Summary
这份手稿描述了一种方法来可视化和量化本地化的翻译事件亚细胞的车厢内。提出这份手稿的做法需要基本的共焦成像系统和试剂，并且是快速和具有成本效益。
Abstract
调节 mRNA 翻译机制被参与不同的生物学过程，如胚线发育、 细胞分化和器官，以及多种疾病。众多的出版物有令人信服地表明具体机制严格管制 mRNA 翻译。兴趣翻译诱导调控蛋白表达的增加导致了发展的研究并遵循de novo蛋白质合成中 cellulo的新方法。然而，这些方法大多数都复杂，使其成本高昂和经常限制的数量可以进行研究的 mRNA 指标。这份手稿提出要求只基本试剂和荧光共焦成像系统测量并可视化 mRNA 翻译中任何细胞株在不同条件下发生的变化的方法。此方法是最近用来显示本地化的翻译中贴壁细胞的亚细胞结构在短短的时间，从而提供了可视化de novo翻译短期间各种生物的可能性过程或更改进行验证，在翻译活动中对特定刺激的反应。
Introduction
翻译由不同的细胞功能的调节，促使许多的研究团队，开发新的工具和方法来确定亚细胞定位的 mRNA 翻译和调节的蛋白合成1，2 ，34。这些最近的技术进步允许更好地了解涉及翻译上调或特定基因生物学过程，如神经元的发育、 药物反应和转移5 的镇压的机制 ，，67，8。然而，这些方法大多数需要昂贵或有害试剂和可能不到大多数实验室可用的特定设备。因此，一个具有成本效益的方法，允许翻译事件快速评定了专门绕过这些潜在的问题。此方法检测特定细胞过程中发生的急性平移调制，并且还允许本地化的翻译用共聚焦显微镜。
这里描述的方法被用于监视在亚细胞隔离舱称为传播启蒙中心 (SIC)5的本地化的翻译。结果是在本地化在新生粘附复合物的种子细胞中发现的瞬态结构。虽然结果与粘附复合物是不同的他们的命运被息息相关。的确，结果也会逐渐消失后粘着复杂成熟粘附网站粘附的初始阶段。我们发现已知的具体控制 （例如， Sam68，FMRP 和 G3BP1） mRNA 翻译的 RNA 结合蛋白和 Rna 被内这些丰富的 polyadenylated 结构5。我们使用此处所述的方法，表明 SIC 相关的 mRNA 翻译作为检查点允许调节种子细胞巩固细胞粘附。这种基于嘌呤霉素纳入的方法可以考虑翻译测定 （日落） 的表面传改编的版本。最初开发用来衡量全球蛋白质合成率使用非放射性标记的氨基酸，蛋白质 puromycilation 提供可视化de novo蛋白质合成9的有效途径。这种方法依赖于嘌呤霉素，阻止通过过早链终止在核糖体10翻译抗生素的内在行为。事实上，嘌呤是结构上类似于 tyrosyl-tRNA，允许将纳入拉长肽链通过肽键的形成。但是，嘌呤霉素绑定到肽链阻止新的肽键形成与下一个氨酰-tRNA，嘌呤霉素以来非水解酰胺键而不是在转运中找到的水解酯键。因此，嘌呤霉素纳入拉长多肽产生过早披露的众多截断的 puromycilated 多肽对应积极翻译 mRNA9，11，12.
使用此方法，有可能评估活动翻译内短时间寡妇 (例如， 5 分钟) 期间使用针对嘌呤霉素对 5 分钟时间，辅以抗生素的细胞特异性抗体的细胞粘附在不同的时间点在细胞粘附过程5。这种测定方法的精度依赖于针对 puromycilated 基团的高度特异性抗体。Puromycilated 多肽免疫荧光法检测提供新翻译的 mRNA，也可以使用共焦显微成像系统的精确地量化一般亚细胞重新分区。
因此，此方法提供了大量的实验室研究平移监管机制所涉及的过程，如神经元造粒6，，1314，相关选项15、 形态 mRNA 本地化和翻译期间发展16，17。它也非常适合于快速生物事件，如细胞迁移、 粘连或入侵，或简单地评估可能诱发平移变化5，的药物治疗期间的本地化或条块分割的翻译研究7,18.总体而言，此方法允许为本地化或控制翻译事件的可视化快速、 精确，并且具有成本效益的方式。
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Protocol
1。 Puromycilation 条件测定
注： 这种技术描述了用于评估期间 MRC 5 细胞粘附过程 5 本地化的翻译的方法。Puromycilation 可以做任何单元格中，是重要的是优化 puromycilation 条件为特定的单元格行使用，因为治疗条件是不相同的嘌呤霉素浓度和所需的每个单元格行孵育时间。若要显示这些条件如何定义，三个示例细胞株 （即， HeLa、 MRC-5 和 Huh 7） 患者的嘌呤浓度增加为不同孵育时间 ( 图 1)。
- 成长相同数字的细胞在 24 孔板在 0.5 毫升的适当完成培养基在考试前 16 h。30,000 种子 MRC 5 单元格、 50,000 HeLa 细胞或 50,000 HuH 7 细胞每口井。一定要避免超过 60-70%汇合处 (图 1A)。
- 准备 6 管的管 1.5 毫升的完整的细胞培养液中的嘌呤霉素 （0、 5、 10、 15、 20、 和 30 微克/毫升） 的浓度增加。预暖在 37 ° C
- 每一集中的嘌呤霉素介质 （准备在步骤 1.2），转让从 0.5 毫升每到 6 新管管并将放线菌酮在终浓度为 50 微克/毫升添加到所有 6 新管。预暖在 37 ° C
- 更改具有 0.5 毫升的完全培养基 （行 1 和 2） 的介质。对于第三行，添加 0.5 毫升的完整文化培养基用 50 微克/毫升的放线菌酮 ( 图 1B)。
注： 放线菌酮治疗已成为蛋白质 puromycilation，因为它能够阻止翻译伸长的最佳消极控制。因为嘌呤霉素纳入需要翻译伸长，放线菌酮治疗导致损失 puromycilated 蛋白信号 5 ， 18。 - 孵育 15 分钟在 37 ° C (5%CO 2)。
- 添加 0.5 毫升的准备步骤 1.2 到第二行中以获得最终浓度 0，2.5，5，7.5，10 和 15 微克/毫升，分别列 A、 B、 C、 D、 E 和 F.嘌呤霉素介质同时，添加 0.5 毫升的嘌呤霉素放线菌酮补充介质 （步骤 1.3） 在第三行 ( 图 1)。
- 孵育 5 分钟在 37 ° C (5%CO 2)。
- 添加 0.5 毫升的嘌呤霉素介质制备步骤 1.2 到第一行中获得最终浓度 0.0，2.5，5，7.5，10 和 15 微克/毫升 ( 图 1)。
- 孵育 5 分钟在 37 ° C (5%CO 2)。
- 洗每好从行 1 至 3 与 1 毫升的冰冷 1 X 磷酸盐缓冲液 (PBS) 5 分钟后加入的嘌呤霉素对井的第一行 （洗两次）。添加 1 X Laemmli 缓冲区的 75 微升 (4%十二烷基硫酸钠 (SDS)、 2-巯基乙醇 4%、 0.120 M 三 HCl pH 6.8，0.004%溴酚蓝和 10%的甘油) 来获得对每个条件的全细胞裂解液。
- 运行 10 %sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 使用 1/3 的制备好的样品，以评估嘌呤霉素纳入。
- 确定的嘌呤霉素纳入由印迹分析使用反嘌呤霉素抗体 (12 D 10) 稀释比率为 1: 25000 在原发性抗体孵化缓冲区 （2%牛血清白蛋白 (BSA)）、 430 毫米氯化钠、 10 毫米三 pH 7.4 和 0.01%的水平叠氮化钠）。
注： 对应于不同的单元格行提取物在步骤 1 中所述的代表图像显示为 图 2 中的例子。
- 确定的嘌呤霉素纳入由印迹分析使用反嘌呤霉素抗体 (12 D 10) 稀释比率为 1: 25000 在原发性抗体孵化缓冲区 （2%牛血清白蛋白 (BSA)）、 430 毫米氯化钠、 10 毫米三 pH 7.4 和 0.01%的水平叠氮化钠）。
2。在 Cellulo本地化翻译可视化
注： 此处描述的技术被用来评估本地化的翻译内结果 MRC 5 细胞粘附过程 5 期间。虽然在这里使用 MRC 5 单元格，其他细胞系可以用同样的方法步骤 2.1 中所述。
- 细胞制备。
- 分离 MRC 5 细胞在汉克使用 0.25%胰蛋白酶/2.21 毫米乙二胺四乙酸 (EDTA) ' s 平衡盐溶液 (HBSS)。颗粒细胞在 15 毫升锥形离心管中离心 （200 x g 5 分钟），并暂停在杜尔贝科 ' s 改良鹰培养基 (DMEM) 含 10%胎牛血清 (FBS) 40,000 细胞/ml 后计数与计数室。
- 孵育的悬浮的细胞，在 37 ° C 下使用 20 分钟的管转子保持他们在悬浮液中的温柔旋转。
注意： 这一步是关键，以便粘着复合物的完整分离。 - 板 2 毫升的悬浮 MRC 5 细胞 （40,000 细胞/毫升） 在两个 35 毫米玻璃底部菜。Puromycilation 测定使用 35 毫米玻璃底部第一道菜 （请参见步骤 2.1.5） 和使用第二个作为阴性对照 （请参见步骤 2.1.6）。
- 使细胞在 37 ° C (5%CO 2) 55 分钟，以便细胞粘附和碳化硅形成。
- 添加嘌呤霉素使用浓度先前在第 1 节中定义的 35 毫米玻璃-底菜 （检测） 的载体。治疗 MRC 5 细胞，在 37 ° C (5%CO 2) 5 分钟使用 10 微克/毫升嘌呤霉素。
- 作为阴性对照，放线菌酮在第二个 35 毫米玻璃底部菜 40 分钟后添加种子细胞前对待他们的 50 微克/毫升的放线菌酮 ( 图 2B)。然后，使用相同的浓度和孵化时间与步骤 （例如， 使用 10 微克/毫升的嘌呤霉素在 37 ° C (5%CO 2) MRC 5 5 分钟） 2.1.5 培养基加嘌呤霉素放线菌酮加后 15 分钟。
- 洗两次的冰冷的 2 毫升每板 1 X PBS 和修复细胞与 1 毫升的 4%甲醛 （在 1 X PBS 稀释） 15 分钟在室温 (RT)。
注意： 多聚甲醛必须严格在使用化学罩。
- 免疫组化。
- 多聚甲醛固定后, 三次用 2 毫升的 1 X PBS 洗和在 500 µ L 的 PBS-TritonX-100 （0.5%) 孵育 20 分钟在室温下以通透细胞细胞。
- 为了防止非特异性抗体结合，阻止样品用 500 µ L PBS – 牛血清白蛋白 （1%) 室温 20 分钟
- 洗三次以 2 毫升的 PBS-Tween20 （0.1%) 和孵育 300 µ L 的稀释的抗体抗嘌呤霉素 (12 D 10) 1:12,500 在 1 X PBS 为 1 h 在室温下。
- 洗 3 次用 PBS-Tween20 （0.1%) 2 毫升和孵育的抗鼠 IgG 共轭对荧光 300 微升 (这里，488 nm) 稀释在 PBS 可视化 puromycilated 多肽与鬼笔共轭对另一种荧光 (这里，555 nm)可视化 F-肌动蛋白。孵育 1 h 室温
- 洗三次以 2 毫升的 PBS-Tween20 （0.1%)，然后孵育 5 分钟在室温下在 300 µ L 的 PBS-Tween20 （0.1%) 辅以 1 微克/毫升 4 '，6-脒-2-苯基吲哚 (DAPI)。
- 洗净用 2 毫升的 PBS-Tween20 （0.1%) 的三倍，然后用 2 毫升的 1 X PBS 清洗。通过在图像采集过程中保持 2 毫升 1 X PBS 的样品干燥防止细胞。
3。免疫荧光图像采集
注： 以下方法可用于任何商业上可用的共焦成像系统.
- 确定适当设置每个荧光定量的动态范围最大化。
注： 如果避免像素饱和度和信号阈值作适当的调整，则只可以获得代表量化。这些设置可以达到通过仔细调整激光功率，高电压 (HV)，获得，和偏移量。- 调整缩放因子 (5 X) 和像素 (512 × 512) 像素进行尺寸优化，数目。
注： 这应该是至少 2.3 倍小于光学分辨率，根据奈奎斯特定理。 - 降低扫描速度 （12.5-20 微秒/像素），使用平均 （2-3 倍） 来改善信号的信噪比根据上文所述的设置。
- 调整缩放因子 (5 X) 和像素 (512 × 512) 像素进行尺寸优化，数目。
- 手动确定适当的顶部和底部焦平面沿 z 轴与最优步长 （0.4 微米/切片）。
注： 一步大小飞机是由轴向分辨率除以 2.3，根据奈奎斯特定理确定。通常情况下，20-25 层，以覆盖整个单元厚度的贴壁细胞。 - 获得 60 X 计划载脂蛋白油浸物镜 （1.42 数值孔径） 整个单一单元共聚焦显微图像。
4。免疫荧光图像量化
- 富集测定。
- 打开一个图像对应于 z 平面层的兴趣从获取单元格数据文件使用 ImageJ 软件 （可用的免费软件在 http://fiji.sc）。
- 使用绘制直线线条绘图工具 (工具条 → 直) 通过量化那里所需的单元格区域。通过双击修改线宽 " 直; " 强度平均值通过 （在 图 3 中的 8 处设置） 线条的宽度。
注： 一些细线条首选，避免了不同结构的信号重叠。 - 后正确地设置的线，配置文件确定轴信号密度 (菜单栏 → 分析 → 绘制剖面)。
注意： 打开一个新窗口将会显示配置文件对应于每个像素所选通道 （具体荧光） 的信号强度为所选的 z 平面节线沿线。- 重复的过程对于每个通道对应使用的荧光 （即， 一个量化为 488，一个用于 568，，一个为 405）。
注： 信号强度值将总是订购后绘制的线条的方向。
- 重复的过程对于每个通道对应使用的荧光 （即， 一个量化为 488，一个用于 568，，一个为 405）。
- 获得的数值对应于追求量化的选定 z 平面层的配置文件中每个像素灰度值，复制配置文件数据 (在图像窗口中的菜单栏 → 副本) 并将其粘贴在任何电子表格软件。 重复步骤
- 4.1.1-4.1.4 获取的共聚焦图像的每个 z 平面部分和每个通道在哪里需要量化。
注： 可以汇集不同 z 平面层的量化，通过计算每个 z 平面层线沿线的每个像素的总和价值获得特别富集的信号的一般评估。如果绘制的线条是平均的值中包含每个 z 平面层相同，只可以实现这种类型的池。 - 作为全细胞定量化不同的渠道，与多层数的一种替代方法，使用的宏，称为 StackprofileData （见 补充文件）。
注： 此宏是可以自由地在 https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt，可以使用如下：- 粘贴到一个文本文件中的宏并保存它。
- 打开的图像文件，包括所有细胞的共焦层。
- 画一条线，如步骤 4.1.2 所述，打开一个新的窗口，要导入的宏 (菜单栏 → 插件 → 宏 → 运行)，选择对应的 StackprofileData 宏，以前保存的文本文件，然后单击 " 打开 "
注： 以下宏输入一个新的窗口命名 " 结果 " 将打开，所有的量化确定轴将列出每个 z 平面层和通道中的图像文件。 - 将为每个通道的数据复制 (菜单栏 → 编辑 → 副本) 来得到对应信号量化图形化的形象代表。将其粘贴到任何电子表格软件。计算每个 z 平面层线沿线的每个像素的每个通道的总和值。使用这些值来创建图形表示一个与 图 3 给出了相似。
- 量化信号在指定的细胞面积或体积。
- 用 ImageJ 软件打开图像文件。
- 绘制面积来表示使用几何形状函数的感兴趣的领域 (工具条 → " 矩形，" " 椭圆形，" 或 " 多边形 ")。
注： 量化值将确定为对应于绘制窗体区域。 - 调整要避免任何背景信号的阈值级别 (菜单栏 → 图像调整 → 阈值); 一个新的窗口将显示表示像素亮度直方图形式。更改要包括排除使用滑块进行量化处理像素的值。选择一个阈值，消除了红色像素以外的细胞，如以红色突出显示的像素将列入量化。
- 定义量化像素信号内所选的区域，没有背景信号的测量参数 (菜单栏 → 分析 → 设置测量)，并请务必检查 " 阈值限制 " 和 " 集成密度" 框。
- 测量所选区域的定量值 (菜单栏 → 分析 → 措施)。
注意： 信号强度量化将显示在一个新的窗口下 " IntDen " 鉴定，表示产品的平均灰度值和所选区域内的像素数目。 - 绘制包括使用一个几何形式的整个单元格区域 (工具条 → " 矩形，" " 椭圆形，" 或 " 多边形 ") 并着手步骤 4.2.3-4.2.5 以获得与总信号对应的值。计算所选区域内信号的比值对整个信号获取感兴趣的领域内信号 %。
- 重复步骤 4.2.2-4.2.6 以获得每个 z 平面的细胞体积的量化。根据需要进行调整的几何形式。
- 复制/粘贴数据源自 " 结果 " windows 为每个 z 平面层到电子表格，图形化的描述，找到均值。
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Representative Results
要准确地观察使用嘌呤霉素纳入翻译事件，它关键是确定每个单元格的行的最佳条件，因为每个显示11，不同嘌呤霉素纳入动力学 (图 1)9 ，，1218。因此，若要验证嘌呤霉素纳入，有必要治疗所需单元格行与标准谱的嘌呤浓度增加 （1.0、 2.5、 5.0、 7.5、 10.0 和 15.0 微克/毫升） 为不同的时间段 （5 至 10 分钟）。为了评估本地化的翻译或药物治疗的早期响应，较短的孵化时间是首选 （例如，不超过 5 分钟），因为它允许直接具体的治疗后的平移事件的直接评价。理想情况下，嘌呤霉素信号应该是容易探测到，但也应该避免饱和点 (图 2)。如图 2 （左面板） 所示，可接受嘌呤霉素浓度是 7.5-10.0 微克/毫升 MRC 5 和 HeLa，而 5.0-7.5 微克/毫升的嘌呤霉素建议哈 7。实验参数的优化是起始的至关重要的因为此方法的目标是起始的不能完全抑制时刻的所有平移伸长，而是起始的标记新合成的多肽链在翻译检测急性期间在翻译中的变化。在议定书 》 这一初始阶段不应被忽视，如过多的嘌呤霉素可用性和延长的治疗时间会造成重大的不良的后果。在图 2 （右面板） 中指出，细胞治疗 10 分钟与高嘌呤霉素浓度将生成主要是小 puromycilated 多肽 （例如，哈 7，7.5 微克/毫升或更多 10 分钟）。这些较小的多肽将更迅速地弥漫在单元格中，可能会干扰准确地评估亚细胞定位。另一个问题是，增加蛋白质降解发生后过多嘌呤霉素治疗19。这一结果光镜下治疗了 10 分钟，表明信号强度下降在 10 或 15 微克/毫升的嘌呤霉素的 MRC 5 和 HeLa 细胞。这些现象都是误导如果嘌呤霉素法团由评估免疫荧光因为增加的扩散阻止翻译本地化的准确可视化而大大降低了嘌呤霉素诱导的退化检测灵敏度。这些有害的后果也很容易避免通过正确定义优化的实验条件下，如议定书 》第 1 条所述。
虽然可视化嘌呤霉素纳入，它也是重要的是执行适当的控制。如图 3A所示，可以加 50 微克/毫升放线菌酮，一种化合物被称为抑制翻译伸长率20和因而嘌呤霉素法团能够有效地阻断嘌呤霉素纳入。这种行为如图 3B，这表明，放线菌酮治疗有效预防大部分的对应嘌呤霉素列入 MRC 5 贴壁细胞的信号所示。事实上，虽然 puromycilated 多肽可以在细胞治疗嘌呤霉素只可视化，也收治与放线菌酮在相同的染色条件下的细胞中检测到微弱的信号。另外，另一种抗生素 （茴香） 也可以使用作为阴性对照，因为它有能力阻止肽转移酶活动5 ，已被证明是尽可能高效地阻断嘌呤霉素纳入5 放线菌酮 ，18
免疫荧光图像采集之后, 有可能评估一般本地化的 puromycilated 多肽对应新合成蛋白质 (图 4)。图像图层被选定在不同深度的贴壁细胞，允许信号强度在亚细胞的车厢，以评估在不同的单元格平面内。这样，就可以比较本地化的 puromycilation 反应底部的单元格 (图 4A)，中间的单元格 (图 4B) 或顶部的单元格 (图 4)。位于稍新生和日趋成熟的黏附结构之上，结果大多是观察到在该单元格中。不出所料，激烈的 puromycilation 被检测结果，这表明 mRNA 翻译独立于这些亚细胞结构。正如前面提到的它是可能比较信号强度沿所需的轴。这种比较是唯一可能如果获取的图像不包括饱和的像素，显示为红色的灰度图像 （从顶部的第二个面板） 获得使用显微镜操作软件。这些图像可以导入到 ImageJ 的像素强度沿指定轴定量和分析软件。可以以图形方式表示的像素量化 （中间面板），说明在指定位置沿轴相对像素强度。仔细看看在上面的面板中插入显示碳化硅-肌动蛋白边界 （在红色） 和一个绿色信号对应于高度活跃的翻译事件，在这些结构 （底部） 内丰富的结构内。虽然这种量化方法不是最好的方法来确定总的翻译在这些结构中发生的确切百分比，可视化信息通过允许快速评定的信号强度，是一个好的近似的信号分布整个单元格。
若要获取整个全细胞信号数量分布，应使用另一种方法。如图 5所示，关键的步骤之一是表示感兴趣，需要为每个 z 平面构成的共聚焦图像文件量化的领域。可以使用不同的绘图工具，在 ImageJ 中找到实现这项任务。使用这种方法，它是可以量化单个区域或多个区域，可然后相比，减去，或甚至编译。面临的主要困难是: （i） 查找最佳成像条件，避免像素饱和度和背景信号可能会歪曲获得信号的定量值，并 （ii） 在 ImageJ 建立的阈值优化校准。假设这两个条件是最优的这种量化方法是高度重复性却仍能容易地执行。在图像采集系统，它也是重要的是仔细确定上下限的 z 平面的定量选择的单元格。在图 4中的案例，底部对应于分辨率极限的目的，其中往往包括污染那转瞬即逝的荧光，可以减少 SIC/细胞体信号比。如前文所述，结果参与粘连网站形成和成熟;因此，碳化硅结构位于略高于新形成粘附复合物，它从最底层的层排除那转瞬即逝的荧光。因此，SIC 绑定 puromycilation 信号是在底部的部分，勉强可见的而我们可以清楚地 obs话好讲它在中间部分，解释 SIC/细胞体的增加的比信号的下限或上限飞机相比的中间地带。
图 1。第 1 节所述的嘌呤霉素治疗优化实验表示形式。
（A)细胞植入实验 （步骤 1.1） 24 井表示。(B)的步骤 1.4 1 和 2 的 24 孔板和放线菌酮 (CHX) 的第三排的终浓度为 50 微克/毫升每口井的加法的行中显示介质的变化示意图。(C)在第二和第三行 （步骤 1.6） 嘌呤霉素治疗的示意图步骤 1.4 之后 15 分钟。(D)示意图 （步 1.8） 第一行中的嘌呤霉素治疗后步 1.6 5 分钟。请点击这里查看此图的大版本。
图 2。嘌呤霉素注册的最优条件的测定。
全细胞免疫印迹分析提取(A)MRC-5，Huh-7 (B)和(C) HeLa 细胞孵育与嘌呤浓度增加 （0、 2.5，5，7.5，10 和 15 微克/毫升） （左面板） 5 分钟或 10 分钟 （右一段面板）。Puromycilated 多肽检测使用抗体嘌呤霉素。请点击这里查看此图的大版本。
图 3。Puromycilation 利用放线菌酮的抑制作用。
（A)印迹上 5 分钟 puromycilation 测定显示放线菌酮的疗效。MRC-5，纳入效率啊-7 和 HeLa 细胞后模拟 (PBS 1 X) 或放线菌酮治疗。(B)共聚焦图像效果放线菌酮对嘌呤霉素纳入。MRC 5 细胞预处理与 PBS （模拟） 或放线菌酮为 15 分钟，然后辅以 10 微克/毫升的嘌呤霉素 + PBS 1 X （左面板） 或 10 微克/毫升的嘌呤霉素 + 50 微克/毫升的放线菌酮 （右面板） 5 分钟 Puromycilated 蛋白进行检测使用抗体嘌呤霉素 （绿色）。F-肌动蛋白检测到使用鬼笔 （红色） 和细胞核染色 DAPI （蓝色）。在右侧插入对应一个 2.5 x 放大的白色的盒子。酒吧 = 10 μ m。请点击这里查看此图的大版本。
图 4。量化的结果在 MRC 5 贴壁细胞中的翻译活动。
(A C)代表共聚焦图像的 MRC 5 贴壁细胞治疗 10 微克/毫升嘌呤为 5 分钟。提出了一种图像对应的底部(A)、 (B)的中间和上部(C)部分的单元格。上游面板显示检测到使用一种抗体对抗嘌呤霉素 （绿色） 的 puromycilated 蛋白。F-肌动蛋白检测到使用鬼笔 （红色） 和细胞核染色 DAPI （蓝色）。在右侧插入对应的白色框 2 x 放大。酒吧 = 10 μ m。中间的面板显示没有饱和的像素，会被以红色突出显示。较低的面板的 puromycilated 蛋白富集的图形表示形式在粘附 MRC 5 单元格中显示通过比较嘌呤霉素 （绿色），F-肌动蛋白的信号强度 （红色），和 DAPI （蓝色） 沿细胞轴白色箭头所示。(D) F提出了一种图像对应于4.4 x 放大插入的结果提出了 (A C)。量化显示 SIC 边界 (红峰： 肌动蛋白)，以及在结果内的本地化翻译 (绿色山峰： 嘌呤霉素) 中最低(D)、 (E)，中间和上层的(F)区域的单元格。请点击这里查看此图的大版本。
图 5。全细胞信号量化的 MRC 5 贴壁细胞中 puromycilated 蛋白。
（A)测定不同区域底部 z 平面层的 MRC 5 细胞内的信号。（左的面板）覆盖全部要获得对应此 z 平面层的总细胞信号量化值的单元格区域 (I) 的选择。（中间面板）细胞核和细胞质的部分不包含 SIC (II) 所对应的细胞区域选择。（右侧面板）可视化的相应结果 (III) 从区域二从获取整个单元格的值获取的值中减去该地区 (地区我)。酒吧 = 10 μ m。(B)每个区域的定量像素值表中列出描绘区域中的选定内容 (A)，其次是显示比例 （%） 图的图像信号在结果。发现的（C)在不同领域的中期 z 平面层的 MRC 5 细胞内信号测定。（左的面板）覆盖全部要获得对应此 z 平面层的总细胞信号量化值的单元格区域 (I) 选择。（中间面板）细胞核和细胞质的部分不包含 SIC (II) 所对应的单元格区域的选择。（右侧面板）区区二从获取整个单元格的值获取的值中减去相应的结果 (III) 可视化 (地区我)。(D)每个区域的定量像素值表中列出描绘地区中的选定内容 (C)，其次是显示比例 （%） 图的图像的发现结果。的信号（E) z 平面上层的 MRC 5 细胞的不同区域内信号测定。（左的面板）覆盖全部要获得对应此 z 平面层的总细胞信号量化值的单元格区域 (I) 选择。(中间面板） 的细胞核和细胞质的部分，并不对应的单元格区域的选择包括结果 (II)。（右侧面板）区区二从获取整个单元格的值获取的值中减去相应的结果 (III) 可视化 (地区我)。(F)每个区域的定量像素值表中列出描绘区域中的选定内容 (E)，其次是显示比例 （%） 图的图像的发现结果。的信号（G)量化值为所有 z 平面层从上面给出的单元格，其中包括计算 z 飞机载 A (z = 1)，C (z = 9)，和 E (z = 19)，其中突出显示为红色的桌子上。(H)的信号在结果遍布整个细胞体积的百分比的图形表示形式。请点击这里查看此图的大版本。
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Discussion
最近的技术进步有允许参与平移上调机制更好地理解或对特定基因的生物学过程，如神经元的发育、 药物反应和转移的镇压。这里所述的符合成本效益方法允许翻译事件在细胞研究 RNA 结合蛋白是如何调节等细胞黏附、 迁移和侵袭转移过程可视化。
虽然已发展了许多方法来评估de novo蛋白质翻译，他们都共享相同的策略，拉长多肽包含标记与检出的基团修饰的氨基酸。第一种方法依赖于35S 法标记放射同位素精氨酸纳入新翻译的蛋白质。虽然它是有效的比较一般差饷的翻译在特定条件下，放射性标记氨基酸利用这种方法对大部分研究团队没有吸引力。因此，小说发展的方法使用非放射性的标签，如日落，点击它或诡计的办法，提供新的机会，来评估和观察体内翻译事件。虽然巧妙，但这些方法大多数只允许翻译事件后评定药物治疗或特定的细胞活动，使用特定的外源基因构建的具体目标，限制实验对已经确认的目标.这是如此伎俩方法4，允许单个外源性 mRNA 目标平移规范加以评估。虽然它允许平移激活内源性基因的验证，AHA 纳入"点击它"方法最小的孵化时间是至少 1 h13，考虑太久的最为严重的翻译机制。
虽然高度功能多样，易于设置，这里介绍的方法需要的关键步骤应遵循在议定书 》 的初始阶段。代表性的结果所示，不同的细胞株会有不同嘌呤霉素纳入动力学，可能只是因为每个单元格行，似乎就是为 MRC 5 细胞5，21例的代谢率。事实上，非转化细胞作为 HeLa，如增殖并不因此，蛋白质大规模更新是比不那么稳健在转化细胞。这应该考虑到，当使用协议。因此，议定书 》 的第一部分是方法的关键的其余部分。仔细确定的嘌呤霉素浓度和孵化的长度将允许更好地评估试验过程中发生的翻译。如上文所述，过多的嘌呤霉素治疗增加小 puromycilated 多肽比和似乎能刺激骨骼肌蛋白质分解，很容易导致误解的通常发生平移事件19.作为一个经验法则，孵化时间越长，少嘌呤霉素被需要，而较短的孵化时间需要嘌呤霉素浓度较高。在浓度可以适应特定实验的局限性。
这里介绍的方法适应能力很强，可以方便地修改根据应用的处理或生物过程进行了研究。嘌呤霉素纳入允许翻译动力学变化在短时间内，快速评估而量化方法提供丰富影像的细胞活动。虽然强大，但这些方法有局限性，必须考虑。嘌呤霉素将纳入新从积极翻译的所有基因合成的蛋白质。为此，这里介绍的 puromycilation 方法可能不适合研究特定目标 （即单个基因），但它是理想获得单个细胞或细胞群内的翻译活动的一般概述。如上文所述，过多的嘌呤霉素具有主要的缺点，和嘌呤霉素剂量和治疗时间应仔细定义，在议定书 》 的建议。事实上，如图 2所示，过多的嘌呤可用性将导致更迅速地弥漫在单元格中，导致不准确的亚细胞定位数据的较小的 puromycilated 多肽的形成。此外，增加蛋白质降解是已知发生后过多嘌呤霉素治疗19，效果可能会导致信号完全丧失。
虽然不尽可能具体单击它或技巧方法，在这里提出的办法是高度可访问，并允许翻译动力学的一般变化快速评估。即使其他方法更适合特定的应用程序，可以作为补充的控制执行嘌呤霉素纳入检测。事实上，如果实验需要显示特定的 mRNA 目标是唯一一个在特定的条件影响，就必须表明，这不引起翻译普遍增加。因此，负嘌呤霉素纳入可以提供证据对于这种情况。此外，此方法非常适于观察翻译费率的一般变化。因此，可以用显示翻译镇压机制，如应力颗粒形成9，或来验证是否有效地阻止中平移复杂分馏，初始阶段使用的放线菌酮治疗伸长率22。它也是荧光的重要的是荧光的提及，虽然在 2.3 和 2.4 节中所述的量化方法涉及重点嘌呤霉素染色的实验，他们可适用于任何类型的划分染色使用各种类型。事实上，这些量化的方法可以用来量化的分子或蛋白质的细胞分布和甚至可以验证目标定位的在一个特定的亚细胞隔间。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
我们感谢这份手稿的批判性解读博士 Rachid Mazroui （拉瓦尔大学、 加拿大魁北克省）。我们感谢它们的技术援助研究中心细胞成像单元。M.法国霍是全宗德初中 1 研究学者研究杜魁北克-健康 (FRQ S)。这项工作被支持由加拿大卫生研究院 （授权号卫生研究院，拖把 286437 到 M.É。霍）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
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