som den nederste på toppen og tryk let på den, så den resterende agarose kan strømme ud til siderne.
- Lad agarosen størkne 1-2 minutter, og træk derefter langsomt glaspladen ud af bunden i en vandret bevægelse.
- Ved hjælp af en skalpell, afskær den resterende agarose, der er fastgjort tilSider af mikroskop dias og langsomt fjerne båndet fra enderne af mikroskop dias.
BEMÆRK: Agarosesklapet er nu klar og skal bruges så hurtigt som muligt, da det langsomt begynder at tørre ud. - For at udføre mikroskopi på sværmerceller skal du klippe en ~ 3 mm x 10 mm stykke swarming agar fra den yderste kant af en sværmende koloni ( Figur 1D ). Det er meget vigtigt ikke at ødelægge svejseplatens tapeforsegling, før umiddelbart før overførsel af sværmerceller til mikroskopglaset. Når båndet er fjernet, initierer swarming V. parahaemolyticus celler differentiering i svømmerceller.
BEMÆRK: Sørg for at styre udskæringerne udefra af den sværmende koloni kant til indersiden af kolonien ( Figur 1D ). På denne måde kan du forhindre "svømmerforurening" i kanten af den sværmende koloni. - Overfør stykket swarming agar på et mikroskop agarose dias med cellerne mod agarose paD ( figur 1E ). Dette aftrykker de sværmende celler på agarosepuden.
- Efter at have ventet ~ 30 s, fjern agar stykket forsigtigt fra agarosepuden ( figur 1F ).
- Anbring et glasdæksel på agarosepuden, hvor cellerne blev præget. Cellerne er nu klar til mikroskopi.
BEMÆRK: Det er vigtigt at image swarmer celler straks, da swarmerceller langsomt initierer differentiering til svømmerstaten.
4. Fremstilling af V. parahaemolyticus svømmercellekulturer til fluorescensmikroskopi
BEMÆRK: Dette afsnit i protokollen beskriver, hvordan man forbereder en kultur af V. parahaemolyticus til at udføre fluorescensmikroskopi på svømmercelletypen.
- Inokulere en lille mængde celler fra kanten af en enkelt koloni til 5 ml LB bouillon. Inkubér kulturen omrystning ved 37 ° C i 1 time eller indtil en lille cellevækst bliver synlig.
- PåDette trin tilføjer, hvis det er nødvendigt, inducerende middel til ekspression af proteiner af interesse. I dette eksempel blev L-arabinose tilsat til en slutkoncentration på 0,2% (vægt / volumen) for at inducere ekspression af YFP-CheW 9 .
- Inkubér kulturen omrystning i yderligere 2 timer ved 37 ° C.
- Følg trin 3.1-3.7 for at forberede mikroskopi-agaroseskinner.
- Spot 1 μl cellekultur i midten af agarosepuden og lad pletten inkuberes, indtil den er tør.
- Placér et glasdæksel på agarosepuden, hvor cellerne blev plettet. Cellerne er nu klar til at blive afbildet under fluorescensmikroskopet.
5. Billedanalyse
Denne del af protokollen beskriver en arbejdsgang til billedanalyse, især hvordan man fjerner fluorescensdata for enkeltceller til demografisk analyse.
- Før du begynder billedanalysen, skal du sørge for, at alle mikroskopiske billeder gemmes i 16bit TIF-format.
- Indlæs DIC (eller fasekontrast) og de tilhørende fluorescerende kanalbilleder i softwaren.
- Generer et overlay billede af begge kanaler ved at vælge "Vis / Overlay billeder". Indstil antallet af billeder ("# Images:") til to, og vælg DIC-billedet i den første kanal og det fluorescerende billede i den anden kanal.
- Vælg værktøjet "Multi-Line" fra værktøjslinjen og markér celler fra en pol til den anden gennem midten af cellen. For at få en liste over alle genererede linjer (linjeposter) skal du åbne "Mål / Regionmålinger". Konfigurer regionmålinger til kun at vise regionens etiket, afstand og gennemsnitsintensitet.
- Kalibrere pixelstørrelsen under "Mål / Kalibrere afstande" til pixelstørrelsen, der er specifik for din mikroskopopsætning, og klik på "Anvend på alle åbne billeder".
- Overfør alle regioner (linjeposter) til fluorescerende kanalbillede. Under "Regioner / TransfEr Regions "vælg kildebilledet (overlejringsbilledet) og destinationsbilledet (fluorescerende kanalbilledet). Vælg" Alle regioner "og tryk på" OK ".
BEMÆRK: For at kunne genproducere de nøjagtige linjer (linjeposter, regioner, ROI) senere, skal du åbne "Regioner / Gem regioner" og gemme regionerne. - Eksporter alle regionmålinger til et regneark ved at åbne "Mål / Regionmålinger" og trykke på "Åbn log". Bekræft at åbne og eksportere dataene. Når regnearket er åbnet i baggrunden, skal du endelig eksportere dataene ved at trykke på "F9: Log Data".
- For at bestemme positionen af fluorescerende foci langs cellen, skal du åbne "Measure / Linescan". Indstil "Linescan Width" til en værdi, så hele cellenes bredde er dækket af den region, som du tidligere oprettede. Højreklik på linjeskanningsgrafen og vælg "Vis grafdata". Ved at venstre-klikke og trække mus-courser langs linjeskanningen tilInteressepunkt, vinduet "Graph Data" viser den tilsvarende pixel / afstand mellem de to punkter. Vælg den blå markerede række og kopier derefter indholdet.
BEMÆRK: Hele linjeskanningsintensitetsprofilen kan logges til et regneark ved at trykke på "Log Data" i vinduet "Linescan". De udvindte data kan nu bruges til visualisering i grafer eller yderligere statistisk analyse. Lokaliseringsmønstre over cellecyklusen kan let visualiseres i en demografisk repræsentation af cellelængden og fluorescerende intensiteter langs cellelegemet. Disse repræsentationer kan opnås ved anvendelse af de tidligere valgte ROI'er. De følgende trin vil give et eksempel på, hvordan man genererer demografi, der ligner dem, der er vist i figur 3C og 4C .- I Fiji / ImageJ-belastningsområdet markeringer (.rgn), der tidligere blev oprettet i softwaren (trin 5.6) ved hjælp af importøren "Metamorph nd & ROI files";. Alternativt kan områder af interesse (ROI) af cellerne, der skal analyseres, oprettes direkte i Fiji / ImageJ ved hjælp af det indbyggede "Segmenteret Linie" værktøj.
- Åbn "Analyser / Værktøjer / ROI manager" og markér alle aktive listeposter ".
- Klik derefter på "Mere / Multi Plot" og vælg derefter "List" i det nye "Multi Plot" vindue. Klik på en tabelindgang, vælg derefter og "kopier alle". Derefter indsæt i et nyt regneark.
BEMÆRK: Sørg for, at dataene i den længste celle (to tilsvarende X- og Y-kolonner med flest antal rækker) er den sidste til højre i regnearket. - Gem regnearket som en "CSV (Comma-afgrænset) (* .csv)".
- Download R-scriptene herfra "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10. Skripterne sorterer celler efter længde og normaliserer fluorescensintensitetsprofilerne for alle celler som et gennemsnit af hver celle fluorescense.
- Kør hele scriptet "celleprofiler function.R" i R [version 3.0.1; 11 ].
- Rediger scriptet "example plots.R" i linje 30, så filstien refererer til den mappe, hvor den tidligere genererede .csv-fil er gemt. Desuden ændrer du filnavnet "profile.csv" i linje 31 til det filnavn, der er valgt for .csv-filen, der blev genereret i trin 5.9.4. Derefter kør "eksempel plots.R" og følg dokumentationen fra "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" såvel som kommentarer fra scriptfilen til generering af demografisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Induktion af differentiering og generation af sværmende kolonier
Figur 1 giver et skema over de vigtige trin involveret i fremstilling af sværmende kolonier af V. parahaemolyticus ( figur 1A-C ). En svømmerkultur blev spottet på swarm-agar og inkuberet ved 24 ° C, hvilket inducerede sværmer differentiering og proliferation over den faste agaroverflade. Et repræsentativt stereomikroskopi billede af en swarming koloni er vist i figur 2 . Stereomikroskopi billeddannelse viser tydeligt sværm-blænding, der strækker sig udad fra sværmkoloniens periferi. Højere forstørrelse afslører, at i sværm-fanger celler kun er grupperet i mono- eller bi-lag, mens der i midten af sværmkolonien er stablet i flere lag ( figur 2A ). Swarm-flares kan let overføres (som beskrevet i trin 3.8-3.11,
Fluorescensmikroskopi og billedanalyse
Figur 1: Induktion af sværmer differentiering og fremstilling af celler til mikroskopi billeddannelse. Forenklet visualisering af workflow for at producere V. parahaemolyticus swarmer celler og fremstilling af mikroskop dias til mikroskopi analyse af single swarmer celler. ( A ) Spot 1 μL af en OD 600 = 0,8 cellekultur af V. parahaemolyticus i midten af en HI agar swarming plade. ( B ) inkubér stedet indtil det er tørret, og cellerne er fastgjort til agaroverfladen. ( C ) Sæt Petriskålen med klæbende tape. Inkuber pladen ved 24 ° C i 16 timer. ( D ) Beskær forsigtigt et lille stykke HI agar fra den ydre kant af den sværmende koloni. ( E ) Overfør excisionen på en mikrOscopy agarosepude med sværmercellerne vendt mod agarosepuden. Efter en kort inkubationstid på 30 s præges sværmercellerne på agarosepuden. ( F ) Fjern forsigtigt udskåret agar fra agarosepuden og læg en mikroskopisk dækslip ovenpå. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Organisationen af celler i en V. parahaemolyticus Swarming Colony. ( A ) Stereomikroskopi af en V. parahaemolyticus swarmerkoloni. De øvre paneler viser den ydre kant af en sværmende koloni i stigende forstørrelse. Bundpanelerne viser et område af den sværmende koloni mellem midten og kanten i stigende forstørrelse. Sværdblusser strækker sig fra periferien afSværtekolonien. ( B ) Repræsentative DIC mikroskopi billeder af sværmer koloni kanten (øverste panel) og et område mellem midten og periferien (bundpanel) efter overførsel af celler fra de respektive angivne steder af sværmekoloni. Sværdblusserne blev præget direkte på en mikroskopi-agarosepude som beskrevet i trin 3.8-3.11. Celler fra området mellem centrum og periferien blev først skrabet af sværmkolonien og genopslæmmet i LB bouillon før de blev spottet på en mikroskopi agarosepude. Skalestang = 7,5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Lokalisering af kemotaxisarrayer i svømmerceller af V. parahaemolyticus. ( A ) DIC og fluorescerende mikroskopi billeder af vildtype V. parahaemolyticus svømmerceller , der ektopisk udtrykker YFP-CheW. ( B ) Graf, der viser YFP-CheW foci-fordeling ved at plotte afstanden fra foci fra cellepolerne som en funktion af cellelængde i svømmerceller. ( C ) Demografisk analyse af fluorescensintensitetsprofiler af V. parahaemolyticus svømmerceller , der udtrykker YFP-CheW. Celler sorteres efter cellelængde og viser relativ fluorescerende intensitet. Målestang = 5 μm. Panel B og C er tilpasset fra reference 9 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Lokalisering af kemotaxis-arrays i sværmerceller af V. parahaemolyticus. A ) DIC og fluorescerende mikroskopi billeder af vildtype V. parahaemolyticus swarmerceller, der eksploderer YTP-CheW ektopisk. ( B ) Graf, der viser YFP-CheW foci-fordeling ved at tegne afstanden fra foci fra cellepolerne som en funktion af cellelængde i sværmerceller. ( C ) Demografisk analyse af fluorescensintensitetsprofiler af V. parahaemolyticus swarmerceller, der udtrykker YFP-CheW. Celler sorteres efter cellelængde og viser relativ fluorescerende intensitet. Målestang = 5 μm. Panel B og C er tilpasset fra reference 9 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir rapporterer en metode til mikroskopisk billeddannelse af V. parahaemolyticus swarmerceller efterfulgt af downstream-analyser beregnet til at løse og kvantificere den subcellulære lokalisering og andre træk ved de undersøgte fluorescensmærkede proteiner. Selv om der findes flere værktøjer til mikroskopi billedbehandling og analyse 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , forbliver analysen af V. parahaemolyticus swarming celler stadig udfordrende, for det meste fordi de normalt findes inden for et tæt cellefællesskab, og der er en stor variation i cellelængde ( Figur 2 ). Derfor er automatiseret celle detektion sommetider defekt, og dermed er resultaterne noget upålidelige. Denne protokol beskriver en pipeline designet til at vokse, billedet og analysere svampende celler af V. parahaemolyticus , som er skræddersyet til specimenIfic behov for disse celler, såsom et kontrolleret vækstmiljø på en overflade og nedstrøms billedanalyser, der imødekommer tilstedeværelsen af celler af variable længder, der vokser i nærhed.
Evnen til ektopisk at udtrykke et protein af interesse fra et plasmid kan være vigtigt for adskillige forsøg, fx ekspression af fluorescensmærkede proteiner til mikroskopi studier eller komplementering af gendeletioner. Her beskrives processen med at fremstille kemisk kompetente celler og elektroporation af plasmid-DNA i V. parahaemolyticus. Fordelen ved elektroporering over konjugering, som ofte anvendes til V. parahaemolyticus , er, at plasmid-rygrad ikke behøver at blive modificeret for at tillade konjugering. Ikke desto mindre bør der træffes visse forholdsregler; Som beskrevet i trin 1.2, er det meget vigtigt at nå en celletæthed på OD 600 = 1,0. Ved lavere optiske densiteter vil celler lyse på elektroporatiPå og ved højere densiteter optages plasmidet ikke af cellerne. Endvidere vil for hård centrifugering af V. parahaemolyticus- celler (trin 1.4-1.6) drastisk reducere elektroporationseffektiviteten. Det er også vigtigt at suspendere cellepelleten forsigtigt under vaskningstrinnene for at frembringe elektrokompetente celler.
Selvom fremstillingen af en cellekultur lyder trivial, er kulturtætheden meget vigtig for sværmende ydeevne. Generelt vil en cellekultur i den tidlige eksponentielle vækstfase (OD 600 <0,5) producere en større sværmekoloni under inkubation natten over end en kultur i sen eksponentiel eller tidlig stationær fase. Afhængig af eksperimentet kan en større swarming koloni være gavnlig. For at sammenligne kolonienes ekspansion og morfologi mellem forskellige stammer dyrket på samme HI agar swarming plade er det imidlertid vigtigt at have tilstrækkelig plads til rådighed mellem individuelle sværmende kolonier. Dette kan være achOpnået ved at spotte en cellekultur med højere optisk densitet, som normalt vil resultere i mindre sværmende kolonier.
Induktion af den sværmende fænotype varierer betydeligt blandt bakteriearter, og reproducerbarheden heraf er stærkt påvirket af faktorer som agar og næringsstofsammensætning, omgivelsestemperaturen og fugtindholdet i begge omgivelser og vækstmedium. Følgelig påvirker mindre ændringer i protokollen og det eksterne miljø signifikant sværhedsanalyseresultater og induktion af sværmer differentiering. Protokoller til induktion af svømmer af andre bakteriearter som Pseudomonas aeruginosa og Bacillus subtilis er blevet rapporteret 19 . De trin, der beskrives i denne protokol, vil pålideligt producere sværmercelle-typen af V. parahaemolyticus og opretholde dem i form af sværmende kolonier, der producerer enkeltlagede sværmerblusser ved kanten af kolonien. At udføre stabile ogReproducerbare eksperimenter på swarmer celletypen af V. parahaemolyticus , er fremstillingen af HI swarming agarplader den vigtigste del af denne protokol. Især kan tørringstrinnet kræve optimering, da hver inkubator vil udføre forskelligt. En anden faktor, der kan påvirke sværmende opførsel, er den type plast, der anvendes i petriskålene. De typiske petriskåle, der anvendes i vores laboratorium til at udføre swarming eksperimenter, er lavet af polystyren (PS). Ved anvendelse af petriskåle fremstillet af lavdensitetspolyethylen (PE LD) fremstillede man imidlertid blandede resultater i sværmeanalyser. Det er afgørende at følge de beskrevne trin, fordi kun så reproducerbare sværmende kolonier, som udviser en særdeles perifert flareformation, vil danne, som muliggør en enkelt sværmercellemikroskopi.
Utvivlsomt kan forskellige fremgangsmåder tages for at vise resultaterne af fluorescerende mikroskopi undersøgelser af V. parahaemolyticus swarming celler. For instancE, det meget anvendte program MicrobeTracker 16 repræsenterer et sandsynligt alternativ. Den nyligt tilgængelige MicrobeTracker ansøgning Oufti 20 , som ikke kræver MATLAB, er også et andet alternativ. Brugen af DIC-billeder (differential interface contrast) er imidlertid ikke mulig i Oufti, og fasekontrastbilleddannelse er ikke egnet til at skelne cellesegmentering i sværmerceller. Desuden er ikke alle mikroskoper udstyret til fasekontrastbilleddannelse, og i sin tur er fasekontrastbilleddannelse ikke egnet til alle former for mikroskopianalyse. Et andet lovende værktøj, som er gratis og ImageJ-baseret, er MicrobeJ 17 , men endnu engang kan kun fase kontrast og fluorescerende billeder bruges. Desuden giver denne protokol kun mulighed for billeddannelse og analyse af celler på bestemte tidspunkter i deres livscyklus. Imidlertid er en fremragende protokol, der beskriver time-lapse billedbehandling og den efterfølgende billedanalyse, som giver mulighed for at følge singleCellebaner og proteindynamik 21 kan sandsynligvis også anvendes på V. parahaemolyticus .
Følgende trin beskrevet i denne protokol vil gøre det muligt for forskere at udføre pålidelig og reproducerbar enkeltcellet fluorescensmikroskopi på både svømmer- og sværmercelle-typen af V. parahaemolyticus . Denne protokol beskriver en robust måde at transformere V. parahaemolyticus fra sin svømmer ind i sin swarmer celletype. Ved at præge monolaget af sværmerceller fra de perifere fnug af sværmende kolonier på en agarosepude, kan den intracellulære lokalisering af proteiner observeres, pipeline for billedanalyse kan sandsynligvis anvendes på andre bakteriearter, der findes inden for bakterielle samfund, hvor celler vokser i Meget nærhed og situationer, hvor automatiseret billedanalyse måske ikke er til en fordel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
