Summary
Detta protokoll möjliggör enkelcellsmikroskopi av de differentiellt distinkta Vibrio parahaemolyticus- simmaren och svärmcellerna. Metoden producerar en population av swarmerceller som är lätt tillgängliga för enkelcellsanalys och täcker beredning av cellkulturer, induktion av swarmerdifferentiering, provberedning och bildanalys.
Abstract
Möjligheten att studera intracellulär lokalisering av proteiner är avgörande för förståelsen av många cellulära processer. Detta kräver i sin tur förmågan att erhålla enskilda celler för fluorescensmikroskopi, vilket kan vara särskilt utmanande när avbildande celler som existerar inom bakteriella samhällen. Till exempel existerar den humana patogenen Vibrio parahaemolyticus som korta stavformade simmarceller i flytande tillstånd som vid ytkontakt differentierar till en subpopulation av höglånga svärmceller specialiserade för tillväxt på fasta ytor. Detta papper presenterar en metod för att utföra encellsfluorescensmikroskopianalys av V. parahaemolyticus i sina två differentiella tillstånd. Detta protokoll inducerar väldigt reproducerbart differentiering av V. parahaemolyticus i livscykel för svärmercell och underlättar deras proliferation över fasta ytor. Metoden producerar flares av differentierade swarmerceller som sträcker sig från tHan svärmkoloniens kant. I synnerhet, i själva verket av svärmflikarna finns svärmceller i ett enda lager av celler, vilket möjliggör deras lätta överföring till en mikroskopdia och efterföljande fluorescensmikroskopi avbildning av enskilda celler. Dessutom presenteras arbetsflödet av bildanalys för demografisk representation av bakteriella samhällen. Som ett principprincip beskrivs analysen av den intracellulära lokaliseringen av kemotaxis-signaleringsarrayer i simmare och svavelceller av V. parahaemolyticus.
Introduction
Bakterier upplever ständigt förändringar i sin yttre miljö och har utvecklat flera tekniker för att ändra och anpassa sitt beteende i enlighet därmed. En sådan mekanism innebär differentiering i olika celltyper som bättre kompletterar den förändrade miljön. Differentiering innebär ofta stora förändringar i regleringen av cellcykeln, cellmorfologin och den spatiotemporala organisationen av cellerna. En organism som kan genomgå differentiering är Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus tillhör Vibrionaceae , som är en familj av proteobakterier som vanligtvis bor i färskt eller saltvatten. Vibrionaceae distribueras i stor utsträckning i miljön och innehåller flera arter som orsakar tarmkanalinfektioner hos människor, även Vibrio cholerae. V. Parahaemolyticus är en dimorf organism och kan differentiera i två distinkta celltyper som ett svar för att rymma förändringar i dessYttre miljö. I vattenhaltiga miljöer existerar den som en kort stavformad simmarcell med en enda polär flagellum placerad vid den gamla cellpolen. Vid ytkontakt utlöses differentiering i en svärmercell. Swarmercelldifferentiering innebär två stora förändringar: svärmercellmorfogenes genom inhibering av celldelning och induktion av ett andra flagella-system. Detta resulterar i bildandet av en peritrik och långsträckt stångformad svärmceller, som antingen kan fortsätta svärmarnas livsstil, där divisionshändelser resulterar i avkomma swarmerceller eller alternativt differentierar tillbaka till simmarceller.
Flera faktorer har rapporterats inducera eller påverka svärmerdifferentiering. Den primära stimulansen verkar drivas av mekanosensning där V. parahaemolyticus använder polär flagellum som en taktil sensor som detekterar inhibering av rotation vid ytkontakt, men flera andra faktorer är involverade somBrunn 1 I laboratoriet kan rotation av det polära flagellumet inhiberas artificiellt genom tillsats av fenamil, vilket blockerar den natriumkanalstyrda flagellära rotationen, varigenom svärmerdifferentiering 2 induceras. Vidare inducerades Vibrio alginolyticus i en tidigare studie att svärma på fast medium när celler propagerade på tillväxtmedium i en Petri-skål förseglad med klart plastband. Alkalimättat filterpapper förhindras att svälla under dessa förhållanden, vilket tyder på att en eller flera flyktiga syror kan vara involverade i induktion av svärmning. Således förseglar Petri-skålen med plastband som troligen tillåts för ackumulering av flyktiga syror, som bildas som biprodukter av cellulär metabolism, inuti plåtets huvudytor. Samma effekt uppnåddes när H2O2 tillsattes till tillväxtmediet i otätta petriskålar för att artificiellt producera flyktiga syror genom hydrolysering av mediekomponenter
V. parahaemolyticus differentiering innebär stora förändringar i regleringen av celldelning, cellmorfologi och positionering av makromolekylära maskiner såsom flagellA och kemotaxisapparater - processer som alla kräver den specifika lokaliseringen av proteiner i enlighet med cellcykeln. Således är förmågan att studera den intracellulära lokaliseringen av sådana proteiner väsentlig för förståelsen av de tidigare nämnda cellulära processerna. För att utföra sådana studier krävs fluorescensmikroskopi på enskilda celler. Detta kan vara särskilt utmanande när avbildningsceller som finns inom täta bakteriepopulationer, som det är fallet för svärmceller. Det har försökt induceras svärmdifferentiering i flytande media, som potentiellt kan generera enskilda celler för mikroskopi-studier. Och även om dessa celler på transkriptionell nivå delvis har inducerat swarmer-differentieringsprogrammet, genomgår de inte samma distinkta morfologiska förändringar som fullständigt differentierade swarmerceller odlade på fast medium 8 . Detta papper erbjuder ett robust och reproducerbart protokoll av en metod för att inducera svärmercellerLl differentiering på en agar yta. Protokollet producerar en population av lättillgängliga swarmerceller som är tillgängliga för enkelcellsmikroskopi och efterföljande analys. Vidare möjliggör protokollet lokaliseringsstudier av fluorescensmärkta proteiner i både simmar- och svärmercelltyperna (sektionerna 1, 2, 3, 4). Dessutom beskriver protokollet det efterföljande arbetsflödet om hur man bearbetar och analyserar de genererade data från fluorescensmikroskopi experiment, vilket möjliggör demografisk analys av bakteriella samhällen (avsnitt 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av elektrokompetenta V. parahaemolyticus- celler och elektroporation av plasmid-DNA i simmarceller
OBS: Följande avsnitt i protokollet möjliggör framställning av elektrokompetenta celler och efterföljande elektroporation av plasmid-DNA i simmarceller. Detta steg är viktigt om fluorescerande proteiner uttrycks ektopiskt från en plasmid.
- Stryk ut V. parahaemolyticus- celler från ett -80 ° C glycerollager på en ny LB-agarplatta innehållande 100 | ig / ml ampicillin och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Följande dag inokulerar 200 ml LB-medium med en enda koloni av V. parahaemolyticus och inkuberar den vid 37 ° C under skakningsbetingelser tills en OD 600 av 1,0 är uppnådd. Det tar vanligtvis 5-6 h inkubering för cellodlingen att nå den önskade optiska densiteten.
- Överför omedelbart cellerna till is och perfOrm alla ytterligare steg på is och i 4 ° C förkylda centrifuger.
- Skörda cellerna vid 4 ° C i 10 minuter vid 2000 x g.
- Kassera supernatanten genom dekantering och suspendera cellpelleten i 25 ml iskall 273 mM sackaroslösning (pH 7,4, buffrad med KOH).
- Skörda cellerna igen vid 4 ° C under 10 minuter vid 2000 x g. Upprepa ytterligare två gånger.
- Återupplösa den tvättade cellpelleten i 400 | il iskall 273 mM sackaroslösning. Därefter tillsättes glycerol till en slutlig koncentration av 15% vol / volym. Cellerna är nu redo för elektroporering, men kan också frysas i alikvoter av 70 | il vid -80 ° C för senare användning.
- För elektroporation, blanda en 70 μl alikvot av elektrokompetenta celler med 100-1000 ng plasmid-DNA och överför blandningen till en iskall elektroporationskuvett (0,2 cm elektrodgap). Utför elektroporation med följande inställningar: 25 μF, 2400 V och 200 Ω.
- Stäng avCeller i elektroporationskuvetten i 600 | il LB-buljong, överför till ett 2 ml rör och inkubera under skakning vid 37 ° C under 3 timmar.
- Snurra ner cellerna vid 2000 xg i 5 min och suspendera pelleten igen i 100 | il LB buljong. Spread cellsuspensionen på selektiva LB agarplattor innehållande nödvändiga antibiotika och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Följande dag, kolla tallrikarna för kolonibildning. Kolonier som växer bär den korrekta antibiotikaresistensgenen som kodas på plasmiden och kan nu användas för ytterligare experiment.
2. Induktion av svärmercellsdifferentiering
OBS! Följande steg beskriver hur man inducerar differentiering av V. parahaemolyticus i sin livscykel för svärmerceller och hur man stimulerar proliferation på fasta ytor.
- Suspendera 4 g hjärtinfusion (HI) Agar i 100 ml ddH 2 O för att förbereda de svärmande plattorna.
- Koka försiktigt HI-agarlösningen i mikrovågsugnen och skaka flaskan från tid till gång tills pulvret är upplöst. Autoklav vid 121 ° C i 20 min.
- Efter autoklavering, svalna HI-agaren till 60-65 ° C. Tillsätt 2,2'-bipyridyl till en slutlig koncentration av 50 μM (stamlösning av 50 mM i 100% etanol). Tillsätt CaCl2 till en slutlig koncentration av 4 mM (stamlösning av 4 M i ddH20). Vid behov tillsätt antibiotika i lösningen för att bibehålla plasmider.
OBS! Om du planerar att använda en inducerbar plasmid, tillsätt inducerande medel till dess slutkoncentration.
VARNING: 2,2'-Bipyridyl: Akut toxicitet (oral, dermal, inandning). Använd handskar och skyddsglasögon vid hantering av denna kemikalie. - Häll 30 - 35 ml av den slutliga HI-agarlösningen i en rund 150 mm petriskål och låt agar stelna.
- Strax före spottning av cellkulturen torkar agarplattan vid 37 ° C i minst 10 minuter (eller tills eventuella flytande rester har disaPpeared, men inte längre) upp till höger med ett öppet lock.
OBS: Torkningstiderna beror mycket på den använda inkubatorn och tungt torkade plattor tillåter inte svampning av V. parahaemolyticus . (Detta steg är väldigt viktigt!) Plattorna måste användas färskt och bör inte vara äldre än 2 - 3 timmar. Gamla tallrikar kommer att vara för torra för att stimulera svärmningen. - Inokulera en liten mängd celler från kanten av en enda koloni i 5 ml LB-buljong. Inkubera kulturen som skakar vid 37 ° C tills OD 600 = 0,8 uppnås, det tar vanligtvis omkring 2-3 timmar. Därefter är cellerna redo att bli upptäckta på HI swarming agarplattor.
- Ställ 1 μl cellodling i mitten av en Hl-agar-svärmplatta ( Figur 1A ).
- Låt platsen torka ( Figur 1B ).
- Tät plåten med tydligt plastband och se till att det är ordentligt fastsatt, annars kan det lossna under inkubation över natten ( Figur 1C ).
OBS: Det ärMycket viktigt att tätningen är perfekt. Undvik bildandet av luftbubblor och vikningar på tejpen när den appliceras. - Inkubera plattan vid 24 ° C över natten. Detta kommer att resultera i bildandet av en V. parahaemolyticus svärmkoloni med svärmflikar som sträcker sig från periferin av svärmkolonin ( Figur 2 ).
3. Framställning av V. parahaemolyticus svarmerceller för fluorescensmikroskopi
ANMÄRKNING: Följande protokoll beskriver hur man förbereder mikroskopisk agarosskivor och den efterföljande avtryckningen av svärmande fläckar på en agarosplatta för att erhålla enkla svärmceller för mikroskopi.
- För att framställa agarosskivor för mikroskopi, tillsätt 1 g agaros till 100 ml av en 20% vol / vol PBS och 10 volym / volym LB buljonglösning. Koka försiktigt lösningen i mikrovågsugnen för att lösa agarosen och låt den svalna till 65-70 ° C under blandning med en magnetomrörare.
- Placera ACMagert mikroskop glid på en perfekt nivå sektion av en arbetsbänk. Täck båda ändarna av glidskyddet med två lager av laboratoriemärkningstape med allmänt ändamål, och fäst gliden på arbetsbänken. Avståndet mellan de två bitarna av tejp ska vara ca 3 cm.
OBS! De två lager av tejp skapar en mycket liten höjd, som bestämmer agarosdynans höjd. Det är viktigt att arbetsutrymmet är jämnt för att se till att cellerna kommer att ligga i samma plan för mikroskopianalys. - Pipa ~ 250 / il av den tidigare framställda agaroslösningen på den icke-täckta glasytan.
- Placera nu ett andra mikroskopglas i samma orientering som den nedersta på toppen och tryck lite ner den, så att kvarvarande agaros kan strömma ut till sidorna.
- Låt agarosen stelna 1-2 minuter och dra sedan långsamt glidglaset längst ned i en horisontell rörelse.
- Använd en skalpell, skära av eventuell kvarvarande agaros som är fäst vidSidorna på mikroskopglaset och ta långsamt bort tejpen från mikroskopglasets ändar.
OBS! Agarosskenan är nu klar och bör användas så snart som möjligt eftersom det sakta börjar torka ut. - För att utföra mikroskopi på svärmceller, skära ut en ~ 3 mm x 10 mm bit swarming agar från den yttersta kanten av en svärmande koloni ( Figur 1D ). Det är väldigt viktigt att inte bryta bandtätningen på svärmplattan tills omedelbart före överföring av svärmceller till mikroskopglaset. När bandet avlägsnats initierar swarming V. parahaemolyticus- celler differentiering i simmarceller.
OBSERVERA: Se till att styra nedskärningarna från utsidan av den svärmande kolonikanten till kolonins insida ( Figur 1D ). På så sätt kan du förhindra "simmareförorening" i kanten av den svärmande kolonin. - Överför stycket swarming agar på ett mikroskop agaros slide med cellerna mot agaros paD ( Figur 1E ). Detta avtryckar de svärmande cellerna på agarosplattan.
- Efter att ha väntat ~ 30 s, avlägsna agarbiten försiktigt från agarosplattan ( Figur 1F ).
- Placera ett glasöverdrag på agarosplattan där cellerna präglades. Cellerna är nu redo för mikroskopi.
OBS! Det är viktigt att bildsvärmceller omedelbart, eftersom svärmceller långsamt initierar differentiering till simmarstaten.
4. Framställning av V. parahaemolyticus simmarcellculturer för fluorescensmikroskopi
OBS! I detta avsnitt i protokollet beskrivs hur man förbereder en kultur av V. parahaemolyticus för att utföra fluorescensmikroskopi på simmarens celltyp.
- Inokulera en liten mängd celler från kanten av en enda koloni i 5 ml LB-buljong. Inkubera kulturen som skakar vid 37 ° C i 1 h eller tills liten celltillväxt blir synlig.
- PåDetta steg, om så behövs, adderar inducerande medel för expression av proteiner av intresse. I detta exempel tillsattes L-arabinos till en slutlig koncentration av 0,2% (vikt / volym) för att inducera expression av YFP-CheW 9 .
- Inkubera odlingen skaka under ytterligare 2 timmar vid 37 ° C.
- Följ stegen 3.1-3.7 för att förbereda mikroskopisk agarosglas.
- Ställ 1 μl cellodling i centrum av agarosplattan och låt platsen inkubera tills den är torr.
- Placera ett glasöverdrag på agaroskudden där cellerna upptäcktes. Cellerna är nu redo att avbildas under fluorescensmikroskopet.
5. Bildanalys
Denna del av protokollet beskriver ett arbetsflöde för bildanalys, särskilt hur man extraherar fluorescensdata av enskilda celler för demografisk analys.
- Innan du börjar bildanalysen ska du se till att alla mikroskopibilder sparas i 16bit TIF-format.
- Ladda DIC (eller faskontrast) och motsvarande fluorescerande kanalbilder i programvaran.
- Skapa en överlagringsbild av båda kanalerna genom att välja "Visa / Överlay-bilder". Ställ in antalet bilder ("# Images:") till två och välj DIC-bilden i den första kanalen och den fluorescerande bilden i den andra kanalen.
- Välj "Multi-Line" -verktyget från verktygsfältet och markera celler från en pol till den andra genom mitten av cellen. För att få en lista över alla genererade linjer (radobjekt) öppna "Mät / Regionmätningar". Konfigurera regionmätningarna för att bara visa regionens etikett, avstånd och medelintensitet.
- Kalibrera pixelstorleken under "Mät / Kalibrera avstånd" till pixelstorleken som är specifik för mikroskopinstallationen och klicka på "Applicera på alla öppna bilder".
- Överför alla regioner (radobjekt) till fluorescerande kanalbilden. Under "Regioner / TransfEr Regions "välj källbilden (överlagringsbilden) och destinationsbilden (bilden för fluorescerande kanal). Välj" Alla regioner "och tryck på" OK ".
OBS! För att senare kunna producera de exakta raderna (radobjekt, regioner, avkastning), öppna "Regioner / Spara regioner" och spara regionerna. - Exportera alla regionmätningar till ett kalkylblad genom att öppna "Mätning / Regionmätningar" och tryck på "Öppna logg". Bekräfta att du öppnar och exporterar data. När kalkylbladet öppnas i bakgrunden exporterar du slutligen data genom att trycka på "F9: Log Data".
- För att bestämma positionen av fluorescerande foci längs cellen, öppna "Measure / Linescan". Ställ in "Linescan Width" till ett värde så att hela cellens bredd är täckt av den region som du tidigare skapat. Högerklicka på linjeskanningsgrafen och välj "Visa grafdata". Genom att vänsterklicka och dra muspekaren längs linjeskanningen tillIntressepunktet kommer fönstret "Graph Data" att visa motsvarande pixel / avstånd mellan de två punkterna. Välj den blå markerade raden och kopiera sedan innehållet.
OBS! Hela linjescanningsintensitetsprofilen kan loggas till ett kalkylblad genom att trycka på "Log Data" i "Linescan" -fönstret. Den extraherade data kan nu användas för visualisering i diagram eller ytterligare statistisk analys. Lokaliseringsmönster över cellcykeln kan lätt visualiseras i en demografisk representation av celllängden och fluorescerande intensiteter längs cellkroppen. Dessa representationer kan erhållas med samma avkastning som tidigare valdes. Följande steg kommer att ge ett exempel på hur man genererar demografi som liknar dem som visas i figurerna 3C och 4C .- I Fiji / ImageJ-laddningsområdesmarkeringar (.rgn) som tidigare skapades i programvaran (steg 5.6) med hjälp av importören "Metamorph nd & ROI-filer";. Alternativt kan intressanta regioner (ROI) av cellerna som ska analyseras skapas direkt i Fiji / ImageJ med hjälp av det inbyggda segmentet "Segmenterad linje".
- Öppna "Analysera / Verktyg / ROI-chef" och markera alla aktiva listposter ".
- Därefter klickar du på "Mer / Multi Plot" och väljer sedan "List" i det nya "Multi Plot" -fönstret. Klicka på en tabellpost, välj sedan och "kopiera allt". Därefter klistra in i ett nytt kalkylblad.
OBS! Se till att uppgifterna i den längsta cellen (två motsvarande X- och Y-kolumner med flest antal rader) är den sista till höger i kalkylbladet. - Spara kalkylbladet som en "CSV (Comma-avgränsad) (* .csv)".
- Hämta R-skript härifrån "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10. Skriptna sorterar celler efter längd och normaliserar fluorescensintensitetsprofilerna för alla celler som ett medelvärde av varje cells fluorescense.
- Kör hela skriptet "cellprofiler function.R" i R [version 3.0.1; 11 ].
- Redigera "example plots.R" -skriptet i rad 30 så att filvägen hänvisar till mappen där den tidigare genererade .csv-filen sparades. Ändra dessutom filnamnet "profile.csv" i rad 31 till filnamnet som valts för .csv-filen som genererades i steg 5.9.4. Därefter kör "example plots.R" och följ dokumentationen från "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" samt kommentarer från skriptfilen för att generera demografisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Induktion av differentiering och generering av svärmande kolonier
Figur 1 ger en schema över de viktiga stegen involverade i att producera svärmande kolonier av V. parahaemolyticus ( Figur 1A-C ). En simmarkultur upptäcktes på svärmagar och inkuberades vid 24 ° C, vilket inducerade svärmerdifferentiering och proliferation över den fasta agarytan. En representativ stereomikroskopi av en svärmande koloni presenteras i figur 2 . Stereomikroskopi avbildning visar tydligt svärm-flares som sträcker sig utåt från svärmkoloni-periferin. En högre förstoring visar att celler i svärmfargar endast är grupperade i mono- eller bi-skikt, medan i mitten av svärmkolonin staplas celler i flera lager ( Figur 2A ). Swarm-flares kan enkelt överföras (som beskrivs i steg 3.8-3.11,
Fluorescensmikroskopi och bildanalys
Figur 1: Induktion av svärmerdifferentiering och beredning av celler för mikroskopiimaging. Förenklad visualisering av arbetsflödet för att producera V. parahaemolyticus swarmerceller och framställning av mikroskopskivor för mikroskopianalys av enkla svärmceller. ( A ) Spot 1 μL av en OD 600 = 0,8 cellodling av V. parahaemolyticus i mitten av en Hl-agar-svärmplatta. ( B ) Inkubera platsen tills den torkas och cellerna är fästa på agarytan. ( C ) Tät petriskålen med tydligt tejp. Inkubera plattan vid 24 ° C under 16 timmar. ( D ) Plocka försiktigt en liten bit HI agar från den yttre kanten av den svärmande kolonin. ( E ) Överför excisionen till en mikrOscopy agarosplatta med svärmcellerna vända mot agarosplattan. Efter en kort inkubationstid på 30 s präglas svärmcellerna på agarosplattan. ( F ) Ta försiktigt utskuret agar från agaroskudden och placera en mikroskopisk täckglas ovanpå. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Organisationen av celler i en V. parahaemolyticus Swarming Colony. ( A ) Stereomikroskopi av en V. parahaemolyticus swarmerkoloni. De övre panelerna visar ytterkanten av en svärmande koloni i ökande förstoring. Bottenpanelerna visar ett område av den svärmande kolonin mellan mitten och kanten i ökande förstoring. Swarm-flares sträcker sig från periferin avSvärmkolonin. ( B ) Representativa DIC-mikroskopiska bilder av svärmkolonikanten (övre panelen) och ett område mellan mitten och periferin (bottenpanelen) efter överföring av celler från respektive angivna platser hos den svärmande kolonin. Svärmflikarna präglades direkt på en mikroskopisk agarosplatta enligt beskrivningen i steg 3.8-3.11. Celler från området mellan mitten och periferin skrapades först av svärmkolonin och återuppslammades i LB-buljong innan de upptäcktes på en mikroskopi-agarosplatta. Skalstång = 7,5 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Lokalisering av kemotaxis-arrays i simmarceller av V. parahaemolyticus. ( A ) DIC och fluorescerande mikroskopi bilder av vild-typ V. parahaemolyticus simmarceller som uttrycker ektopisk YFP-CheW. ( B ) Graf som visar YFP-CheW-foci-fördelningen genom att avbilda avståndet från foci från cellpolen som en funktion av celllängden i simmarceller. ( C ) Demografisk analys av fluorescensintensitetsprofiler av V. parahaemolyticus simmarceller som uttrycker YFP-CheW. Cellerna sorteras efter celllängd och visar relativ fluorescerande intensitet. Skala bar = 5 μm. Panel B och C är anpassade från referens 9 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Lokalisering av Chemotaxis-arrays i svavelceller av V. parahaemolyticus. A ) DIC och fluorescerande mikroskopi bilder av vild-typ V. parahaemolyticus swarmerceller som uttrycker YFP-CheW ektopiskt. ( B ) Grafik som visar YFP-CheW-foci-fördelningen genom att avbilda avståndet från foci från cellpolen som en funktion av celllängden i svärmceller. ( C ) Demografisk analys av fluorescensintensitetsprofiler av V. parahaemolyticus swarmerceller som uttrycker YFP-CheW. Cellerna sorteras efter celllängd och visar relativ fluorescerande intensitet. Skala bar = 5 μm. Panel B och C är anpassade från referens 9 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta dokument rapporteras en metod för mikroskopi avbildning av V. parahaemolyticus swarmerceller, följt av nedströmsanalyser avsedda att lösa och kvantifiera den subcellulära lokaliseringen och andra egenskaper hos de studerade fluorescensmärkta proteinerna. Trots att flera verktyg finns för mikroskopibildbehandling och analys 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , är analysen av V. parahaemolyticus swarming celler fortfarande utmanande för det mesta eftersom de normalt finns i ett tätt cellsamfund och det finns en stor variation i celllängden ( Figur 2 ). Därför är automatiserad celldetektering ibland felaktig, och resultatet är därför lite opålitligt. Detta protokoll beskriver en pipeline avsedd att växa, bild och analysera svampande celler av V. parahaemolyticus , som är skräddarsydd för specimenIfic behov av dessa celler, såsom en kontrollerad tillväxtmiljö på en yta och nedströms bildanalyser som rymmer närvaron av celler med varierande längder som växer i närheten.
Möjligheten att ektopiskt uttrycka ett protein av intresse från en plasmid kan vara viktigt för flera experiment, t ex uttryck av fluorescensmärkta proteiner för mikroskopi-studier eller komplementering av gendeletioner. Här beskrivs även förfarandet för framställning av kemiskt kompetenta celler och elektroporation av plasmid-DNA i V. parahaemolyticus. Fördelen med elektroporation över konjugering, som ofta används för V. parahaemolyticus , är att plasmidkedjan inte behöver modifieras för att tillåta konjugering. Ändå bör vissa försiktighetsåtgärder vidtas. Som beskrivits i steg 1.2 är det mycket viktigt att nå en celldensitet av OD 600 = 1,0. Vid lägre optiska densiteter kommer celler att lysa på elektroporatiPå och vid högre densiteter tas plasmiden inte upp av cellerna. Vidare kommer för stark centrifugering av V. parahaemolyticus- celler (steg 1.4-1.6) drastiskt att minska elektroporationseffektiviteten. Det är också viktigt att suspendera cellpelleten försiktigt under tvättstegen för att generera elektrokompetenta celler.
Även om beredningen av en cellkultur låter trivial är kulturtätheten mycket viktig för svärmande prestanda. Generellt kommer en cellodling i den tidiga exponentiella tillväxtfasen (OD 600 <0,5) att producera en större svärmkoloni under inkubation över natten än en kultur i sen exponentiell eller tidig stationär fas. Beroende på experimentet kan en större swarming koloni vara till nytta. Men för att jämföra kolonimöjlighet och morfologi mellan olika stammar som odlas på samma HI agar swarmingplatta är det viktigt att ha tillräckligt med utrymme mellan enskilda svärmande kolonier. Detta kan vara achUpptäcks genom att spotta en cellkultur med högre optisk densitet vilket vanligen resulterar i mindre svärmande kolonier.
Induktion av den svärmande fenotypen varierar signifikant bland bakteriearter och reproducerbarheten av denna påverkas starkt av faktorer som agar och näringsämnesammansättning, omgivningstemperaturen och fuktinnehållet i både omgivning och tillväxtmedium. Följaktligen påverkar mindre förändringar i protokoll och yttre miljö signifikant svampanalysresultat och induktion av swarmer differentiering. Protokoll för induktion av svampning av andra bakteriearter såsom Pseudomonas aeruginosa och Bacillus subtilis har rapporterats 19 . Stegen som beskrivs i detta protokoll kommer på ett tillförlitligt sätt att producera svavelcells-typen av V. parahaemolyticus och upprätthålla dem i form av svärmande kolonier som producerar enkelskiktad svärmande fläckar vid koloniens kant. För att utföra stabila ochReproducerbara experiment på svavelcells-typen av V. parahaemolyticus är beredningen av HI swarming agarplattorna den viktigaste delen av detta protokoll. Speciellt kan torkningssteget kräva optimering, eftersom varje inkubator kommer att fungera annorlunda. En annan faktor som kan påverka svärmande beteende är den typ av plast som används i petriskålarna. De typiska petriskålarna som används i vårt laboratorium för att utföra svärmande experiment är gjorda av polystyren (PS). Användning av petriskålar gjorda av lågdensitetspolyeten (PE LD) producerade emellertid blandade resultat i svampningsanalyser. Det är avgörande att följa de beskrivna stegen, eftersom endast då reproducerbara svärmande kolonier som uppvisar distinkta perifera flareformationer kommer att bildas, vilket möjliggör singel swarmerscellmikroskopi.
Utan tvekan kan olika metoder vidtas för att visa resultaten gjorda av fluorescerande mikroskopi studier av V. parahaemolyticus swarming celler. För instancE, det mycket använda programmet MicrobeTracker 16 representerar ett rimligt alternativ. Den nyligen tillgängliga MicrobeTracker applikationen Oufti 20 , som inte kräver MATLAB, är också ett annat alternativ. Användningen av DIC-bilder (differential interface contrast) är emellertid inte möjlig i Oufti, och faskontrastbilder är inte lämpliga för att urskilja cellsegmentering i svärmceller. Dessutom är inte alla mikroskop utrustade för faskontrastbildning och i sin tur är faskontrastbilder inte lämpade för alla typer av mikroskopianalyser. Ett annat lovande verktyg, som är gratis och ImageJ-baserat, är MicrobeJ 17 , men än en gång kan endast faskontrast och fluorescerande bilder användas. Dessutom tillåter detta protokoll endast bildbehandling och analys av celler vid specifika tidpunkter i deras livscykel. Emellertid ett utmärkt protokoll som beskriver tid-lapse-bildbehandling och den efterföljande bildanalysen, som tillåter att följa singelCellbanor och proteindynamik 21 kan sannolikt också appliceras på V. parahaemolyticus .
Genom att följa de steg som beskrivs i detta protokoll kommer forskare att kunna utföra tillförlitlig och återproducerbar fluorescensmikroskopi med enkelcell på både swimmer och swarm-cell-typen av V. parahaemolyticus . Detta protokoll beskriver ett robust sätt att transformera V. parahaemolyticus från sin simmare till sin svärmercellstyp. Genom att trycka monolagret av svärmceller från de perifera fläckarna av svärmande kolonier på en agaroskudde kan den intracellulära lokaliseringen av proteiner observeras, pipeline för bildanalys kan sannolikt tillämpas på andra bakteriearter som existerar inom bakteriella samhällen där celler växer i Mycket närhet och situationer där automatiserad bildanalys kanske inte är till en fördel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklarerade.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
