Summary
Questo manoscritto descrive un metodo per visualizzare e quantificare gli eventi di conversione localizzata in compartimenti subcellulari. L'approccio proposto in questo manoscritto richiede un sistema di imaging confocale base e reagenti ed è rapido ed economico.
Abstract
I meccanismi che regolano la traduzione del mRNA sono coinvolti in diversi processi biologici, quali sviluppo di linea del germe, differenziazione cellulare e organogenesi, così come nelle malattie multiple. Numerose pubblicazioni hanno dimostrato in modo convincente che i meccanismi specifici regolano strettamente traduzione degli mRNA. Crescente interesse nella regolazione dell'espressione della proteina indotta da traduzione ha portato allo sviluppo di nuovi metodi per studiare e seguire de novo proteina sintesi in cellulo. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono complessa, che li rende costosi e spesso limitando il numero di mRNA bersaglio che possono essere studiate. Questo manoscritto propone un metodo che richiede solo reagenti di base e un sistema di imaging di fluorescenza confocale per misurare e visualizzare le modifiche nella traduzione di mRNA che si verificano in qualsiasi linea cellulare in varie condizioni. Questo metodo è stato recentemente utilizzato per mostrare la versione localizzata nelle strutture subcellulari delle cellule aderenti in un breve periodo di tempo, offrendo così la possibilità di visualizzare la traduzione del de novo per un breve periodo durante una varietà di biologico processi o di convalida delle modifiche in attività traduzionale in risposta a stimoli specifici.
Introduction
La regolazione della traduzione di diverse funzioni cellulari ha spinto molti gruppi di ricerca per sviluppare nuovi strumenti e metodi per determinare la localizzazione subcellulare di traduzione del mRNA e proteina regolamentato sintesi1,2 ,3,4. Questi recenti progressi tecnologici consentono una migliore comprensione dei meccanismi che coinvolgono il upregulation di traduzione o la repressione di specifici mRNA durante i processi biologici, quali lo sviluppo neuronale, la risposta ai farmaci e metastasi5 ,6,7,8. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi richiedono costosi o pericolosi reagenti e attrezzature specifiche che potrebbero non essere disponibili per la maggior parte dei laboratori. Come tale, un metodo conveniente per consentire la rapida valutazione degli eventi di traduzione è stato sviluppato per eludere specificamente questi potenziali problemi. Questo metodo rileva acute modulazioni traslazionale che si verificano durante specifici processi cellulari e permette anche per la localizzazione di traduzione usando la microscopia confocal.
I metodi descritti qui sono stati utilizzati per monitorare la versione localizzata all'interno di compartimenti subcellulari chiamato diffusione iniziazione centri (SIC)5. SICs è transitori strutture si trovano in celle teste di serie che sono localizzate in cima a complessi di adesione nascente. Anche se SICs e complessi di adesione sono distinti, i loro destini sono strettamente collegati. Infatti, SICs è noto per gradualmente svaniscono con la maturazione di complessi di adesione focale in un sito di adesione durante la fase iniziale di adesione. Abbiamo scoperto che le proteine RNA-leganti notoriamente per controllare in modo specifico la traduzione del mRNA (ad es., Sam68, FMRP e G3BP1) e poliadenilazione RNAs sono stati arricchiti all'interno di queste strutture5. Utilizzando i metodi descritti qui, abbiamo mostrato che il regolamento di SIC-collegata mRNA traduzione agisce come un checkpoint che consente seminato cellule per consolidare l'adesione delle cellule. Questo metodo, basato sull'incorporazione con puromicina, potrebbe essere considerato una versione adattata del rilevamento del superficie di analisi di traduzione (tramonto). Originariamente sviluppato per misurare il tasso di sintesi proteica globale utilizzando un aminoacido non-radioattivo identificato, proteina puromycilation offre un modo efficiente per visualizzare proteine de novo sintesi9. Questo metodo si basa sul comportamento intrinseco del con puromicina, un antibiotico che blocca la traduzione attraverso termine chain prematuro nel ribosoma10. Infatti, con puromicina è strutturalmente analoga alla tyrosyl-tRNA, che consente per l'incorporazione nell'allungamento catene peptidiche attraverso la formazione di un legame peptidico. Tuttavia, associazione con puromicina ad una catena crescente del peptide impedisce un nuovo legame peptidico in formazione con successivo aminoacyl-tRNA, poiché con puromicina ha un legame di ammide non idrolizzabili invece di legame estere idrolizzabile trovato nel tRNA. Così, l'incorporazione di con puromicina allungando polipeptidi provoca il rilascio prematuro di numerosi polipeptidi troncato puromycilated corrispondente al attivamente tradotta mRNA9,11,12 .
Utilizzando questo metodo, è stato possibile valutare traduzione attiva all'interno di una vedova di breve periodo di tempo (ad es., 5 min) durante l'adesione cellulare, utilizzando un anticorpo specifico diretto contro con puromicina sulle cellule che sono stati completati con l'antibiotico per periodi di 5-min in diversi momenti durante il processo di adesione delle cellule5. La precisione di questo test si basa su altamente specifici anticorpi diretti contro la frazione di puromycilated. Immunofluorescente rilevamento del polipeptide puromycilated fornisce una ripartizione subcellulare generale del mRNA appena tradotta, che può anche essere quantificata con grande precisione utilizzando sistemi di imaging confocale.
Quindi, questo metodo offre un'opzione pertinente per un gran numero di laboratori di studiare i meccanismi di regolazione traduzionale coinvolti in processi come un neurone granulazione6,13,14, 15, morfogeno mRNA localizzazione e traduzione durante lo sviluppo16,17. È anche adatto per studiare traduzione localizzata o compartimenti durante rapidi eventi biologici, come ad esempio la migrazione cellulare, adesione o invasione, o semplicemente valutare trattamenti farmacologici che possano indurre cambiamenti traslazionale5, 7 , 18. nel complesso, questo metodo consente la visualizzazione degli eventi di traduzione localizzata o controllata in modo rapido, preciso e conveniente.
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Protocol
1. determinazione delle condizioni di Puromycilation
Nota: questa tecnica viene descritto il metodo utilizzato per valutare la versione localizzata durante il processo di MRC-5 cella adesione 5. Come puromycilation può essere fatto in qualsiasi cella, è importante ottimizzare le condizioni di puromycilation per le linee cellulari specifiche da utilizzare, poiché le condizioni di trattamento non sono identiche per ogni linea cellulare in termini di concentrazione con puromicina e la desiderata tempo di incubazione. Per mostrare come queste condizioni sono definite, tre linee cellulari di esempio (vale a dire, HeLa, MRC-5 e Huh-7) sono stati trattati con aumento delle concentrazioni di con puromicina per tempi diversi di incubazione ( Figura 1).
- Grow identico numero di cellule in una piastra a 24 pozzetti in 0,5 mL di appropriato completa terreno di coltura 16 h prima del test. Cellule MRC-5 semi 30.000, 50.000 cellule HeLa o 50.000 HuH-7 cellule per pozzetto. Assicurarsi che evitare di superare la confluenza di 60-70% (Figura 1A).
- Preparare 6 tubi con 1,5 mL di terreno di coltura cellulare completo con aumento delle concentrazioni di con puromicina (0, 5, 10, 15, 20 e 30 µ g/mL). Pre-riscaldare a 37 ° C.
- Per ogni concentrazione con puromicina terreno (preparato in passaggio 1.2), di trasferire 0,5 mL da ciascuna tube in 6 nuovi tubi e aggiungere cicloesimmide ad una concentrazione finale di 50 µ g/mL per tutti i 6 nuovi tubi. Pre-riscaldare a 37 ° C.
- Cambiare il mezzo con 0,5 mL di terreno di coltura completa (riga 1 e 2). Per la terza riga, aggiungere 0,5 mL di terreno di coltura completa addizionata di 50 µ g/mL di cicloesimmide ( Figura 1B).
Nota: Il trattamento del cicloesimmide è stato stabilito come il miglior controllo negativo per proteina puromycilation grazie alla sua capacità di bloccare l'allungamento di traduzione. Poiché l'incorporazione con puromicina richiede allungamento di traduzione, il trattamento del cicloesimmide conduce ad una perdita di puromycilated proteina segnali 5 , 18. - Incubare per 15 min a 37 ° C (5% CO 2).
- Aggiungere 0,5 mL di terreno con puromicina preparato al punto 1.2 alla seconda riga per ottenere le concentrazioni finali di 0, 2,5, 5, 7.5, 10 e 15 µ g/mL, rispettivamente, nelle colonne A, B, C, D, E e F. Allo stesso tempo, aggiungere 0,5 mL di con puromicina al medium cicloesimmide-completati (punto 1.3) nella terza riga ( Figura 1).
- Incubare per 5 min a 37 ° C (5% CO 2).
- Aggiungere 0,5 mL di terreno con puromicina preparato al punto 1.2 alla prima riga per ottenere le concentrazioni finali di 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 e 15 µ g/mL ( Figura 1).
- Incubare per 5 min a 37 ° C (5% CO 2).
- Lavare ogni bene dal salino righe 1-3 con 1 mL di gelida 1x tamponata fosfato (PBS) 5 min dopo l'aggiunta di con puromicina pozzetti della prima riga (lavare due volte). Aggiungere 75 µ l di tampone X Laemmli 1 (4% sodio dodecil solfato (SDS), 4% 2-mercaptoetanolo, 0.120 M Tris-HCl pH 6.8, 0,004% blu di bromofenolo e 10% glicerolo) per ottenere lisati di cellule intere per ogni condizione. Elettroforesi del gel di
- Esegui 10% SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) con 1/3 dei campioni preparati per valutare incorporazione con puromicina.
- Determinare il livello di incorporazione con puromicina mediante Western blot usando un anticorpo anti-con puromicina (12 D 10) diluito in un rapporto di 1: 25 000 in tampone di incubazione anticorpo primario (2% albumina di siero bovino (BSA)), 430 mM NaCl, Tris 10 mM pH 7.4 e 0,01% sodio azide).
Nota: Immagini rappresentative, corrispondenti a differenti delle cellule linea estratti completati descritto nel passaggio 1 sono mostrati come esempi in Figura 2.
- Determinare il livello di incorporazione con puromicina mediante Western blot usando un anticorpo anti-con puromicina (12 D 10) diluito in un rapporto di 1: 25 000 in tampone di incubazione anticorpo primario (2% albumina di siero bovino (BSA)), 430 mM NaCl, Tris 10 mM pH 7.4 e 0,01% sodio azide).
2. In Cellulo Localizzato visualizzazione traduzione
Nota: la tecnica qui descritta è stata utilizzata per valutare la versione localizzata all'interno di SICs in cellule MRC-5 durante il processo di adesione 5. Anche se le cellule MRC-5 sono usate qui, altre linee cellulari possono essere utilizzati con la stessa metodologia descritta nel passaggio 2.1.
- Preparazione di cell.
- Staccare MRC-5 celle utilizzando 0,25% tripsina/2,21 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in Hank ' s soluzione salina bilanciata (HBSS). Agglomerare le cellule mediante centrifugazione (5 min a 200 x g) in una provetta conica per centrifuga 15 mL e sospenderle in Dulbecco ' Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) a 40.000 cellule/mL dopo che conta con una camera di conteggio di s.
- Incubare le cellule sospese a 37 ° C in delicata rotazione utilizzando un rotatore tubo per 20 min per essere mantenute in sospensione.
Nota: Questo passaggio è fondamentale per consentire la completa dissociazione dei complessi di adesione focale. - Piastra 2 mL di cellule MRC-5 sospese (40.000 cellule/mL) in due piatti di 35mm con fondo di vetro. Utilizzare il primo piatto di 35 mm con fondo di vetro per il dosaggio di puromycilation (Vedi punto 2.1.5) e utilizzare la seconda come controllo negativo (Vedi punto 2.1.6).
- Mantenere le cellule a 37 ° C (5% CO 2) per 55 min consentire adesione cellulare e formazione di SIC.
- Con puromicina. Aggiungi al mezzo nei piatti con fondo di vetro 35mm (saggio) usando la concentrazione precedentemente definita nella sezione 1. Per il trattamento di cellule MRC-5, utilizzare con puromicina. 10 µ g/mL per 5 min a 37 ° C (5% CO 2).
- Come controllo negativo, aggiungere cicloesimmide al secondo 35 mm con fondo di vetro piatto 40 min dopo la semina le cellule per pre-trattare con cicloesimmide di 50 µ g/mL ( Figura 2B). 15 min dopo l'aggiunta del cicloesimmide, aggiungere quindi con puromicina al mezzo utilizzando la stessa concentrazione e incubazione data come descritto al punto 2.1.5 (ad es., uso 10 µ g/mL di con puromicina per 5 min a 37 ° C (5% CO 2) per MRC-5).
- Lavare ogni piatto due volte con 2 mL di gelida 1 X PBS e fissare le cellule con 1 mL di formaldeide al 4% (diluito in 1X PBS) per 15 min a temperatura ambiente (TA).
Attenzione: Paraformaldeide deve essere utilizzato unicamente in una cappa chimica.
- Immunostaining.
- Dopo la fissazione del paraformaldeide, lavare tre volte con 2 mL di 1X PBS e incubare in 500 µ l di PBS-TritonX-100 (0,5%) per 20 min a RT per permeabilize le cellule.
- Per impedire il legame non specifico anticorpo, bloccare il campione con 500 µ l PBS – BSA (1%) per 20 min a RT.
- Lavare tre volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e incubare con 300 µ l di 1:12,500 con anti-puromicina anticorpo (12 D 10) diluito in 1X PBS per 1h a RT.
- Lavare 3 volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e incubare con 300 µ l di anti-topo IgG coniugato ad un fluoroforo (qui, 488 nm) diluito in PBS per visualizzare puromycilated polipeptidi e con falloidina coniugata a un altro fluoroforo (qui, 555 nm) per visualizzare F-actina. Incubare per 1 h a RT.
- Lavare tre volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e poi incubare per 5 min a RT a 300 µ l di PBS-Tween20 (0,1%) completati con 1 µ g/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Lavare tre volte con 2 mL di PBS-Tween20 (0,1%) e poi lavare con 2 mL di 1X PBS. Impedire alle cellule di essiccazione mantenendo il campione in 2 mL di 1X PBS durante acquisizione immagine.
3. Acquisizione di immagini di immunofluorescente
Nota: la seguente metodologia può essere utilizzata con qualsiasi sistema di imaging confocale commercialmente disponibile.
- Determinare le appropriate impostazioni per ogni fluoroforo per massimizzare la gamma dinamica per quantificazione.
Nota: Quantificazione rappresentativa può essere ottenuto solo se viene evitata la saturazione di pixel e la soglia di segnale è regolata correttamente. Queste impostazioni possono essere raggiunti regolando accuratamente la potenza del laser, ad alta tensione (HV), guadagno, e l'offset. Fattore di- regolare lo zoom (5x) e il numero di pixel (512x512) per ottimizzare le dimensioni dei pixel.
Nota: Questo dovrebbe essere almeno 2.3 - volte più piccolo rispetto alla risoluzione ottica, secondo il teorema di Nyquist. - Diminuire la velocità di scansione (12,5-20 µs/pixel) e utilizzare una media (2 - 3 volte) per migliorare il rapporto segnale-rumore secondo le impostazioni di cui sopra.
- regolare lo zoom (5x) e il numero di pixel (512x512) per ottimizzare le dimensioni dei pixel.
- Manualmente determinare alto appropriato e inferiore piani focali lungo l'asse z con la dimensione ottimale passaggio (0,4 µm/fetta).
Nota: Il piano di dimensioni di passaggio è determinato dalla risoluzione assiale divisa da 2.3, secondo il teorema di Nyquist. In genere, 20-25 strati sono necessari per coprire la profondità intera cella delle celle aderenti. - Acquisire un'immagine confocale di un'intera cella singola con un obiettivo a immersione in olio (apertura numerica 1,42) X piano Apo 60.
4. Quantificazione di immagine immunofluorescente
- determinazione di arricchimento.
- Aprire un'immagine corrispondente al layer di z-aereo di interesse dal file di dati di acquistato delle cellule usando il software ImageJ (freeware disponibile presso http://fiji.sc).
- Disegnare una linea utilizzando lo strumento di disegno a tratteggio (barra degli strumenti → dritto) attraverso le regioni della cellula dove quantificazione è desiderato. Modificare lo spessore della linea facendo doppio clic su " dritto; " i valori di intensità saranno mediati attraverso la larghezza della linea (fissato a 8 nella Figura 3).
Nota: Una linea più sottile è preferita per evitare la sovrapposizione di segnale da diverse strutture.
Profilo di - dopo la riga è impostata correttamente, la densità del segnale lungo l'asse determinato (barra dei menu → Analyze → tracciare il profilo).
Nota: Una nuova finestra si aprirà che mostra un profilo corrispondente all'intensita di segnale per ogni pixel del canale selezionato (specifico fluoroforo) lungo la linea per la sezione selezionata del piano z.- Ripetere il processo per ogni canale corrispondente il fluoroforo utilizzato (vale a dire una quantificazione per 488, uno per 568 e uno per 405).
Nota: Il valore di intensità del segnale sempre verrà ordinato seguendo l'orientamento della linea disegnata.
- Ripetere il processo per ogni canale corrispondente il fluoroforo utilizzato (vale a dire una quantificazione per 488, uno per 568 e uno per 405).
- Per ottenere i valori numerici in scala di grigi per ogni pixel del profilo corrispondente per la quantificazioni di livello z-aereo selezionato, copiare i dati del profilo (barra dei menu nella finestra immagine → copia) e incollarlo in qualsiasi software di foglio di calcolo. 4.1.1-4.1.4
- ripetere i passaggi per ogni sezione del piano z dell'immagine acquisita confocale ed ogni canale dove è voluto quantificazione.
Nota: La quantificazione dei diversi strati di z-aereo possa essere riunita per ottenere una valutazione generale dell'arricchimento speciale del segnale calcolando il valore della somma di ogni pixel lungo la linea per ogni strato di z-plane. Questo tipo di pool può essere raggiunto solo se la linea tracciata è identica per ogni strato di z-aereo incluso nei valori medi. - Come metodo alternativo per la quantificazione di cellule intere di canali diversi con un gran numero di strati, utilizzare la macro denominata StackprofileData (vedere il File supplementare).
Nota: Questa macro è accessibile liberamente a https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt e può essere utilizzata come segue:- incollare la macro in un file di testo e salvare esso.
- Aprire il file di immagine che include tutti i livelli confocale della cellula.
- Disegnare una linea, come descritto al punto 4.1.2, aprire una nuova finestra per importare la macro (barra dei menu → plugin → macro → eseguire), scegliere il file di testo salvato in precedenza corrispondente alla macro StackprofileData e fare clic su " Open. "
Nota: A seguito di importazione di macro, una nuova finestra denominata " risultati " si aprirà e tutti la quantificazione lungo l'asse determinato saranno elencati per ogni strato di z-plane e canale presenti nei file immagine. - Copiare i dati per ogni canale (barra dei menu → modificare → copia) per ottenere la rappresentazione grafica del profilo corrispondente per la quantificazioni di segnale. Incollarlo in qualsiasi software di foglio di calcolo. Calcolare il valore della somma di ogni canale per ogni pixel lungo la linea per ogni strato di z-plane. Utilizzare questi valori per creare una rappresentazione grafica simile a quello presentato nella Figura 3.
- Quantificazione del segnale in un volume o designata zona cellulare.
- Aprire il file di immagine con software ImageJ.
- Disegnare un'area per indicare l'area di interesse utilizzando la funzione di forma geometrica (barra degli strumenti → " rettangolo, " " ovale, " o " poligono ").
Nota: Il valore di quantificazione sarà determinato per l'area corrispondente alla forma disegnata. - Regolare il livello di soglia per evitare qualsiasi segnale di fondo (barra dei menu → immagine regolare → soglia); una nuova finestra apparirà per rappresentare le intensità di pixel in forma di istogramma. Modificare i valori per includere o escludere pixel nella quantificazione utilizzando il dispositivo di scorrimento. Selezionare una soglia che Elimina pixel rossi all'esterno della cellula, come evidenziato in rosso pixel sarà incluso nella quantificazione.
- Definire i parametri di misurazione per quantificare il segnale di pixel all'interno dell'area selezionata, senza segnale di fondo (barra dei menu → Analyze → impostare misure) e assicuratevi di controllare il " limite di soglia " e il " densità integrata " scatole.
- Misurare i valori quantitativi per l'area selezionata (barra dei menu → Analyze → misura).
Nota: Quantificazione di intensità del segnale sarà presentato in una nuova finestra sotto il " IntDen " identificazione, che rappresenta il prodotto dei valori medi di grigio e il numero di pixel all'interno dell'area selezionata. - Disegnare un'area che include l'intera cella utilizzando una forma geometrica (barra degli strumenti → " rettangolo, " " ovale, " o " poligono ") e procedere con la procedura 4.2.3-4.2.5 per ottenere un valore corrispondente al segnale totale. Calcolare il rapporto del segnale all'interno dell'area selezionata sopra l'intero segnale per ottenere la percentuale del segnale all'interno dell'area di interesse.
- Ripetere passaggi 4.2.2-4.2.6 per ottenere la quantificazione del volume di cella per ogni z-plane. Adattare la forma geometrica come necessario.
- Copiare/incollare i dati ottenuti dalla " risultati " windows per ogni strato di z-aereo in un foglio di calcolo per la rappresentazione grafica e per trovare un valore medio.
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Representative Results
Per osservare con precisione gli eventi di traduzione mediante incorporazione con puromicina, è fondamentale per determinare le condizioni ottimali per ogni linea cellulare perché ognuno Mostra diversi con puromicina incorporazione cinetica (Figura 1)9,11 ,12,18. Quindi, per convalidare l'incorporazione con puromicina, è necessario trattare la linea cellulare desiderato con uno spettro standardizzato di aumento delle concentrazioni di con puromicina (1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 e 15.0 µ g/mL) per diversi periodi di tempo (5 e 10 min). Per valutare la versione localizzata o una risposta iniziale al trattamento farmacologico, un più breve tempo di incubazione è preferito (ad esempio, meno di 5 minuti), in quanto permette la valutazione diretta degli eventi traslazionale direttamente seguendo un trattamento specifico. Idealmente, il segnale con puromicina dovrebbe essere facilmente rilevabile ma dovrebbe anche evitare il punto di saturazione (Figura 2). Come raffigurato in Figura 2 (pannelli a sinistra), una concentrazione accettabile con puromicina è 7.5-10.0 µ g/mL per MRC-5 e HeLa, mentre 5.0-7.5 µ g/mL di con puromicina è suggerito per Huh-7. Ottimizzazione dei parametri sperimentali è cruciale perché l'obiettivo di questo metodo è di non inibire completamente tutti i allungamento traslazionale nel momento dell'iniziazione, ma Tag recentemente sintetizzato le catene polipeptidiche durante la traduzione di rilevare acuta variazioni nella traduzione. Questa fase iniziale nel protocollo non dovrebbe essere trascurato, come eccessivo con puromicina disponibilità e tempo di trattamento esteso causerà gravi conseguenze indesiderate. Come osservato in Figura 2 (pannelli di destra), cellule trattate per 10 min con una concentrazione elevata con puromicina genererà principalmente più piccoli polipeptidi puromycilated (ad es., Huh-7, 7,5 µ g/mL o più per 10 min). Questi più piccoli polipeptidi diffonderanno più rapidamente nella cellula, che potrebbe interferire con la localizzazione subcellulare di valutare con precisione. Un altro problema è quello proteolisi aumentata si verifica al momento con puromicina eccessivo trattamento19. Questo risultato è stato osservato in cellule MRC-5 e HeLa trattate per 10 min, che ha mostrato l'intensità di segnale in diminuzione in presenza di 10 o 15 µ g/mL di con puromicina. Entrambi questi fenomeni sono fuorvianti se incorporazione con puromicina è valutata dall'immunofluorescenza poiché diffusione aumentata impedisce la visualizzazione accurata di traduzione, localizzazione, mentre degradazione indotta da con puromicina diminuisce notevolmente sensibilità di rilevazione. Queste conseguenze indesiderate sono facilmente evitabili definendo correttamente le condizioni sperimentali ottimali, come descritto nella sezione 1 del protocollo.
Durante la visualizzazione di incorporazione con puromicina, è anche importante effettuare controlli adeguati. Come mostrato in Figura 3A, incorporazione con puromicina può essere bloccato in modo efficiente con l'aggiunta di cicloesimmide di 50 µ g/mL, un composto noto per inibire la traduzione allungamento20 e così incorporazione con puromicina. Questo comportamento è illustrato nella Figura 3B, che dimostra che il trattamento del cicloesimmide impedito in modo efficiente la maggior parte del segnale corrispondente alla incorporazione con puromicina in cellule aderenti MRC-5. Infatti, mentre puromycilated peptidi possono essere visualizzati in cellule trattate con solo con puromicina, viene rilevato un segnale debole in cellule che sono state trattate con cicloesimmide colorazione in condizioni identiche. In alternativa, un altro antibiotico (anisomycin) può essere utilizzato anche come controllo negativo, come ha la capacità di bloccare peptidil transferasi attività5 e ha dimostrato di essere efficace come cicloesimmide a bloccare incorporazione con puromicina.5 ,18
A seguito di acquisizione immagine immunofluorescente, è possibile valutare la localizzazione generale dei polipeptidi di puromycilated corrispondente al recentemente sintetizzato proteine (Figura 4). Livelli delle immagini vengono selezionati a diverse profondità all'interno delle cellule aderenti, permettendo l'intensità del segnale in compartimenti subcellulari da valutarsi in piani differenti delle cellule. Come tale, è possibile confrontare la reazione di puromycilation localizzata nella parte inferiore della cella (Figura 4A), al centro della cella (Figura 4B), o la parte superiore della cella (Figura 4). Situato leggermente sopra le strutture di adesione nascente e maturato, SICs è principalmente osservata al centro della cella. Come previsto, puromycilation intenso viene rilevato in SICs, suggerendo che la traduzione degli mRNA è isolato a queste strutture subcellulari. Come accennato in precedenza, è possibile confrontare l'intensità del segnale lungo l'asse desiderato. Questo confronto è possibile solo se le immagini acquisite non includono saturi pixel, che appaiono in rosso nell'immagine in scala di grigi (secondo pannelli dall'alto) ottenute mediante il microscopio software operativo. Queste immagini possono essere importate nel software ImageJ per quantificazione e l'analisi dell'intensità pixel lungo un asse indicato. La quantificazione di pixel può essere rappresentata graficamente (pannello centrale) per illustrare l'intensità di pixel relativo all'area posizioni lungo l'asse. Guardiamo più da vicino l'inserto in pannelli superiori Mostra i confini di SIC-actina (in rosso) e un segnale verde all'interno della struttura che corrisponde agli eventi di traduzione altamente attiva, che si sono arricchiti all'interno di queste strutture (sezione inferiore). Anche se questo metodo di quantificazione non è il modo migliore per determinare la percentuale esatta della traduzione totale che si verificano in queste strutture, è visivamente informativo, consentendo una rapida valutazione dell'intensità del segnale ed è una buona approssimazione della distribuzione del segnale in tutta la cellula.
Per ottenere una distribuzione quantitativa del segnale in tutta la cellula intera, deve essere utilizzato un altro metodo. Come illustrato nella Figura 5, uno dei passaggi chiave è per indicare le aree di interesse che devono essere quantificati per ogni z-plane che compongono i file immagine confocale. Questa assegnazione può essere raggiunto utilizzando uno strumento di disegno differente trovato in ImageJ. Utilizzando questo metodo, è possibile quantificare una singola zona o le zone multiple, che possono poi essere confrontate, sottratto o anche compilate. Le difficoltà principali sono per: (i) trovare l'imaging ottimo condizioni che evitare saturazione di pixel e il segnale di fondo, che potrebbe distorcere il valore quantitativo del segnale ottenuto e (ii) stabilire una calibrazione ottimale della soglia in ImageJ. Supponendo che entrambe le condizioni sono ottimale, questo metodo di quantificazione è altamente riproducibile pur rimanendo facile da eseguire. Prima dell'acquisizione di immagini, è anche importante determinare accuratamente i limiti inferiori e superiori del z-aerei la cella selezionata per la quantificazione. Nel caso presentato nella Figura 4, la sezione inferiore corrisponde al limite di risoluzione dell'obiettivo, che spesso include contaminando fluorescenza evanescente, che può fare diminuire il rapporto di segnale del corpo SIC/cella. Come precedentemente accennato, SICs è coinvolti nella formazione del sito di adesione e maturazione; di conseguenza, SIC strutture si trovano leggermente sopra appena formando complessi di adesione, che esclude la fluorescenza evanescente dagli strati più in basso. Così, il segnale di puromycilation associato a SIC è a malapena visibile nelle sezioni inferiore, mentre possiamo chiaramente obsErve è nella sezione centrale, spiegando il rapporto aumentato di corpo SIC/cellulare segnale nella regione centrale rispetto ai piani inferiori o superiori.
Figura 1. Rappresentazione sperimentale dell'ottimizzazione del trattamento con puromicina descritto nella sezione 1.
(A) una rappresentazione 24 pozzetti delle cellule essendo testa di serie per l'esperimento (punto 1.1). (B) rappresentazione schematica del passo 1.4 mostrando il cambiamento medio nelle righe 1 e 2 della piastra 24 pozzetti e l'aggiunta di cicloesimmide (CHX) in ciascun pozzetto della terza fila per una concentrazione finale di 50 µ g/mL. (C) rappresentazione schematica di un trattamento con puromicina. la seconda e terza fila (passo 1.6) 15 min dopo passo 1.4. (D) rappresentazione schematica di un trattamento con puromicina. la prima riga (passo 1,8) 5 min dopo passo 1.6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Determinazione delle condizioni ottimali per incorporazione con puromicina.
L'analisi Western blot della intero-cellula estrarre da MRC-5 (A), (B) Huh-7 e (C) le cellule HeLa, incubate con aumento delle concentrazioni di con puromicina (0, 2,5, 5, 7.5, 10 e 15 µ g/mL) per un periodo di 5 min (pannelli a sinistra) o 10 min (a destra pannelli). Puromycilated peptidi sono stati rilevati usando un anticorpo contro con puromicina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Inibizione di puromycilation utilizzando cicloesimmide.
(A) Western blot che mostrano l'effetto del cicloesimmide su un dosaggio di 5-min puromycilation. Efficienza di incorporazione in MRC-5, Huh-7 e le cellule HeLa seguito mock (PBS 1X) o il trattamento del cicloesimmide. (B) confocale immagine mostra l'effetto del cicloesimmide sull'incorporazione con puromicina. Cellule MRC-5 sono stati pre-trattate con PBS (finto) o cicloesimmide per 15 min e poi completate con 10 µ g/mL di con puromicina + PBS 1X (pannello sinistro) o 10 µ g/mL di con puromicina + 50 µ g/mL di cicloesimmide (pannello di destra) per 5 min Puromycilated proteine sono stati individuati usando un anticorpo contro con puromicina (verde). F-actina è stata rilevata mediante falloidina (rosso), e il nucleo è stato macchiato con DAPI (blu). Inserti a destra corrispondono a un ingrandimento 2.5 x della scatola bianca. Bar = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. Quantificazione dell'attività traslazionale in SICs in cellule aderenti MRC-5.
(A-C) Immagine rappresentativa confocal di cellule MRC-5 aderenti trattati con con puromicina. 10 µ g/mL per 5 min. Le immagini presentate corrispondono per il fondo (A), intermedio (B)e superiore (C) porzioni della cella. Pannelli superiori mostrano le proteine puromycilated rilevate usando un anticorpo contro con puromicina (verde). F-actina è stata rilevata mediante falloidina (rosso), e il nucleo è stato macchiato con DAPI (blu). Inserti a destra corrispondono a un ingrandimento di 2x della scatola bianca. Bar = 10 μm. I pannelli mostrano l'assenza di pixel saturi, che sarebbe sono stati evidenziati in rosso. I pannelli inferiori mostrano una rappresentazione grafica di arricchimento della proteina puromycilated in una cella di MRC-5 aderente confrontando l'intensità del segnale per con puromicina (verde), F-actina (rosso), e DAPI (blu) lungo l'asse di cella indicato dalla freccia bianca. (D-F) Le immagini presentate corrispondono alla 4.4 x inserto di ingrandimento di SICs presentato in (A-C). La quantificazione indica il confine SIC (picchi rossi: actina), così come versione localizzata all'interno del SICs (verde picchi: con puromicina) nel più basso (D), mezzo (E), e le regioni superiori (F) della cella. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 5. Quantificazione della intero-cellula segnale di puromycilated di proteine in cellule aderenti MRC-5.
(A) determinazione del segnale all'interno di diverse aree dello strato inferiore piano z di un aderente delle cellule MRC-5. (Pannello di sinistra) Selezione dell'area (I) che copre la totalità della cella per ottenere un valore quantitativo corrispondente al segnale cellulare totale per questo strato di z-plane. (Pannello centrale) Selezione dell'area cellulare corrispondente al nucleo e la porzione citoplasmatica che non include SIC (II). (Pannello di destra) Visualizzazione della zona corrispondente al SICs (III) sottraendo il valore ottenuto dall'area II dal valore ottenuto per l'intera cellula (zona I). Bar = 10 μm. (B) i valori dei pixel quantitativa per ogni area sono elencati nella tabella per l'immagine che raffigura la selezione dell'area in (A), seguita da un grafico che mostra la percentuale (%) del segnale trovato in SICs. (C) determinazione del segnale all'interno di diverse aree dello strato piano z metà di un aderente delle cellule MRC-5. (Pannello di sinistra) Selezione dell'area (I) che copre la totalità della cella per ottenere un valore quantitativo corrispondente al segnale cellulare totale per questo strato di z-plane. (Pannello centrale) Selezione dell'area cella corrispondente al nucleo e la porzione citoplasmatica che non include SIC (II). (Pannello di destra) Visualizzazione della zona corrispondente al SICs (III) sottraendo il valore ottenuto per area II dal valore ottenuto per l'intera cellula (zona I). (D) i valori dei pixel quantitativa per ogni area sono elencati nella tabella per l'immagine che raffigura la selezione di zona (c), seguita da un grafico che mostra la percentuale (%) del segnale trovato in SICs. (E) determinazione del segnale all'interno di diverse aree dello strato superiore piano z di un aderente delle cellule MRC-5. (Pannello di sinistra) Selezione dell'area (I) che copre la totalità della cella per ottenere un valore quantitativo corrispondente al segnale totale delle cellule di questo strato di z-plane. (Pannello centrale) selezione di area di cella corrispondente al nucleo e la porzione citoplasmatica che non include SICs (II). (Pannello di destra) Visualizzazione della zona corrispondente al SICs (III) sottraendo il valore ottenuto per area II dal valore ottenuto per l'intera cellula (zona I). (F) i valori dei pixel quantitativa per ogni area sono elencati nella tabella per l'immagine che raffigura la selezione dell'area (e), seguita da un grafico che mostra la percentuale (%) del segnale trovato in SICs. (G) quantificazione valori per tutti i livelli di piano z dalla cella presentato sopra, tra cui uno calcolati per z-aereo presentato nell'A (z = 1), C (z = 9) ed E (z = 19), che sono evidenziate in rosso sul tavolo. (H) rappresentazione grafica della percentuale di segnale trovato in SICs in tutto il volume dell'intera cella. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I recenti progressi tecnologici hanno consentito una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nel upregulation traslazionale o la repressione di specifici mRNA in processi biologici, quali lo sviluppo neuronale, risposta ai farmaci e metastasi. La metodologia conveniente qui descritta consente traduzione eventi possano essere visualizzati nelle celle per studiare come le proteine RNA-leganti regolano processi metastatici, come adesione cellulare, migrazione e invasione.
Anche se sono stati sviluppati numerosi metodi per valutare la traduzione di proteine de novo , tutti condividono la stessa strategia, in cui il polipeptide prolungando incorpora amminoacidi modificati taggati con una frazione rilevabile. Il primo di questi metodi si basa su 35incorporazione S-radioattivi arginina la proteina tradotta. Anche se è efficiente per confrontare i tassi generali di traduzione sotto specifiche condizioni, l'uso di aminoacidi radiomarcati rende questo metodo poco attraente per la maggior parte delle squadre di ricerca. Quindi, lo sviluppo del romanzo metodi utilizzando etichette non radioattivo, come SunSET, Click-it, o l'approccio di trucco, offerto nuove opportunità per valutare e osservare in vivo traduzione eventi. Anche se geniale, la maggior parte di questi metodi permettono solo per la valutazione degli eventi di traduzione che seguono trattamento farmacologico o eventi cellulari specifici utilizzando un cDNA esogeno specifico costruire di obiettivi specifici, limitando gli esperimenti agli obiettivi già identificati . Questo è vero per il trucco approccio4, che consente la regolazione traduzionale di un singolo bersaglio mRNA esogenicamente espressa da valutare. Anche se consente la convalida dell'attivazione traslazionale dei mRNAs endogeno, il tempo di incubazione minimo di metodo "Click-IT" per l'incorporazione di AHA è almeno 1 h13, che è considerato troppo a lungo per i meccanismi di traduzione più acute.
Mentre estremamente versatile e facile da configurare, il metodo qui descritto richiede che i punti critici da seguire nella fase iniziale del protocollo. Come mostrato nei risultati rappresentativi, diverse linee cellulari avranno cinetica di incorporazione con puromicina diverso, che potrebbe semplicemente essere dovuto il tasso metabolico di ogni linea cellulare, come sembra essere il caso per le cellule MRC-55,21. Infatti, le cellule non trasformate non sono come proliferative come HeLa, e pertanto, rinnovamento massa della proteina è meno robusto rispetto a cellule trasformate. Questo dovrebbe tenere conto quando si utilizza il protocollo. Di conseguenza, la prima parte del protocollo è fondamentale per il resto del metodo. Determinare accuratamente la concentrazione di con puromicina e il tempo d'incubazione consentirà una migliore valutazione della traduzione che si verificano durante l'esperimento. Come accennato in precedenza, il trattamento con una quantità eccessiva di con puromicina aumenta il rapporto del puromycilated piccoli polipeptidi e sembra stimolare la proteolisi, che potrebbero facilmente portare a un'errata interpretazione della norma che si verificano eventi traslazionali19 . Come regola generale, più il tempo di incubazione, il meno con puromicina è necessaria, considerando che un tempo di incubazione più breve richiede una maggiore concentrazione di con puromicina. La concentrazione e l'ora può essere adattata a particolari limitazioni sperimentali.
I metodi presentati qui sono altamente adattabili e possono essere facilmente modificati secondo il trattamento applicato o il biologico processo studiato. Incorporazione con puromicina permette la valutazione rapida delle modifiche nella cinetica di traduzione per un breve periodo di tempo, mentre il metodo di quantificazione fornisce immagini altamente informativi degli eventi cellulari. Anche se potente, questi metodi presentano limitazioni che devono essere considerati. Con puromicina sarà inserito in proteine appena sintetizzate da tutti i mRNAs che attivamente sono stati tradotti. Per questo motivo, il metodo di puromycilation qui descritto potrebbe non essere adatto per lo studio di specifici target (cioè, singolo mRNA), ma è l'ideale per ottenere una panoramica generale delle attività traduzionale all'interno di una singola cella o una popolazione delle cellule. Come accennato in precedenza, con puromicina eccessiva comporta gravi inconvenienti, e con puromicina dosaggi e tempi di trattamento dovrebbero essere definiti con cura, come proposto nel protocollo. Infatti, come mostrato nella Figura 2, disponibilità eccessiva con puromicina provocherà la formazione di piccoli polipeptidi puromycilated che diffondono più rapidamente nella cellula, che conduce ai dati imprecisa localizzazione subcellulare. Inoltre, aumentata proteolisi sono conosciuto per accadere dopo con puromicina eccessivo trattamento19, un effetto che potrebbe comportare una perdita completa del segnale.
Anche se non più specifici come i metodi di trucco o Click-it, l'approccio qui proposto è molto accessibile e consente la rapida valutazione delle modifiche generali nella cinetica di traduzione. Anche se altri metodi sono più adatti per applicazioni specifiche, con puromicina incorporazione analisi possono essere eseguite come un controllo supplementare. Infatti, se l'esperimento ha bisogno di dimostrare che un determinato target di mRNA è l'unico colpito in una particolare condizione, è necessario mostrare che questo non è causato da un aumento generale nella traduzione. Come tale, incorporazione con puromicina negativo potrebbe fornire la prova per questo caso. Inoltre, questo metodo è adatto per osservare i cambiamenti generali a tariffe di traduzione. Quindi, può essere utilizzato per mostrare un meccanismo di repressione della traduzione, come nel caso di stress granello formazione9, o per convalidare se il trattamento del cicloesimmide utilizzato nella fase iniziale di frazionamento di complesso traslazionale sta bloccando in modo efficiente allungamento22. È anche importante ricordare che, sebbene i metodi di quantificazione descritti nelle sezioni 2.3 e 2.4 riguardano esperimenti concentrandosi sulla macchiatura con puromicina, potrebbero essere applicate a qualsiasi tipo di compartimenti che macchia usando vari tipi di fluorofori. Infatti, questi metodi di quantificazione potrebbero essere utilizzati per quantificare la distribuzione cellulare di una molecola o di proteine e anche possono convalidare la localizzazione di un bersaglio in un apposito comparto subcellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Si ringrazia il Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canada) per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo l'unità di Imaging di cella del centro di ricerca per la loro assistenza tecnica. M.-é. Huot è un Junior 1 Research Scholar del Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Questo lavoro è stato supportato dal canadese istituti di salute ricerca (grant numero CIHR, MOP-286437 a M.-É. Huot).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
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