Summary
Denne protokollen muliggjør singlecellemikroskopi av de differensielt forskjellige Vibrio parahaemolyticus svømmer- og svømmerceller. Metoden produserer en populasjon av swarmersceller som er lett tilgjengelige for enkelcelleanalyser og dekker fremstilling av cellekulturer, induksjon av swarmer-differensiering, prøvepreparasjon og bildeanalyse.
Abstract
Evnen til å studere intracellulær lokalisering av proteiner er avgjørende for forståelsen av mange cellulære prosesser. I sin tur krever dette evnen til å skaffe enkeltceller for fluorescensmikroskopi, noe som kan være spesielt utfordrende når avbildningsceller som finnes i bakterielle samfunn. For eksempel eksisterer det humane patogenet Vibrio parahaemolyticus som korte stavformede svømmerceller i flytende forhold som ved overflatekontakt skiller seg inn i en delpopulasjon av svært langstrakte svømmerceller spesialisert for vekst på faste overflater. Dette papiret presenterer en metode for å utføre single cell fluorescensmikroskopi analyse av V. parahaemolyticus i sine to differensialtilstander. Denne protokollen induserer meget differensiering av V. parahaemolyticus til en livscykel i svovelceller og letter deres spredning over faste overflater. Metoden produserer flammer av differensierte svømmerceller som strekker seg fra tHan kanten av svømmekolonien. Spesielt, i spissen av swarm-fakkene, finnes svømmerceller i et enkelt lag av celler, noe som muliggjør enkel overføring til et mikroskopdia og etterfølgende fluorescensmikroskopi av enkeltceller. I tillegg presenteres arbeidsflyten av bildeanalyse for demografisk representasjon av bakterielle samfunn. Som prinsippsbestemmelse er analysen av intracellulær lokalisering av kjemotaksis-signaleringsarrayer i svømmer- og svovelceller av V. parahaemolyticus beskrevet.
Introduction
Bakterier opplever hele tiden endringer i deres ytre miljø og har utviklet flere teknikker for å endre og tilpasse deres oppførsel tilsvarende. En slik mekanisme innebærer differensiering i forskjellige celletyper som bedre utfyller det forandrede miljøet. Differensiering innebærer ofte store endringer i reguleringen av cellesyklusen, cellemorfologi og spatiotemporal organisering av cellene. En organisme som kan gjennomgå differensiering er Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus tilhører Vibrionaceae , som er en familie av proteobakterier som vanligvis lever i frisk eller saltvann. Vibrionaceae er utbredt i miljøet og inkluderer flere arter som forårsaker tarmkanalinfeksjoner hos mennesker, også inkludert Vibrio cholerae. V. Parahaemolyticus er en dimorf organisme og er i stand til å skille seg inn i to forskjellige celletyper som et svar for å imøtekomme endringer i detsEksternt miljø. I vandige miljøer eksisterer den som en kort stavformet svømmercelle med en enkelt polar flagellum plassert ved den gamle cellepolen. Ved overflatekontakt utløses differensiering i en sværmercelle. Swarmercelle-differensiering innebærer to store endringer: svovelcellemorfogenese gjennom inhibering av celledeling, og induksjon av et andre flagellasystem. Dette resulterer i dannelsen av en peritrichøs og langstrakt stangformet sværmercelle, som enten kan fortsette sværmerens livsstil, hvor delingshendelser resulterer i avkomme swarmerceller, eller alternativt differensiere tilbake til svømmerceller.
Flere faktorer har blitt rapportert å indusere eller påvirke swarmer differensiering. Den primære stimulansen ser ut til å være drevet av mekanosensing hvor V. parahaemolyticus bruker polar flagellum som en taktil sensor som påviser inhibering av rotasjonen ved overflatekontakt, men flere andre faktorer er involvert somBrønn 1 . I laboratoriet kan rotasjon av det polære flagellum inhiberes kunstig ved tilsetning av fenamil, som blokkerer den natriumkanal-drevne flagellære rotasjonen, og derved fremkaller sværmerdifferensiering 2 . Videre ble i en tidligere studie indusert Vibrio alginolyticus til å svømme på fast medium når celler ble forplantet på vekstmedium i en Petri-skål forseglet med klart plastbånd. Alkali-mettet filterpapir forhindret å swarming under disse forholdene, og dermed foreslå at en eller flere flyktige syrer kan være involvert i induksjon av swarming. Således forsegler Petri-skålen med plastbånd som sannsynligvis er tillatt for akkumulering av flyktige syrer, dannet som biprodukter av cellemetabolismen, innenfor platens hovedområde. Den samme effekt ble oppnådd når H202 ble tilsatt til vekstmediet i uforseglede petriskål for å kunstig fremstille flyktige syrer ved hydrolysering av mediekomponenter
V. parahaemolyticus-differensiering innebærer store endringer i reguleringen av celledeling, cellemorfologi og posisjonering av makromolekylære maskiner som flagellA og kjemotaksisapparater - prosesser som alle krever spesifikk lokalisering av proteiner i samsvar med cellesyklusen. Dermed er evnen til å studere intracellulær lokalisering av slike proteiner avgjørende for forståelsen av de nevnte cellulære prosesser. For å utføre slike studier er det nødvendig med fluorescensmikroskopi på enkeltceller. Dette kan være spesielt utfordrende når avbildningsceller som finnes i tette bakteriepopulasjoner, som det er tilfelle for sværmerceller. Det har vært forsøk på å indusere sværmerdifferensiering i flytende medier, som potensielt kan generere enkeltceller for mikroskopi-studier. Og selv om disse cellene på et transkripsjonsnivå delvis har indusert swarmer-differensieringsprogrammet, gjennomgår de ikke de samme tydelige morfologiske forandringene som fullt differensierte svømmerceller dyrket på fast medium 8 . Dette papiret gir en robust og reproducerbar protokoll av en metode for å indusere sværmerLl differensiering på en agaroverflate. Protokollen produserer en populasjon av lett tilgjengelige swarmersceller som er lett tilgjengelige for enkeltcellemikroskopi og etterfølgende analyse. Videre muliggjør protokollen lokaliseringsstudier av fluorescensmerkede proteiner i både svømmer- og svømmercelletyper (avsnitt 1, 2, 3, 4). I tillegg beskriver protokollen den etterfølgende arbeidsflyten på hvordan å behandle og analysere de genererte dataene fra fluorescensmikroskopieksperimenter, noe som muliggjør demografisk analyse av bakterielle samfunn (seksjon 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av elektrokompetente V. parahaemolyticusceller og elektroporering av plasmid-DNA i svømmerceller
MERK: Følgende del av protokollen tillater fremstilling av elektrokompetente celler og påfølgende elektroporation av plasmid-DNA i svømmerceller. Dette trinnet er viktig hvis fluorescerende proteiner eksploderes ectopisk fra et plasmid.
- Strek ut V. parahaemolyticus- celler fra en -80 ° C glycerol-stamme på en frisk LB-agarplate inneholdende 100 μg / ml ampicillin og inkuber natten over ved 37 ° C.
- Den følgende dag inokulerer 200 ml LB-medium med en enkelt koloni av V. parahaemolyticus og inkuberer den ved 37 ° C under rystende betingelser til en OD 600 på 1,0 er nådd. Det tar vanligvis 5-6 timer inkubering for cellekulturen å nå den ønskede optiske densitet.
- Overfør umiddelbart cellene til is og perfOrm alle videre trinn på is og i 4 ° C forkjølte sentrifuger.
- Høst cellene ved 4 ° C i 10 minutter ved 2000 x g.
- Kast supernatanten ved dekantering og suspender cellemellet i 25 ml iskald 273 mM sukroseoppløsning (pH 7,4, bufret med KOH).
- Høst cellene igjen ved 4 ° C i 10 minutter ved 2000 x g. Gjenta to ekstra ganger.
- Resuspender den vaskede cellepellet i 400 ul iskall 273 mM sukroseoppløsning. Deretter legger du glyserol til en sluttkonsentrasjon på 15% vol / vol. Cellene er nå klar for elektroporasjon, men kan også fryses i alikvoter på 70 μl ved -80 ° C til senere bruk.
- For elektroporasjon, bland en 70 μl alikvot av elektrokompetente celler med 100-1000 ng plasmid DNA og overfør blandingen til en iskald elektroporasjonskuvette (0,2 cm elektrode gap). Utfør elektroporering med følgende innstillinger: 25 μF, 2400 V og 200 Ω.
- SuspendCeller i elektroporasjonskuvetten i 600 ul LB-buljong, overfør til et 2 ml rør og inkuber under risting ved 37 ° C i 3 timer.
- Spinn ned cellene ved 2000 xg i 5 minutter og suspender pelleten i 100 μL LB-buljong. Spred cellesuspensjonen på selektive LB agarplater som inneholder de nødvendige antibiotika og inkuber ved 37 ° C over natten.
- Neste dag, kontroller platene for koloniformasjon. Kolonier som vokser, bærer det riktige antibiotikaresistensgenet kodet på plasmidet og kan nå brukes til videre forsøk.
2. Induksjon av svarmercelledifferensiering
MERK: Følgende trinn beskriver hvordan å indusere differensiering av V. parahaemolyticus i livscyklusens svmermercelle og hvordan stimulere spredning på faste overflater.
- Suspensér 4 g hjerteinfusjon (HI) Agar i 100 ml ddH 2 O for å forberede de oppvarmende platene.
- Kok forsiktig HI-agarløsningen i mikrobølgeovnen og rist flasken fra tid til annen til pulveret er oppløst. Autoklav ved 121 ° C i 20 minutter.
- Etter autoklavering, avkjøl HI-agaren til 60-65 ° C. Tilsett 2,2'-bipyridyl til en sluttkonsentrasjon på 50 μM (stamløsning av 50 mM i 100% etanol). Tilsett CaCl2 til en sluttkonsentrasjon på 4 mM (stamløsning av 4 M i ddH20). Hvis nødvendig, legg til antibiotika i løsningen for å opprettholde plasmider.
MERK: Hvis du planlegger å bruke et inducerbart plasmid, legg til induksjonsmiddel til dets endelige konsentrasjon.
FORSIKTIG: 2,2'-Bipyridyl: Akutt toksisitet (oral, dermal, innånding). Bruk hansker og vernebriller ved håndtering av kjemikaliet. - Hell 30 - 35 ml av den endelige HI-agarløsningen i en rund 150 mm petriskål og la agaret størkne.
- Rett før spotting av cellekulturen tørker du agarplaten ved 37 ° C i minst 10 minutter (eller til noen flytende rester har disaPpeared, men ikke lenger) oppe med et åpent lokk.
MERK: Tørketider er svært avhengige av den anvendte inkubatoren, og tungt tørkede plater vil ikke tillate swarming av V. parahaemolyticus . (Dette trinnet er veldig viktig!) Plater må brukes friske og bør ikke være eldre enn 2 - 3 timer. Gamle plater blir for tørre for å stimulere til å svømme. - Inokuler en liten mengde celler fra kanten av en enkelt koloni til 5 ml LB-buljong. Inkubér kulturen som rister ved 37 ° C til OD 600 = 0,8 er nådd, det tar vanligvis 2-3 timer. Etter det er cellene klare til å bli oppdaget på HI swarming agarplater.
- Spot 1 μl cellekultur i midten av en HI-agar swarming plate ( Figur 1A ).
- La stedet tørke ( figur 1B ).
- Tetning platen med klart plastbånd og sørg for at det er ordentlig festet, ellers kan det løsne seg under inkubasjon over natten ( figur 1C ).
MERK: Det erVeldig viktig at tetningen er perfekt. Unngå dannelsen av luftbobler og bretter til båndet når det påføres. - Inkuber platen ved 24 ° C over natten. Dette vil resultere i dannelsen av en V. parahaemolyticus sværmkolonie med sværm -flare som strekker seg fra periferien til sværmkolonien ( figur 2 ).
3. Fremstilling av V. parahaemolyticus svmerceller for fluorescensmikroskopi
MERK: Følgende protokoll beskriver hvordan du klargjør mikroskopi-agarosesklier og påfølgende påtrykking av swarming-blusser på en agarosepute for å oppnå enkle swarmersceller for mikroskopi.
- For å fremstille agarosesklier for mikroskopi, tilsatt 1 g agarose til 100 ml av en 20% vol / vol PBS og 10% vol / vol LB buljongløsning. Kok oppløsningen i mikrobølgeovnen forsiktig for å oppløse agarosen og la den kjøle ned til 65-70 ° C under blanding med en magnetomrører.
- Plasser acMagert mikroskop glir på en perfekt nivå del av en arbeidsbenk. Dekk begge ender av lysbildet med to lag med generell laboratoriemerking, og fest det til arbeidsbenken. Avstanden mellom de to stykkene skal være rundt 3 cm.
MERK: De to lagene av tape gir en svært liten høyde, som bestemmer høyden på agaroseputen. Det er viktig at arbeidsplassen er nivå for å sikre at cellene vil være i samme plan for mikroskopi analyse. - Pipet ~ 250 μL av den tidligere preparerte agaroseoppløsningen på den ikke-dekkede glassoverflaten.
- Legg nå et andre mikroskopdia i samme retning som den nederste på toppen og trykk litt ned, slik at gjenværende agarose kan strømme ut til sidene.
- La agarosen størkne 1-2 minutter, og trekk deretter forsiktig glassplaten av bunnen i en horisontal bevegelse.
- Ved hjelp av en skalpell, kutte av eventuell resterende agarose som er festet tilSider av mikroskopens lysbilde og sakte fjern båndet fra enden av mikroskopdysen.
MERK: Agarose lysbildet er nå klart og skal brukes så snart som mulig, da det langsomt begynner å tørke ut. - For å utføre mikroskopi på sværmerceller, kutte ut en ~ 3 mm x 10 mm stykke swarming agar fra den ytre kanten av en swarming koloni ( Figur 1D ). Det er veldig viktig å ikke bryte båndseglingen til svømmeplaten til umiddelbart før overføring av sværmerceller til mikroskoplidet. Når båndet er fjernet, initierer swarming V. parahaemolyticus- celler differensiering i svømmerceller.
MERK: Pass på å kutte kuttene fra utsiden av den sværmende kolonikanten til innsiden av kolonien ( Figur 1D ). På denne måten kan du forhindre "svømmerforurensning" i kanten av den sværmende koloni. - Overfør stykket swarming agar på et mikroskop agarose lysbilde med cellene vendt mot agarose paD ( figur 1E ). Dette imprints de swarming cellene på agarose puten.
- Etter å ha ventet på ~ 30 s, fjern agarstykket forsiktig fra agaroseputen ( Figur 1F ).
- Legg et glassdeksel på agarosepuden hvor cellene ble trykt. Cellene er nå klar for mikroskopi.
MERK: Det er viktig å se bildesvulmerceller umiddelbart, siden svømmerceller langsomt initierer differensiering til svømmerstaten.
4. Fremstilling av V. parahaemolyticus svømmercellekulturer for fluorescensmikroskopi
MERK: Denne delen av protokollen beskriver hvordan man forbereder en kultur av V. parahaemolyticus for å utføre fluorescensmikroskopi på svømmercelletypen.
- Inokuler en liten mengde celler fra kanten av en enkelt koloni til 5 ml LB-buljong. Inkubér kulturen som rister ved 37 ° C i 1 time eller til liten cellevekst blir synlig.
- PåDette trinnet, om nødvendig, tilsetter induksjonsmiddel for ekspresjon av proteiner av interesse. I dette eksemplet ble L-arabinose tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,2% (w / vol) for å indusere ekspresjon av YFP-CheW 9 .
- Inkubér kulturen risting i ytterligere 2 timer ved 37 ° C.
- Følg trinnene 3.1-3.7 for å forberede mikroskopisk agarosesklier.
- Spot 1 μl cellekultur i midten av agaroseputen og la stedet inkuberes til den er tørr.
- Sett et glassdeksel på agarosepuden hvor cellene ble oppdaget. Cellene er nå klar til å bli avbildet under fluorescensmikroskopet.
5. Bildeanalyse
Denne delen av protokollen beskriver en arbeidsflyt for bildeanalyse, spesielt hvordan man fjerner fluorescensdata for enkeltceller for demografisk analyse.
- Før du starter bildeanalysen, må du kontrollere at alle mikroskopibilder er lagret i 16bit TIF-format.
- Legg inn DIC (eller fasekontrast) og tilhørende fluorescerende kanalbilder i programvaren.
- Generer et overleggsbilde av begge kanalene ved å velge "Vis / Overlegg bilder". Angi antall bilder ("# Images:") til to, og velg DIC-bildet i den første kanalen og det fluorescerende bildet i den andre kanalen.
- Velg "Multi-Line" -verktøyet fra verktøylinjen og merk celler fra en pol til den andre gjennom midten av cellen. For å få en liste over alle genererte linjer (linjeposter), åpne "Mål / Regionmålinger". Konfigurer regionmålinger til å bare vise regionens etikett, avstand og gjennomsnittsintensitet.
- Kalibrere pikselstørrelsen under "Mål / Kalibrere avstander" til pikselstørrelsen som er spesifikk for mikroskopoppsettet, og klikk på "Bruk på alle åpne bilder".
- Overfør alle regioner (linjeposter) til fluorescerende kanalbildet. Under "Regioner / TransfEr Regions "velg kildebilde (overleggsbildet) og destinasjonsbildet (fluorescerende kanalbildet). Velg" Alle regioner "og trykk" OK ".
MERK: For å senere kunne produsere de nøyaktige linjene (linjeobjekter, regioner, avkastning), åpne "Regions / Save Regions" og lagre regionene. - Eksporter alle regionmålinger til et regneark ved å åpne "Mål / Regionmålinger" og trykke på "Åpne logg". Bekreft å åpne og eksportere dataene. Når regnearket er åpnet i bakgrunnen, skal du endelig eksportere dataene ved å trykke på "F9: Log Data".
- For å bestemme plasseringen av fluorescerende foci langs cellen, åpne "Measure / Linescan". Sett "Linescan Width" til en verdi slik at hele bredden på en celle er dekket av regionen du tidligere skapte. Høyreklikk på linjeskanningsgrafen og velg "Vis grafdata". Ved å venstre-klikke og dra musekasteren langs linjeskanningen tilInteressepunktet vil vinduet "Grafdata" vise den tilsvarende piksel / avstand mellom de to punktene. Velg den blå markerte rækken, og kopier deretter innholdet.
MERK: Hele linjeskanningsintensitetsprofilen kan logges til et regneark ved å trykke på "Log Data" i "Linescan" -vinduet. De hentede dataene kan nå brukes til visualisering i grafer eller videre statistisk analyse. Lokaliseringsmønstre over cellesyklusen kan enkelt visualiseres i en demografisk representasjon av cellelengden og fluorescerende intensiteter langs cellekroppen. Disse representasjonene kan oppnås ved å bruke samme avkastning som tidligere er valgt. Følgende trinn vil gi et eksempel på hvordan du genererer demografi som ligner dem som er vist i figurene 3C og 4C .- I Fiji / ImageJ lastregistreringsmarkeringer (.rgn) som tidligere ble opprettet i programvaren (trinn 5.6) ved hjelp av importøren "Metamorph nd & ROI files";. Alternativt kan områder av interesse (ROI) av cellene som skal analyseres, opprettes direkte i Fiji / ImageJ ved hjelp av det innebygde "Segmented Line" -verktøyet.
- Åpne "Analyser / Verktøy / Avkastningsbehandling" og merk alle aktive listeoppføringer ".
- Deretter klikker du på "Mer / Multi Plot" og deretter "List" i det nye "Multi Plot" -vinduet. Klikk på en tabelloppføring, velg deretter og "kopier alle". Deretter lim inn i et nytt regneark.
MERK: Pass på at dataene til den lengste cellen (to tilsvarende X- og Y-kolonner med flest antall rader) er den siste til høyre i regnearket. - Lag regnearket som en "CSV (Comma-avgrenset) (* .csv)".
- Last ned R-skriptene herfra "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10. Skriptene sorterer celler etter lengde og normaliserer fluorescensintensitetsprofilene for alle celler som et gjennomsnitt av hver celle fluorescense.
- Kjør hele skriptet "celleprofiler funksjon.R" i R [versjon 3.0.1; 11 ].
- Rediger "example plots.R" -skriptet i linje 30 slik at filbanen refererer til mappen der den tidligere genererte .csv-filen er lagret. I tillegg endrer du filnavnet "profile.csv" i linje 31 til filnavnet som er valgt for .csv-fil generert i trinn 5.9.4. Etterpå kan du kjøre "example plots.R" og følge dokumentasjonen fra "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles", så vel som kommentarene fra skriptfilen for å generere demografisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Induksjon av differensiering og generering av swarming kolonier
Figur 1 gir et skjema over de viktige trinnene som er involvert i å produsere sværmende kolonier av V. parahaemolyticus ( Figur 1A-C ). En svømmerkultur ble oppdaget på swarm-agar og inkubert ved 24 ° C, hvilket induserte svovel-differensiering og proliferasjon over den faste agaroverflaten. Et representativt stereomikroskopi bilde av en swarming koloni er presentert i figur 2 . Stereomikroskopi-avbildning viser tydelig at sværm-fakkelene strekker seg utover svømmekoloniens periferi. Høyere forstørrelse avslører at i svarm-flaring-celler er gruppene kun gruppert i mono- eller bi-lag, mens i midten av svarmkolonien stables celler i flere lag ( figur 2A ). Swarm-fakkel kan enkelt overføres (som beskrevet i trinn 3.8-3.11,
Fluorescensmikroskopi og bildeanalyse
Figur 1: Induksjon av swarmers differensiering og fremstilling av celler for mikroskopiimaging. Forenklet visualisering av arbeidsflyten for å produsere V. parahaemolyticus swarmersceller og utarbeidelse av mikroskopdyser for mikroskopianalyse av enkle sværmerceller. ( A ) Spot 1 μL av en OD 600 = 0,8 cellekultur av V. parahaemolyticus i midten av en HI-agar swarming plate. ( B ) Inkubere stedet til det er tørket og celler er festet til agaroverflaten. ( C ) Tetning Petri-tallerken med tydelig tape. Inkuber platen ved 24 ° C i 16 timer. ( D ) Pakk ut et lite stykke HI-agar fra den ytre kanten av den sværmende kolonien. ( E ) Overfør eksisjonen på en mikrOscopy agarosepute med sværmercellene vendt mot agaroseputen. Etter en kort inkubasjonstid på 30 s, skrives svømmercellene på agaroseputen. ( F ) Fjern forsiktig utskåret agar fra agarosepute og legg en mikroskopisk deksel på toppen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Organisering av celler i en V. parahaemolyticus Swarming Colony. ( A ) Stereomikroskopi av en V. parahaemolyticus swarmerkoloni. De øvre panelene viser den ytre kanten av en swarming koloni i økende forstørrelse. Bunnpanelene viser et område av den sværmende koloni mellom sentrum og kanten i økende forstørrelse. Swarm-fakkelen strekker seg fra periferien avSvømmekolonien. ( B ) Representative DIC mikroskopi bilder av sværmer koloni kanten (øvre panel) og et område mellom sentrum og periferien (bunnpanelet) etter overføring av celler fra de respektive angitte stedene i den sværmende koloni. Swarm-fakkene ble påtrykt direkte på en mikroskopisk agarosepute som beskrevet i trinn 3.8-3.11. Celler fra området mellom sentrum og periferien ble først skrapt av sværmkolonien og resuspendert i LB-buljong før de ble sett på en mikroskopisk agarosepute. Skalbjelke = 7,5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Lokalisering av kjemotaxis-arrays i svømmerceller av V. parahaemolyticus. ( A ) DIC og fluorescerende mikroskopi av vildtype V. parahaemolyticus svømmere celler ectopically uttrykker YFP-CheW. ( B ) Graf som viser YFP-CheW foci-distribusjon ved å plotte avstanden til foci fra cellestengene som en funksjon av cellelengden i svømmerceller. ( C ) Demografisk analyse av fluorescensintensitetsprofiler av V. parahaemolyticus svømmerceller som uttrykker YFP-CheW. Celler sorteres etter cellelengde og viser relativ fluorescerende intensitet. Skalbjelke = 5 μm. Panel B og C er tilpasset fra referanse 9 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Lokalisering av chemotaxis-arrays i svovelceller av V. parahaemolyticus. A ) DIC og fluorescerende mikroskopi bilder av vildtype V. parahaemolyticus swarmersceller ektopisk uttrykker YFP-CheW. ( B ) Graf som viser YFP-CheW foci-distribusjon ved å plotte avstanden til foci fra cellestangene som en funksjon av cellelengden i sværmerceller. ( C ) Demografisk analyse av fluorescensintensitetsprofiler av V. parahaemolyticus swarmersceller som uttrykker YFP-CheW. Celler sorteres etter cellelengde og viser relativ fluorescerende intensitet. Skalbjelke = 5 μm. Panel B og C er tilpasset fra referanse 9 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret rapporterer en metode for mikroskopisk avbildning av V. parahaemolyticus swarmersceller, etterfulgt av nedstrømsanalyser beregnet på å løse og kvantifisere subcellulær lokalisering og andre trekk ved de studerte fluorescensmerkede proteiner. Selv om flere verktøy eksisterer for mikroskopi bildebehandling og analyse 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , er analysen av V. parahaemolyticus swarming celler fortsatt utfordrende for det meste fordi de vanligvis finnes i et tett cellemiljø, og det er stor variasjon i cellelengde ( Figur 2 ). Derfor er automatisert celle deteksjon noen ganger feil, og dermed er resultatene noe upålitelige. Denne protokollen skisserer en rørledning utformet for å vokse, bilde og analysere swarming celler av V. parahaemolyticus , som er skreddersydd for spesifikasjonenIfic behov for disse cellene, for eksempel et kontrollert vekstmiljø på en overflate og nedstrøms bildeanalyser som imøtekommer nærvær av celler av variable lengder som vokser i umiddelbar nærhet.
Evnen til å ektopisk uttrykke et protein av interesse fra et plasmid kan være viktig for flere eksperimenter, f.eks. Ekspresjon av fluorescensmerkede proteiner for mikroskopi-studier eller komplementering av gen-deletjoner. Her beskrives også prosessen med å fremstille kjemisk kompetente celler og elektroporering av plasmid-DNA i V. parahaemolyticus. Fordelen med elektroporasjon over konjugering, som ofte brukes for V. parahaemolyticus , er at plasmidkjernen ikke trenger å bli modifisert for å tillate konjugering. Likevel bør enkelte forholdsregler tas. Som beskrevet i trinn 1.2, er det svært viktig å nå en celletetthet på OD 600 = 1,0. Ved lavere optiske tettheter vil cellene lyse på elektroporatiPå og ved høyere tettheter tas ikke plasmidet opp av cellene. Videre vil for sterk centrifugering av V. parahaemolyticus- celler (trinn 1.4-1.6) drastisk redusere elektroporasjonseffektiviteten. Det er også viktig å suspendere cellespellet forsiktig under vaskingstrinnene for å generere elektrokompetente celler.
Selv om forberedelsen av en cellekultur lyder trivial, er kulturtettheten svært viktig for svømmende ytelse. Vanligvis vil en cellekultur i den tidlige eksponensielle vekstfasen (OD 600 <0,5) produsere en større svømmerkoloni under inkubasjon over natten enn en kultur i sen eksponentiell eller tidlig stasjonær fase. Avhengig av eksperimentet, kan en større swarming koloni være gunstig. For å sammenligne kolonienes utvidelse og morfologi mellom forskjellige stammer vokst på den samme HI-agar-svimlende platen, er det imidlertid viktig å ha nok ledig plass mellom individuelle svømmende kolonier. Dette kan være achOppnådd ved å spotte en cellekultur med høyere optisk tetthet som vanligvis vil resultere i mindre swarming kolonier.
Induksjon av den sværmende fenotypen varierer betydelig mellom bakteriearter, og reproduksjonsevnen av dette er sterkt påvirket av faktorer som agar og næringsblanding, omgivelsestemperaturen og fuktighetsinnholdet i begge omgivelser og vekstmedium. Følgelig påvirker mindre endringer i protokoll og eksternt miljø signifikant svevassasseringsresultater og induksjon av swarmer differensiering. Protokoller for indusering av swarming av andre bakteriearter som Pseudomonas aeruginosa og Bacillus subtilis er rapportert 19 . Fremgangsmåtene beskrevet i denne protokollen vil på en pålitelig måte produsere svulmercelletypen av V. parahaemolyticus og opprettholde dem i form av sværmende kolonier som produserer enkeltlags swarming fakkel ved koloniens kant. For å utføre stabil ogReproduserbare eksperimenter på swarmercelletypen av V. parahaemolyticus , er fremstilling av HI swarming agarplater den viktigste delen av denne protokollen. Spesielt kan tørketrinnet kreve optimalisering, da hver inkubator vil utføre forskjellig. En annen faktor som kan påvirke swarming oppførsel er typen plast som brukes i Petriskålene. De typiske Petri-tallerkene som brukes i laboratoriet for å utføre svømmende eksperimenter, er laget av polystyren (PS). Imidlertid produserte Petriskåler laget av lavdensitetspolyetylen (PE LD) blandede resultater i svømmende analyser. Det er avgjørende å følge de beskrevne trinnene, fordi bare da reproduksjonsbare sværmende kolonier som viser tydelig perifer flareformasjon vil danne, som muliggjør enkel svulmercellemikroskopi.
Utvilsomt kan forskjellige tilnærminger bli tatt for å vise resultatene gjengitt av fluorescerende mikroskopi studier av V. parahaemolyticus swarming celler. For instancE, det mye brukte programmet MicrobeTracker 16 representerer et troverdig alternativ. Den nylig tilgjengelige MicrobeTracker-applikasjonen Oufti 20 , som ikke krever MATLAB, er også et annet alternativ. Imidlertid er det ikke mulig å bruke differensielle grensesnittkontrast (DIC) -bilder i Oufti, og fasekontrastavbildning er ikke egnet til å skille celle-segmentering i sværmerceller. Videre er ikke alle mikroskoper utstyrt for faskontrastbilder, og i sin tur er faskontrastbilder ikke egnet for all slags mikroskopianalyse. Et annet lovende verktøy, som er gratis og ImageJ-basert, er MicrobeJ 17 , men enda en gang kan bare fasekontrast og fluorescerende bilder brukes. Videre tillater denne protokollen bare bildebehandling og analyse av celler ved bestemte tidspunkter i deres livssyklus. Imidlertid er en utmerket protokoll som beskriver time-lapse-bildebehandling og den etterfølgende bildeanalysen, som gjør det mulig å følge singleCellebaner og proteindynamikk 21 kan sannsynligvis også brukes på V. parahaemolyticus .
Følgende trinn beskrevet i denne protokollen vil gjøre det mulig for forskere å utføre pålitelig og gjenproducerbar enkeltcellet fluorescensmikroskopi på både svømmer- og sværmercelletypen av V. parahaemolyticus . Denne protokollen beskriver en robust måte å transformere V. parahaemolyticus fra sin svømmer inn i sin sværmercelletype. Ved å imprimere monolaget av sværmerceller fra de perifere fakkelene av sværmende kolonier på en agarosepute, kan intracellulær lokalisering av proteiner observeres, rørledningen for bildeanalyse kan sannsynligvis anvendes på andre bakteriearter som eksisterer i bakterielle samfunn hvor celler vokser i Svært nærhet og situasjoner hvor automatisert bildeanalyse kanskje ikke er til en fordel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
