Summary
Dette manuskript beskriver en metode til at visualisere og kvantificere lokaliseret oversættelse begivenheder i subcellulært rum. Den tilgang, der foreslås i dette manuskript kræver en grundlæggende Konfokal billedbehandlingssystem og reagenser og er hurtig og omkostningseffektiv.
Abstract
De mekanismer, der regulerer mRNA oversættelse er involveret i forskellige biologiske processer, som Kim linje udvikling, Celledifferentiering og organogenesis, også i flere sygdomme. Talrige publikationer har overbevisende vist, at specifikke mekanismer stramt regulere mRNA oversættelse. Øget interesse i forordningen oversættelse-induceret ekspression af proteiner har ført til udviklingen af nye metoder til at studere og følge de novo protein syntese i cellulo. Men de fleste af disse metoder er kompleks, hvilket gør dem dyrt og ofte begrænser antallet af mRNA mål, der kan studeres. Dette manuskript foreslår en metode, der kræver kun grundlæggende reagenser og en Konfokal fluorescens imaging system til at måle og visualisere de ændringer i mRNA oversættelse, der forekommer i enhver celle linjen under forskellige betingelser. Denne metode blev for nylig brugt til at vise lokaliseret oversættelse subcellulært strukturerne for vedhængende celler over en kort periode, hvilket giver mulighed for at visualisere de novo oversættelse i en kort periode under en række biologiske processer eller til validering af ændringer i translationel aktivitet som svar på bestemte stimuli.
Introduction
Regulering af oversættelse af forskellige cellulære funktioner har foranlediget mange forskerhold at udvikle nye værktøjer og metoder til at bestemme den subcellulært lokalisering af mRNA oversættelse og reguleret protein syntese1,2 ,3,4. Disse seneste teknologiske fremskridt giver mulighed for en bedre forståelse af de mekanismer, som inddrager oversættelse Opregulering eller undertrykkelse af specifikke mRNAs under biologiske processer, såsom neuronal udvikling, drug svar og metastase5 ,6,7,8. De fleste af disse metoder kræver dog dyrt eller farlige reagenser og specifikke udstyr, som ikke måske er tilgængelige til de fleste laboratorier. Som sådan er blev en omkostningseffektiv metode til at give mulighed for hurtig vurdering af oversættelse begivenheder udviklet til specielt omgå disse potentielle problemer. Denne metode registrerer akut translationel modulationer, der opstår under specifikke cellulære processer og også giver mulighed for lokalisering af oversættelse ved hjælp af Konfokal mikroskopi.
De metoder, der beskrives her blev brugt til at overvåge lokaliseret oversættelse inden subcellulært rum kaldet sprede indledning Centre (SIC)5. SICs er forbigående strukturer findes i seedede celler, der er lokaliseret på toppen af spirende vedhæftning komplekser. Selvom SICs og vedhæftning komplekser er forskellige, hænger deres skæbner tæt sammen. SICs er blevet kendt for at gradvist forsvinde ved fokale vedhæftning komplekse modning i en vedhæftning site i den indledende fase af vedhæftning. Vi fandt, at RNA-bindende proteiner kendt specifikt styre mRNA oversættelse (f.eks. Sam68, FMRP og G3BP1) og polyadenylated RNA'er blev beriget inden for disse strukturer5. Ved hjælp af de metoder, der beskrives her, viste vi, at reguleringen af SIC-associerede mRNA oversættelse fungerer som et checkpoint tillader seedede celler for at konsolidere celle vedhæftning. Denne metode, baseret på puromycin vedtægter, kunne betragtes som en tilpasset version af den overflade sansning af oversættelse assay (solnedgang). Oprindeligt udviklet til at måle globale protein syntese satser ved hjælp af en ikke-radioaktivt mærket aminosyre, tilbyder protein puromycilation en effektiv måde at visualisere de novo protein syntese9. Denne metode bygger på den iboende opførsel af puromycin, et antibiotikum, der blokerer oversættelse gennem tidlig kæde afslutning i ribosomet10. Ja, puromycin er strukturelt svarer til tyrosyl-tRNA, som tillader til indbygning i forlængede peptid kæder via dannelsen af en peptidbinding. Puromycin binding til en voksende peptid kæde forhindrer imidlertid en ny peptidbinding fra at være dannet med den næste aminoacyl-tRNA, da puromycin har en ikke-hydrolyserbar akrylamid bond i stedet for hydrolyserbar ester obligation fundet i tRNAer. Således resulterer inkorporeringen af puromycin i forlængede polypeptider i for tidlig frigivelse af talrige afkortet puromycilated polypeptider svarende til aktivt oversatte mRNA9,11,12 .
Brug denne metode, det var muligt at vurdere aktive oversættelse inden for en kort tid enke (f.eks. 5 min) under cellulære vedhæftning ved hjælp af en bestemt antistof rettet mod puromycin på celler, der blev suppleret med antibiotika i 5-min perioder på forskellige tidspunkter i løbet af celle vedhæftning proces5. Præcisionen af denne analyse er baseret på meget specifikke antistoffer rettet mod puromycilated gruppe. Immunfluorescent påvisning af puromycilated polypeptid giver en generel subcellulært fordelingen af den nyligt oversatte mRNA, som også kan kvantificeres med stor nøjagtighed ved hjælp af Konfokal Billeddannende systemer.
Derfor tilbyder denne metode en relevant mulighed for et stort antal laboratorier at studere translationel regulerende mekanismer involveret i processer som neuronal granulering6,13,14, 15, morphogen mRNA lokalisering og oversættelse under udvikling16,17. Det er også velegnet til at studere lokaliserede eller opdelte oversættelse under hurtig biologiske hændelser, såsom celle migration, friktion eller invasion, eller blot vurdere medicinske behandlingsmetoder, der kan fremkalde translationel ændringer5, 7 , 18. samlet set denne metode giver mulighed for visualisering af lokaliserede eller kontrolleret oversættelse begivenheder i en hurtig, præcis og omkostningseffektiv måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bestemmelse af Puromycilation betingelser
Bemærk: denne teknik beskriver metoden bruges til at vurdere lokaliseret oversættelse under MRC-5 celle vedhæftning proces 5. Som puromycilation kan ske i enhver celle, er det vigtigt at optimere puromycilation betingelserne for de specifikke cellelinjer til at blive brugt, fordi behandling betingelser ikke er ens for hver cellelinje puromycin koncentration og den ønskede inkubationstiden. For at vise, hvordan disse betingelser er defineret, tre eksempel cellelinjer (dvs. HeLa, MRC-5, og Huh-7) blev behandlet med stigende koncentrationer af puromycin for forskellige inkuberingstider ( figur 1).
- Vokse identiske numre af celler i en 24-godt plade i 0,5 mL af den relevante komplet næringssubstratet 16 h før prøven. Frø 30.000 MRC-5 celler, 50.000 HeLa celler eller 50.000 HuH-7 celler pr. brønd. Sørg for at undgå at overskride 60-70% sammenløbet (figur 1A).
- Forbered 6 rør med 1,5 mL af komplet cellekulturmedium med stigende koncentrationer af puromycin (0, 5, 10, 15, 20 og 30 µg/mL). Pre varm ved 37 ° C.
- For hver koncentration af puromycin mediet (parat i trin 1.2), overføres 0,5 mL fra hver tube til 6 nye rør og tilføje cycloheximide i en endelig koncentration på 50 µg/mL til alle 6 nye rør. Pre varm ved 37 ° C.
- Ændre medium med 0,5 mL af komplet næringssubstratet (række 1 og 2). Til den tredje række, der tilsættes 0,5 mL komplet næringssubstratet suppleret med 50 µg/mL af cycloheximide ( figur 1B).
Bemærk: Cycloheximide behandling er blevet etableret som den bedste negativ kontrol for protein puromycilation på grund af dens evne til at blokere oversættelse brudforlængelse. Fordi puromycin vedtægter kræver oversættelse strækforlængelse, cycloheximide behandling fører til et tab af puromycilated protein signaler 5 , 18. - Inkuberes i 15 min. ved 37 ° C (5% CO 2).
- Tilsættes 0,5 mL af puromycin medium forberedt i trin 1.2 til den anden række at opnå endelige koncentrationer af 0, 2,5, 5, 7,5, 10 og 15 µg/mL, henholdsvis i kolonne A, B, C, D, E og F. På samme tid, tilføje 0,5 mL af puromycin til cycloheximide-suppleret medium (trin 1.3) i den tredje række ( figur 1 c).
- Inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C (5% CO 2).
- Tilsættes 0,5 mL af puromycin medium parat i trin 1.2 til den første række til at opnå endelige koncentrationer af 0.0, 2.5, 5, 7,5, 10 og 15 µg/mL ( figur 1 c).
- Inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C (5% CO 2).
- Vask hver godt fra rækkerne 1 til 3 med 1 mL iskold 1 X fosfatbufferet saltopløsning (PBS) 5 min efter tilsætning af puromycin til brønde i den første række (to gange vask). Tilføje 75 µL 1 X Laemmli buffer (4% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS), 4% 2-mercaptoethanol, 0.120 M Tris HCl pH 6,8, 0,004% bromophenol blå, og 10% glycerol) at få hele cellelysater for hver betingelse.
- Kør 10% SDS-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) ved hjælp af 1/3 af de forberedte prøver for at vurdere puromycin vedtægter.
- Bestemme niveauet af puromycin indarbejdelse af Western blot analyse ved hjælp af et anti-puromycin antistof (12 D 10) fortyndet i forholdet 1:25,000 i primære antistof inkubation buffer (2% bovint serumalbumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 og 0,01% natriumazid).
Bemærk: Repræsentative billeder svarende til forskellige celle linje ekstrakter foretages som beskrevet i trin 1 er vist som eksempler i figur 2.
- Bestemme niveauet af puromycin indarbejdelse af Western blot analyse ved hjælp af et anti-puromycin antistof (12 D 10) fortyndet i forholdet 1:25,000 i primære antistof inkubation buffer (2% bovint serumalbumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 og 0,01% natriumazid).
2. I Cellulo Lokaliseret oversættelse visualisering
NOTE: den teknik beskrevet her blev brugt til at vurdere lokaliseret oversættelse inden SICs i MRC-5 celler under vedhæftning proces 5. Selv om MRC-5 celler der bruges her, andre cellelinjer kan bruges med den samme metode, der beskrives i trin 2.1.
- Celle forberedelse.
- Frigør MRC-5 celler ved hjælp af 0,25% trypsin/2.21 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) i Hank ' s Balanced Salt løsning (HBSS). Sammenpresse cellerne ved centrifugering (5 min på 200 x g) i en 15 mL konisk centrifugeglas og suspendere dem i Dulbecco ' s ændret Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) på 40.000 celler/mL efter optælling med en optælling afdeling.
- Ruger de suspenderede celler ved 37 ° C under blide rotation ved hjælp af en tube rotator i 20 min. for at bevare dem i suspension.
Bemærk: Dette trin er afgørende for at muliggøre den komplette dissociation af fokale vedhæftning komplekser. - Plade 2 mL af suspenderede MRC-5 celler (40.000 celler/mL) i to 35-mm glas-bund retter. Bruge de første 35-mm glas-bund fad til puromycilation analysen (Se trin 2.1.5) og bruge andet som en negativ kontrol (Se trin 2.1.6).
- Holde cellerne ved 37 ° C (5% CO 2) til 55 min til at tillade cellulære vedhæftning og SIC dannelse.
- Tilføj puromycin til medium i 35-mm glas-bund retter (analysen) ved hjælp af den koncentration, der tidligere er defineret i punkt 1. For at behandle MRC-5 celler, bruge 10 µg/mL puromycin til 5 minutter ved 37 ° C (5% CO 2).
- Som en negativ kontrol, tilføje cycloheximide til den anden 35-mm glas-bund fad 40 min. efter såning celler til at pre behandle dem med 50 µg/mL cycloheximide ( figur 2B). 15 min efter cycloheximide tilsætning, Tilføj derefter puromycin til medium ved hjælp af den samme koncentration og inkubering tid som i trin 2.1.5 (f.eks. brug 10 µg/mL af puromycin i 5 min ved 37 ° C (5% CO 2) til MRC-5).
- Vask hver plade to gange med 2 mL iskold 1 X PBS og løse cellerne med 1 mL af 4% formaldehyd (fortyndet i 1 X PBS) i 15 min. ved stuetemperatur (RT).
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD skal anvendes strengt i en kemisk hætte.
- Immunfarvning.
- Efter PARAFORMALDEHYD fiksation, vaskes tre gange med 2 mL 1 X PBS og inkuberes i 500 µL af PBS-TritonX-100 (0,5%) til 20 min på RT for at permeabilize cellerne.
- For at forhindre uspecifik antistof bindende, blokere prøve med 500 µL PBS – BSA (1%) i 20 min. på RT.
- Vaskes tre gange med PBS-Tween20 (0,1%) sættes 2 mL og der inkuberes med 300 µL af anti-puromycin antistof (12 D 10) fortyndet 1:12,500 i 1 X PBS for 1 h på RT.
- Vask 3 gange med 2 mL PBS-Tween20 (0,1%), og der inkuberes med 300 µL anti-mus IgG konjugeret med et fluorophore (her, 488 nm) fortyndet i PBS til at visualisere puromycilated polypeptider og med phalloidin-konjugeret til en anden fluorophore (her, 555 nm) at visualisere F-actin. Inkuber i 1 time på RT.
- Vaskes tre gange med 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) og derefter inkuberes i 5 min på RT i 300 µL af PBS-Tween20 (0,1%) suppleret med 1 µg/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Vaskes tre gange med 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) og derefter vaskes med 2 mL 1 X PBS. Forhindre cellerne mod udtørring ved at holde prøven i 2 mL 1 X PBS under image erhvervelse.
3. Immunfluorescent billede erhvervelse
Bemærk: den følgende metode kan bruges med alle kommercielt tilgængelige Konfokal billedbehandlingssystem.
- Afgøre de passende indstillinger for hver fluorophore til at maksimere dynamikområde for kvantificering.
Bemærk: Repræsentative kvantitativ bestemmelse kan kun opnås, hvis pixel mætning er undgået og signal tærskel er justeret korrekt. Disse indstillinger kan være opnået ved at nøje justere laser power, høj spænding (HV), vægtøgning, og forskydning.- Juster zoom faktor (5 X) og antallet af pixels (512 x 512) til at optimere pixelstørrelse.
Bemærk: Dette bør være mindst 2,3 - gange mindre end den optisk opløsning, ifølge Nyquist Teorem. - Falde scanning hastighed (12,5-20 µs/pixel) og bruger gennemsnit (2 - 3 gange) til at forbedre signal-støj-forhold ifølge de indstillinger, der er nævnt ovenfor.
- Juster zoom faktor (5 X) og antallet af pixels (512 x 512) til at optimere pixelstørrelse.
- Manuelt afgøre de passende top og bund fokale fly langs z-aksen med optimal trin størrelse (0.4 µm/skive).
Bemærk: Trin størrelse flyet bestemmes af aksial beslutningen divideret med 2.3, ifølge Nyquist Teorem. Typisk, 20-25 lag er nødvendige for at dække hele cellen dybden af vedhængende celler. - Erhverve en Konfokal billede af en hel enkelt celle med en 60 X planlægger Apo oliebestandighedsobjektet (1,42 numerisk blænde).
4. Immunfluorescent billede kvantificering
- bestemmelse af berigelse.
- Åbne et billede svarende til z-plane lag af interesse fra filen erhvervede celle data ved hjælp af ImageJ software (freeware tilgængelige på http://fiji.sc).
- Tegner en linje ved hjælp af værktøjet stregtegning (værktøj advokatstanden → Straight) gennem regionerne i den celle, hvor kvantificering ønskes. Ændre linjebredden ved at dobbeltklikke på " lige; " intensitetsværdierne vil være gennemsnit gennem bredden af linjen (sat til 8 i figur 3).
Bemærk: En tyndere line er foretrukket at undgå signal overlapning fra forskellige strukturer. - Efter linjen er korrekt indstillet, profil signal tæthed langs en bestemt akse (menulinje → analyser → Plot profil).
Bemærk: Et nyt vindue vil åbne som viser et profil svarer til signal intensiteten for hver pixel i den valgte kanal (særlige fluorophore) langs linjen til afsnittet valgte z-plan.- Gentag processen for hver kanal, svarende til fluorophore anvendes (dvs. en kvantificering for 488, en til 568, og en til 405).
Bemærk: Intensiteten signalværdi vil altid bestilles efter orientering af den tegnede linje.
- Gentag processen for hver kanal, svarende til fluorophore anvendes (dvs. en kvantificering for 488, en til 568, og en til 405).
- For at hente de numeriske grå-skaleret værdier for hver pixel i profil svarende til den valgte z-plane lag kvantificeringer, kopiere profildata (menulinjen i billedvinduet → kopi) og indsætte det i regnearket software.
- Gentag trin 4.1.1-4.1.4 for hver z-plane del af det erhvervede Konfokal billede og hver kanal hvor kvantificering ønskes.
Bemærk: Kvantificering af forskellige z-plane lag kan samles for at opnå en generel vurdering af de særlige berigelse af signalet ved at beregne summen værdien af hver pixel langs linjen for hvert z-plane lag. Denne form for gruppering af forbindelser kan kun opnås, hvis den streg er identisk for hvert z-plane lag inkluderet i de middelværdier. - Som en alternativ metode til hele-celle kvantificering af forskellige kanaler med et stort antal lag, bruger makroen kaldet StackprofileData (Se Supplerende fil).
Bemærk: Denne makro findes frit på https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt og kan bruges som følger:- Indsæt makro i en tekstfil og Gem det.
- Åbne billedfilen, der omfatter alle Konfokal lag af cellen.
- Tegn en linje, som beskrevet i trin 4.1.2, åbner et nyt vindue for at importere makroen (menulinje → Plugins → makroer → køre), vælge den tidligere gemte tekstfil svarende til StackprofileData makro, og klik på " Open. "
Bemærk: Efter makro import, et nyt vindue opkaldt " resultaterne " vil åbne og alle kvantificering langs en bestemt akse vises for hvert z-plane lag og kanal i billedfiler. - Kopiere data for hver kanal (menulinje → redigere → kopi) at få den grafiske profil repræsentation svarende til signal kvantificeringer. Indsætte den i ethvert regneark software. Beregne summen værdien af hver enkelt kanal til hver pixel langs linjen for hvert z-plane lag. Brug disse værdier til at oprette en grafisk repræsentation svarer til den præsenteres i figur 3.
- Kvantificering af signal i en udpegede cellulære området eller volumen.
- Åbne billedfilen med ImageJ software.
- Tegner et område for at betegne området af interesse ved hjælp af funktionen geometriske form (værktøj bar → " rektangel, " " ovale, " eller " polygon ").
Bemærk: Kvantificering værdi bestemmes for området svarende til formen udtrukne. - Justere tærskelniveauet for at undgå enhver baggrund signal (menulinje → billede justere → tærskel); vises et nye vindue til at repræsentere pixel intensiteterne i histogram form. Ændre værdierne for at inkludere/ekskludere pixels i kvantificering ved hjælp af skyderen. Vælg en tærskel, der eliminerer røde pixel uden for cellen, som pixel fremhævet med rødt medtages i kvantificering.
- Definere parametrene måling for at kvantificere pixel signal inden for det valgte område, uden baggrunden signal (menulinje → analyser → sæt målinger), og sørg for at tjekke den " grænse tærskel " og den " integreret tæthed " bokse.
- Måler de kvantitative værdier for det markerede område (menulinje → analyser → foranstaltning).
Bemærk: Signal intensitet kvantificering vil blive præsenteret i en ny rude under den " IntDen " identifikation, der repræsenterer produktet af de grå middelværdier og antallet af pixel i det valgte område. - Tegner et område, der omfatter hele cellen ved hjælp af en geometrisk form (værktøj bar → " rektangel, " " ovale, " eller " polygon "), og Fortsæt med trin 4.2.3-4.2.5 at opnå en værdi svarende til den samlede signal. Beregn forholdet mellem signal inden for det valgte område over hele signalet til at få procent af signal inden for området af interesse.
- Gentag trin 4.2.2-4.2.6 at opnå kvantificering af cellevolumen for hver z-plan. Tilpasse den geometriske form efter behov.
- Copy/paste data indhentet fra de " resultater " windows for hver z-plane lag i et-regneark til grafisk skildring og til at finde en gennemsnitsværdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Præcist observere oversættelse begivenheder ved hjælp af puromycin vedtægter, er det afgørende for at bestemme de optimale betingelser for hver cellelinje, fordi hver viser forskellige puromycin indarbejdelse kinetik (figur 1)9,11 ,12,18. Derfor, for at godkende puromycin vedtægter, er det nødvendigt at behandle de ønskede cellelinie med et standardiseret spektrum af stigende koncentrationer af puromycin (1,0, 2,5, 5,0, 7,5, 10,0 og 15,0 µg/mL) i forskellige perioder af tid (5-10 min). For at vurdere lokaliseret oversættelse eller en tidlig reaktion til narkotikabehandling, en kortere Inkubationstiden er foretrukket (f.eks. mindre end 5 min), da det giver mulighed for direkte vurdering af translationel begivenhederne direkte efter en specifik behandling. Ideelt, puromycin signalet bør være let påviselige men bør også undgå mætningspunktet (figur 2). Som afbildet i figur 2 (venstre paneler), er en acceptabel puromycin koncentration 7,5-10,0 µg/mL for MRC-5 og HeLa, hvorimod 5.0-7,5 µg/mL af puromycin foreslås for Huh-7. Optimering af de eksperimentelle parametre er afgørende, fordi målet med denne metode er ikke helt hæmmer alle translationel brudforlængelse på tidspunktet for indledningen men tag nyligt synthetized polypeptidkæder under oversættelse til at opdage akut variationer i oversættelse. Denne indledende fase i protokollen bør ikke være forsømt, som overdreven puromycin tilgængelighed og forlængede behandlingstiden vil medføre større uønskede konsekvenser. Som anført i figur 2 (højre paneler), generere celler behandles i 10 min med en høj puromycin koncentration for det meste mindre puromycilated polypeptider, (fx Huh-7, 7,5 µg/mL eller mere for 10 min). Disse mindre polypeptider vil diffuse hurtigere i den celle, som kan interferere med præcist vurdere subcellulært lokalisering. Et andet problem er, at øget proteolyse opstår ved overdreven puromycin behandling19. Dette resultat blev observeret i MRC-5 og HeLa celler behandles i 10 min, som viste nedsat signal intensitet i 10 eller 15 µg/mL af puromycin. Begge af disse fænomener er vildledende, hvis puromycin vedtægter er vurderet ved immunfluorescens fordi øget diffusion forhindrer den nøjagtig visualisering af oversættelse localization, der henviser til, at puromycin-induceret nedbrydning høj grad formindsker påvisning følsomhed. Disse uønskede konsekvenser er nemt undgås ved korrekt definition af optimal forsøgsbetingelser, som beskrevet i afsnit 1 i protokollen.
Mens visualisere puromycin vedtægter, er det også vigtigt at foretage korrekt kontrol. Som vist i figur 3A, kan puromycin vedtægter blokeres effektivt ved tilsætning af 50 µg/mL cycloheximide, et stof, der er kendt for at hæmme oversættelse brudforlængelse20 og dermed puromycin vedtægter. Denne adfærd er vist i figur 3B, som viser, at cycloheximide behandling effektivt forhindrede de fleste af signalet svarende til puromycin indarbejdelse i vedhængende MRC-5 celler. Faktisk, mens puromycilated peptider kan visualiseres i celler behandles med puromycin kun, et svagt signal er opdaget i celler, der blev også behandlet med cycloheximide under identiske farvning betingelser. Alternativt kan et andet antibiotikum (anisomycin) også bruges som en negativ kontrol, som det har evnen til at blokere peptidyl transferase aktivitet5 og har vist sig at være så effektiv som cycloheximide til at blokere puromycin vedtægter5 ,18
Efter immunfluorescent billede erhvervelse er det muligt at vurdere den generelle lokalisering af puromycilated polypeptider svarende til nyligt synthetized proteiner (figur 4). Billedlag er valgt på forskellige dybder i vedhængende celler, giver signal intensiteten i subcellulært rum skal vurderes i anden celle fly. Som sådan, er det muligt at sammenligne de lokaliserede puromycilation reaktion i bunden af celle (figur 4A), i midten af cellen (figur 4B) eller toppen af celle (figur 4 c). Beliggende lidt over spirende og maturating friktion strukturer, overholdes SICs for det meste i midten af cellen. Som forventet, er intens puromycilation opdaget i SICs, tyder på, at mRNA oversættelse er isoleret til disse subcellulært strukturer. Som tidligere nævnt, er det muligt at sammenligne signal intensitet langs en ønskede akse. Denne sammenligning er kun mulig, hvis billederne erhvervet ikke omfatter mættede pixels, som vises rødt i gråtonebilledet (anden paneler fra toppen) fremstillet ved hjælp af mikroskop opererer software. Disse billeder kan importeres til ImageJ software til kvantificering og analyse af pixel intensitet langs en udpegede akse. Pixel kvantificering kan gengives grafisk (midterste panel) til at illustrere relative pixel intensiteten på udpegede positioner langs aksen. Et nærmere kig på Indsæt i de øverste paneler viser SIC-actin grænser (i rødt) og et grønt signal inden for den struktur, der svarer til meget aktive oversættelse begivenheder, der er beriget i disse strukturer (nederste del). Selv om denne kvantificering metode ikke er den bedste måde at afgøre den nøjagtige procentdel af samlede oversættelse forekommer i disse strukturer, det er visuelt informativ ved at give mulighed for hurtig vurdering af signal intensitet og er en god tilnærmelse til den signal distribution i hele cellen.
For at opnå en kvantitativ distribution af signal i hele hele cellen, bør en anden metode anvendes. Som vist i figur 5, er en af de vigtigste skridt til at betegne interesseområder, der skal kvantificeres for hver z-plan komponere Konfokal billedfiler. Denne tildeling kan opnås ved hjælp af en anden tegning værktøj fundet i ImageJ. Brug denne metode, er det muligt at kvantificere enten et enkelt område eller flere områder, der kan så være sammenlignet, trækkes, eller endda kompileret. De største problemer er at: (i) finde den optimale imaging betingelser, undgå pixel mætning og baggrunden signal, som kunne forvanske de kvantitative værdi af den opnåede signal, og (ii) etablere optimal kalibrering af tærsklen i ImageJ. Antages det, at begge disse betingelser er optimale, er denne kvantificering metode meget reproducerbare samtidig stadig nem at udføre. Før billede erhvervelse er det også vigtigt at omhyggeligt bestemme de øvre og nedre grænser for z-fly af den celle, der er valgt for kvantificering. I sagen præsenteret i figur 4, svarer den nederste del til opløsning grænsen af det mål, som ofte omfatter forurener flygtige fluorescens, hvilket kan mindske SIC/celle organ signal ratio. Som tidligere nævnt, SICs er involveret i vedhæftning site dannelse og modning; Derfor, SIC strukturer er beliggende lidt over nyligt danner vedhæftning komplekser, der udelukker flygtige fluorescens fra de nederste lag. Således, SIC-bundet puromycilation signal er næppe synlige i de nederste afsnit, der henviser til, at vi kan klart obsErve det i den midterste del, forklarer det øgede forholdet mellem SIC/cellen kroppen signal i den midterste regionen sammenlignet med de nedre eller øvre fly.
Figur 1. Eksperimentelle gengivelse af den puromycin behandling optimering beskrevet i afsnit 1.
(A) en 24-godt repræsentation af celler bliver seedet til eksperiment (trin 1.1). (B) skematisk gengivelse af trin 1.4 viser medium ændringen i rækker 1 og 2 af 24-godt plade og tilsætning af cycloheximide (CHX) til hvert hul i den tredje række til en endelig koncentration på 50 µg/mL. (C) skematisk repræsentation af puromycin behandling i anden og tredje rækker (trin 1,6) 15 min efter trin 1.4. (D) skematisk repræsentation af puromycin behandling i den første række (trin 1.8) 5 min efter trin 1,6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Bestemmelse af de optimale betingelser for puromycin vedtægter.
Western blot analyse af cellen hele uddrag fra (A)MRC-5, (B) Huh-7, og (C) HeLa celler, inkuberes med stigende koncentrationer af puromycin (0, 2,5, 5, 7,5, 10 og 15 µg/mL) for en periode af 5 min (venstre paneler) eller 10 min (højre paneler). Puromycilated peptider blev fundet ved hjælp af en antistof mod puromycin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Hæmning af puromycilation ved hjælp af cycloheximide.
(A) vestlige skamplet viser effekten af cycloheximide på en 5-min puromycilation assay. Indarbejdelse effektivitet i MRC-5, Huh-7 og HeLa celler efter mock (PBS 1 X) eller cycloheximide behandling. (B) Konfokal billede som viser effekten af cycloheximide på puromycin vedtægter. MRC-5 celler blev forbehandlet med enten PBS (mock) eller cycloheximide for 15 min og derefter suppleret med 10 µg/mL af puromycin + PBS 1 X (venstre panel) eller 10 µg/mL af puromycin + 50 µg/mL af cycloheximide (højre panel) for 5 min. Puromycilated proteiner blev fundet ved hjælp af en antistof mod puromycin (grøn). F-actin blev fundet ved hjælp af phalloidin (rød), og kernen var plettet med DAPI (blå). Skær til højre svarer til 2,5 x forstørrelse af den hvide boks. Barer = 10 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kvantificering af de translationel aktivitet i SICs i vedhængende MRC-5 celler.
(A-C) Repræsentative Konfokal billede af vedhængende MRC-5 celler behandles med 10 µg/mL puromycin i 5 min. De billeder, svarer til bunden (A), midten (B)og øvre (C) dele af cellen. De øverste paneler viser puromycilated proteiner påvises ved hjælp af en antistof mod puromycin (grøn). F-actin blev fundet ved hjælp af phalloidin (rød), og kernen var plettet med DAPI (blå). Skær til højre svarer til en 2 x forstørrelse af den hvide boks. Barer = 10 μm. De midterste paneler viser mangel af mættede pixels, hvilket ville have været fremhævet med rødt. Panelerne lavere viser en grafisk repræsentation af puromycilated protein berigelse i en vedhængende MRC-5 celle ved at sammenligne signal intensiteten for puromycin (grøn), F-actin (rød), og DAPI (blå) langs den celle akse angivet med den hvide pil. (D-F) De billeder, svarer til den 4,4 x forstørrelse indsætte af SICs præsenteret i (A-C). Kvantificering viser SIC kant (rød toppe: actin), samt lokaliseret oversættelse inden SICs (grønne toppe: puromycin) i den laveste (D), midten (E), og de øverste (F) regioner i cellen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Hele mobilsignal kvantificering af puromycilated proteiner i vedhængende MRC-5 celler.
(A) bestemmelse af signal inden for forskellige områder af bunden z-plane lag af en vedhængende MRC-5 celle. (Venstre panel) Udvalg af område (I) dækker cellen for at opnå en kvantitativ værdi, der svarer til den samlede cellular signal for denne z-plane lag som helhed. (Midten panel) Udvalg af cellulære området svarende til kernen og cytoplasmatisk del, der ikke omfatter SIC (II). (Højre panel) Visualisering af området svarende til SICs (III) ved at fratrække fremstillet af område II fra værdien opnået for hele cellen (område jeg). Barer = 10 μm. (B) kvantitative pixelværdier for hvert område er angivet i tabellen for billedet skildrer området udvalg i (A), efterfulgt af en graf, der viser andelen (%) af signal fundet i SICs. (C) bestemmelse af signal inden for forskellige områder af midten af z-plane lag af en vedhængende MRC-5 celle. (Venstre panel) Udvalg af området, (I) dækker cellen for at opnå en kvantitativ værdi, der svarer til den samlede cellular signal for denne z-plane lag som helhed. (Midten panel) Udvalg af celle området svarende til kernen og cytoplasmatisk del, der ikke omfatter SIC (II). (Højre panel) Visualisering af området svarende til SICs (III) ved at fratrække fremstillet til område II fra værdien opnået for hele cellen (område jeg). (D) kvantitative pixelværdier for hvert område er angivet i tabellen for billedet skildrer området udvalg i (C), efterfulgt af en graf, der viser andelen (%) af signalet fundet i SICs. (E) bestemmelse af signal inden for forskellige områder af den øverste z-plane lag af en vedhængende MRC-5 celle. (Venstre panel) Udvalg af området, (I) dækker cellen for at opnå en kvantitativ værdi, der svarer til den samlede mobilsignal for denne z-plane lag som helhed. (Midten panel) udvalg af celle området svarende til kernen og cytoplasmatisk del, der ikke omfatter SICs (II). (Højre panel) Visualisering af området svarende til SICs (III) ved at fratrække fremstillet til område II fra værdien opnået for hele cellen (område jeg). (F) kvantitative pixelværdier for hvert område er angivet i tabellen for billedet skildrer området udvalg i (E), efterfulgt af en graf, der viser andelen (%) af signalet fundet i SICs. (G) kvantificering værdierne for alle z-plane lag fra cellen præsenteret ovenfor, herunder en beregnet til z-fly præsenteret i A (z = 1), C (z = 9), og E (z = 19), som er fremhævet med rødt på bordet. (H) grafisk repræsentation af procentdelen af signal fundet i SICs i hele den hele cellevolumen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Seneste teknologiske fremskridt har tilladt for en bedre forståelse af de mekanismer, der er involveret i translationel Opregulering eller undertrykkelse af specifikke mRNAs biologiske processer, såsom neuronal udvikling, drug svar og metastaser. Den omkostningseffektive metode beskrives her tillader oversættelse begivenheder til visualiseres i celler til at studere, hvordan RNA-bindende proteiner regulere metastatiske processer, såsom cellulære vedhæftning, migration og invasion.
Selv om mange metoder til at vurdere de novo protein oversættelse er blevet udviklet, deler de alle den samme strategi, hvori det elongating polypeptid inkorporerer ændrede aminosyrer markeret med en påviselig gruppe. Først af disse metoder bygger på 35S-radiolabeled arginin indarbejdelse i den nyligt oversatte protein. Selv om det er effektivt til at sammenligne generelle satser for oversættelse under særlige betingelser, gør brug af radiolabeled aminosyrer denne metode utiltalende for de fleste forskerhold. Dermed udviklingen af roman metoder ved hjælp af ikke-radioaktive mærker, såsom solnedgang, klik-it, eller metoden TRICK tilbudt nye muligheder for at vurdere og observere i vivo oversættelse begivenheder. Selvom geniale, mulighed de fleste af disse metoder kun for vurdering af oversættelse begivenhederne efter narkotikabehandling eller specifikke cellulære begivenheder ved hjælp af en specifik eksogene cDNA konstruere specifikke mål, begrænse eksperimenter til allerede identificerede mål . Dette er sandt for TRICK tilgang4, som giver mulighed for Translationel regulering af et enkelt eksogent udtrykt mRNA mål skal vurderes. Selv om det giver mulighed for validering af translationel aktivering af endogene mRNAs, er "Klik-IT" metode minimal inkubation tid AHA indarbejdelse mindst 1 h13, anses for længe mest akut oversættelsen mekanismer.
Mens meget alsidig og nem at sætte op, kræver metoden beskrevet her, at de kritiske trin følges i den indledende fase af protokollen. Som vist i de repræsentative resultater, vil forskellige cellelinier have forskellige puromycin indarbejdelse kinetik, som kan simpelthen være på grund af den metaboliske sats af hver cellelinje, som synes at være tilfældet for MRC-5 celler5,21. Faktisk, ikke-transformeret celler er ikke så proliferativ som HeLa, og derfor, protein masse fornyelse er mindre robust end i transformerede celler. Dette bør tages i betragtning når ved hjælp af protokollen. Den første del af protokollen er derfor afgørende for resten af metoden. Nøje bestemmelse af koncentrationen af puromycin og varigheden af inkubationen vil give mulighed for en bedre vurdering af den oversættelse, der opstår under forsøget. Som nævnt ovenfor, behandling med en stor mængde af puromycin øger forholdet mellem små puromycilated polypeptider og synes at stimulere proteolyse, der let kunne føre til en fejlfortolkning af normalt forekommende translationel begivenheder19 . Som en tommelfingerregel, er jo længere inkubationstiden, det mindre puromycin nødvendigt, mens en kortere inkubationstiden kræver en højere puromycin koncentration. Koncentration/tid kan tilpasses særlige eksperimentelle begrænsninger.
De metoder, der præsenteres her er yderst fleksibel og kan nemt ændres efter den behandling eller biologiske proces studerede. Puromycin vedtægter giver mulighed for hurtig vurdering af ændringer i oversættelse kinetik over en kort periode, mens metoden kvantificering giver meget informative billeder af cellulære begivenheder. Selvom magtfulde, har disse metoder begrænsninger, der skal overvejes. Puromycin vil blive indarbejdet i proteiner nyligt syntetiseret fra alle mRNAs, der er aktivt oversat. Af denne grund, den puromycilation metode beskrevet her er muligvis ikke egnet til at undersøge specifikke mål (dvs., enkelt mRNAs), men det er ideel til at få et generelt overblik over translationel aktivitet inden for en enkelt celle eller en celle population. Som nævnt ovenfor, overdreven puromycin har store ulemper, og puromycin doseringer og behandling gange bør nøje defineres, som det foreslås i protokollen. Faktisk, som vist i figur 2, overdreven puromycin tilgængelighed vil resultere i dannelsen af mindre puromycilated polypeptider, diffuse hurtigere i cellen, fører til unøjagtige subcellulært lokalisering data. Desuden vides øget proteolyse at forekomme efter overdreven puromycin behandling19, en effekt, der kan resultere i en fuldstændig tab af signal.
Selv om ikke så specifik som Klik-it eller TRICK metoder, den tilgang, der foreslås her er meget tilgængelig og giver mulighed for hurtig vurdering af generelle ændringer i oversættelse kinetik. Selv om andre metoder er bedre egnet til specifikke applikationer, kan puromycin indarbejdelse assays udføres som en supplerende kontrol. Faktisk, hvis eksperimentet skal vise, at et bestemt mRNA mål er den eneste, der er berørt i en særlig tilstand, det er nødvendigt at vise, at dette ikke er forårsaget af en generel stigning i oversættelse. Som sådan, kunne negativ puromycin vedtægter fremlægge bevis for denne sag. Desuden, denne metode er velegnet til at observere generelle ændringer i oversættelse priser. Derfor, det kan bruges til at vise en oversættelse undertrykkelse mekanisme, som i tilfælde af stress granulet dannelse9, eller til at validere, om cycloheximide behandling, der anvendes i den indledende fase af translationel komplekse fraktionering effektivt blokerer brudforlængelse22. Det er også vigtigt at nævne, at selv om kvantificering metoderne beskrevet i afsnit 2.3 og 2.4 vedrører eksperimenter med fokus på puromycin farvning, de kunne anvendes på enhver form for opdelte farvning ved hjælp af forskellige former for fluorophores. Faktisk disse kvantificering metoder kan bruges til at kvantificere de cellulære fordeling af et molekyle eller protein og kan selv validere lokalisering af et mål i en specifik subcellulært rum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canada) for den kritiske læsning af manuskriptet. Vi takker celle Imaging enhed af Forskningscentret for deres tekniske bistand. M.-É. Huot er en Junior 1 forskning lærd af Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Dette arbejde blev støttet af den canadiske institutter for sundhedsforskning (tildele nummeret CIHR, MOP-286437 til M.-É. Huot).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
