Summary
Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.
Abstract
MRNA çeviri düzenleyen mekanizmalar mikrop çizgi geliştirme, hücre farklılaşma ve organogenesis, gibi çeşitli biyolojik süreçlerin yanı sıra birden çok hastalıklar söz konusu. Çok sayıda yayın inandırıcı belirli mekanizmaları sıkıca mRNA çeviri düzenleyici göstermiştir. Çeviri kaynaklı protein ifade Yönetmeliği artan ilgi çalışma ve de novo protein sentezi cellulo içindetakip roman yöntemleri gelişmesine neden olmuştur. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı yapım onları ve kez okudu olabilir mRNA hedef sayısını sınırlama, karmaşıktır. Bu makale yalnızca temel reaktifler ve ölçmek ve herhangi bir hücre satırında çeşitli koşullarda oluşan değişiklikleri mRNA çeviri görselleştirmek için bir confocal floresan görüntüleme sistemi gerektirir bir yöntem öneriyor. Bu yöntem son zamanlarda zaman böylece biyolojik çeşitli sırasında kısa bir süre için de novo çeviri görselleştirme imkanı sunan, kısa bir süre içinde yapışık hücreleri hücre altı yapıları yerelleştirilmiş çevirisini göstermek için kullanılan işlemler veya değişiklik translasyonel faaliyet belirli uyaranlara yanıt olarak doğrulanması.
Introduction
Farklı hücresel işlevler tarafından çeviri Yönetmeliği yeni araçlar ve mRNA çeviri ve düzenlenmiş protein sentezi1,2 hücre altı lokalizasyonu belirlemek için yöntemler geliştirmek için birçok araştırma ekipleri yol açtı ,3,4. Bu son teknolojik gelişmeleri içeren çeviri upregulation veya belirli mRNA'ların baskı nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz5 gibi biyolojik süreçler sırasında mekanizmaları gelişmiş bir anlayış için izin ver ,6,7,8. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı veya tehlikeli Kimyasalları ve çoğu laboratuvarları kullanılabilir olmayabilir belirli donanımları gerektirir. Bu nedenle, özellikle bu olası sorunları aşmak için çeviri olaylar hızlı değerlendirmesi için izin vermek için uygun maliyetli bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem belirli hücresel süreçler sırasında ortaya çıkan akut translasyonel modülasyon algılar ve ayrıca confocal mikroskobu kullanarak Çeviri Yerelleştirme için sağlar.
Yöntem tanımlamak burada yerelleştirilmiş çeviri Yayilim başlatma merkezleri (SIC)5denilen hücre altı bölmeleri içinde izlemek için kullanılmıştır. SICs yeni doğmakta olan yapışma kompleksleri üzerine yerelleştirilmiş numaralı seribaşı hücrelerde bulunan geçici yapılar vardır. SICs ve yapışma kompleksler farklı olmakla birlikte, onların kaderi yakından bağlantılıdır. Gerçekten de, SICs giderek odak yapışma karmaşık olgunlaşma bir yapışma siteye yapışma başlangıç aşamasında ortadan olduğu bilinmektedir. Bulduk RNA bağlanıcı proteinler özellikle mRNA çeviri (Örneğin, Sam68, FMRP ve G3BP1) kontrol etmek için bilinen ve RNA'ların bunlar içinde zenginleştirilmiş poliadenile yapıları5. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, SIC ilişkili mRNA çeviri bir denetim noktası olanak verecek şekilde davranır düzenlenmesi hücre adezyon birleştirilecek hücreler seribaşı gösterdi. Bu yöntemi, puromisindir birleşme göre yüzey çeviri tahlil (SunSET) algılama adapte bir sürüm düşünülebilir. Aslında sigara radioactively etiketli bir amino asit kullanarak küresel protein sentezi oranları ölçmek için geliştirilmiş, protein puromycilation de novo protein sentezi9görselleştirmek için etkili bir yol sunar. Bu yöntem puromisindir, çeviri erken zinciri fesih ribozom10üzerinden engeller bir antibiyotik iç davranışını kullanır. Gerçekten de, puromisindir yapısal olarak tyrosyl-tRNA, peptid zincirleri bir peptit bağı oluşumu ile elongating içine şirketler için sağlar benzerdir. Ancak, puromisindir bağlama büyüyen bir peptit zincirine yeni bir peptit bağı puromisindir tRNA içinde bulunan hydrolysable ester bağı yerine hydrolysable Amid bağı olduğundan sonraki aminoasil tRNA ile oluşturulmaktadır engeller. Böylece, erken sürümü ile aktif olarak çevrilmiş mRNA9,11' e,12 karşılık gelen çok sayıda kesilmiş puromycilated polipeptitler polipeptitler elongating içine puromisindir birleşmesiyle sonuçları .
Bu yöntemi kullanarak, kısa sürede dul içinde aktif çeviri değerlendirmek mümkün (Örneğin, 5 min) hücresel yapışma antibiyotik ile 5 dk süre takviye hücrelerde puromisindir karşı spesifik bir antikor kullanarak sırasında hücre adezyon sırasında farklı zaman noktalarda5işlem. Çok özel antikorlar karşı puromycilated yan yönettiği bu tahlil duyarlığını güvenmektedir. Puromycilated polipeptid immünfloresan tespiti de confocal görüntüleme sistemleri kullanarak büyük bir hassasiyetle sayısal yeni çevrilmiş mRNA genel hücre altı yeniden bölümlenir sağlar.
Bu nedenle, bu yöntem çok sayıda translasyonel düzenleyici mekanizmaları nöronal granülasyon6,13,14, gibi süreçleri dahil eğitim laboratuvarları için ilgili bir seçenek sunar 15, morphogen mRNA Yerelleştirme ve çeviri sırasında geliştirme16,17. Ayrıca hızlı biyolojik olaylarda, hücre göç, yapışma veya işgal gibi veya sadece translasyonel değişiklikleri5, neden ilaç tedavileri değerlendirmek için yerelleştirilmiş veya bölümlere çeviri eğitimi için de uygun olduğu 7 , 18. genel olarak, bu yöntem, hızlı, hassas ve düşük maliyetli bir şekilde yerelleştirilmiş veya kontrollü çeviri olaylar görselleştirme için sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Puromycilation koşullar belirlenmesi
Not: Bu teknik MRC-5 hücre adezyon işlemi 5 sırasında yerelleştirilmiş çeviri değerlendirmek için kullanılan yöntemi tanımlar. Puromycilation herhangi bir hücreyi yapılabilir gibi bu tedavi koşulları açısından puromisindir konsantrasyon ve istenen her hücre satırı için özdeş değil çünkü puromycilation koşulları kullanılmak üzere belirli hücre hatları için optimize etmek önemlidir kuluçka süresi. Bu koşullar nasıl tanımlandığını göstermek için üç örnek hücre hatları (Yani, HeLa, MRC-5 ve ha-7) için farklı kuluçka süreleri puromisindir konsantrasyonları artan ile tedavi edildi ( Resim 1).
- Grow uygun 0.5 ml 24-şey plaka hücrelerde aynı sayıda kültür orta test önce 16 h tamamlayın. Tohum 30.000 MRC-5 hücre, 50.000 HeLa hücreleri veya iyi başına 50.000 ha-7 hücre. % 60-70 izdiham (şekil 1A) aşmasını önlemek emin olun.
- Puromisindir (0, 5, 10, 15, 20 ve 30 µg/mL) konsantrasyonları artan tam hücre kültür ortamının 1,5 mL ile hazırlamak 6 tüpleri. Önceden sıcak 37 ° C'de
- Puromisindir orta (hazırlanan adım 1.2), her toplama aktarmak için 0.5 mL her 6 yeni tüpler içine tüp ve sikloheksimit 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon tüm 6 yeni tüpler için ekleyin. Önceden sıcak 37 ° C'de
- Orta 0.5 mL tam kültür ortamının (satır 1 ve 2) ile değiştirin. İçin üçüncü satır, 0.5 mL 50 µg/mL ile sikloheksimit ( şekil 1B) takıma tam kültür ortamının ekleyin.
Not: Sikloheksimit tedavi için protein puromycilation çeviri uzama engellemek için onun yetenek nedeniyle en iyi negatif kontrol olarak kurulmuştur. Puromisindir birleşme çeviri uzamasını gerektirdiği için sikloheksimit tedavi puromycilated protein sinyalleri 5 , 18 bir kaybına neden. - 15dk 37 ° C'de (%5 CO 2) için kuluçkaya.
- 0,5 mL 0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL, son konsantrasyonları sırasıyla A, B, C, D, E ve F. sütunlarda elde etmek için ikinci sırada 1.2. adımda hazırlanan puromisindir orta ekleyin Aynı zamanda, üçüncü sıradaki ( şekil 1 c) sikloheksimit takıma orta (Adım 1.3) puromisindir 0.5 mL ekleyin.
- 37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kuluçkaya.
- 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL ( şekil 1 c) son konsantrasyonları elde etmek için ilk satırı 1.2. adımda hazırlanan puromisindir Orta 0.5 mL ekleyin.
- 37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kuluçkaya.
- Yıkama her de fosfat tamponlu 1-3 1 mL olan satırları buz gibi 1 X serum fizyolojik (PBS) 5 dk sonra eklenmesi için ilk satır (iki kez yıkama) kuyu puromisindir, dan. 1 X Laemmli arabelleği 75 µL ekleyin (%4 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), % 4 2-mercaptoethanol, 0.120 M Tris HCl pH 6.8, %0,004 bromophenol mavi ve % 10 gliserol) bütün hücreli lysates her koşul için elde etmek için.
- Çalıştır % 10 SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) puromisindir birleşme değerlendirmek için 1/3 hazır örnekleri kullanarak.
- Belirleme birincil antikor kuluçka arabellek (%2 sığır serum albumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 ve %0.01 1:25,000 oranında sulandırılmış bir anti-puromisindir antikor (12 D 10) kullanarak Western blot analizi tarafından puromisindir şirketleşme düzeyi Sodyum azid).
Not: Resim 2 örnek olarak temsili Resim 1. adımda açıklandığı gibi yapılan farklı hücre satırı özleri karşılık gelen gösterilir.
- Belirleme birincil antikor kuluçka arabellek (%2 sığır serum albumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 ve %0.01 1:25,000 oranında sulandırılmış bir anti-puromisindir antikor (12 D 10) kullanarak Western blot analizi tarafından puromisindir şirketleşme düzeyi Sodyum azid).
2. Cellulo içinde Çeviri görselleştirme lokalize
Not: Burada açıklanan tekniği SICs MRC-5 hücrelerdeki içinde yerelleştirilmiş çeviri sırasında yapışma işlemi 5 değerlendirmek için kullanıldı. MRC-5 hücreleri burada kullanılmasına rağmen diğer hücre hatları 2.1. adımda açıklanan aynı metodolojisi ile kullanılabilir.
- Hücre hazırlık.
- Ayırmak MRC-5 hücrelerin % 0.25 tripsin/2.21 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) Hank kullanarak ' s dengeli tuz çözüm (HBSS). Santrifüjü (200 x g de 5 dk) 15 mL konik santrifüj tüpü içinde tarafından hücreleri cips ve onları Dulbecco içinde askıya ' s sayım odası ile sayım sonra % 10 fetal sığır serum (FBS) 40.000 hücre/mL, ile takıma modifiye kartal orta (DMEM).
- Süspansiyon korumak için bir tüp rotator 20 dk için kullanarak nazik döndürme altında 37 ° C'de askıya alınan hücreler kuluçkaya.
Not: Bu odak yapışma kompleksleri tam ayrılma için izin vermek için kritik bir adımdır. - Askıya alınmış MRC-5 (40.000 hücre/mL) hücrelerde iki 35-mm cam alt tabak tabak 2 mL. İlk 35-mm cam alt çanak puromycilation tahlil için kullanın (bkz. Adım 2.1.5) ve ikinci bir negatif kontrol kullanın (bkz. Adım 2.1.6).
- Hücreleri hücre adezyon ve SIC oluşumu için izin vermek 55 dk. 37 ° C'de (%5 CO 2) tutmak.
- Ekle puromisindir orta önceden tanımlanmış 1 bölümünde konsantrasyon kullanarak 35-mm cam alt yemekleri (tahlil). MRC-5 hücreleri tedavi etmek için 10 µg/mL puromisindir 37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kullanın.
- Bir negatif kontrol sikloheksimit ikinci 35-mm cam alt çanak 40dakika hücreleri onları önceden 50 µg/mL sikloheksimit ( şekil 2B) ile tedavi etmek için tohum sonra ekleyin. Sonra sikloheksimit ek olarak sonra 15 dk ekleyin puromisindir aynı konsantrasyonu kuluçka bu kez adım 2.1.5 (Örneğin, kullanım 10 µg/mL puromisindir 37 ° c (%5 CO 2) MRC-5 için 5 min için) gibi orta.
- Yıkama her plakalı iki kez buz gibi 2 mL 1 X PBS hücreleri ile ve 1 mL (1 X PBS içinde seyreltilmiş) % 4 formaldehit 15 dakika oda sıcaklığında (RT) düzeltin.
Dikkat: Paraformaldehyde kesinlikle kimyasal bir mahallede kullanılmalıdır.
- Immunostaining.
- Pimlerle yapılan fiksasyon ardından paraformaldehyde, yıkama ile üç kez 2 mL 1 X PBS ve PBS-TritonX-100 (% 0.5) 500 µL içinde 20 dk RT hücreleri permeabilize az için kuluçkaya.
- Spesifik olmayan antikor bağlama önlemek için 500 µL PBS ile örnek blok – BSA (% 1) için dik, 20 dk
- PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile üç kez yıkayın ve 1 X PBS RT. 1 h için anti-puromisindir antikor (12 D 10) seyreltilmiş 1:12,500 300 µL ile kuluçkaya
- Yıkama PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile 3 kez ve anti-fare IgG Birleşik bir fluorophore 300 µL ile kuluçkaya (burada, 488 nm) puromycilated polipeptitler görselleştirmek için PBS ve phalloidin Birleşik ile seyreltilmiş başka bir fluorophore için (burada, 555 nm) F-aktin görselleştirmek için. Dik, 1 h için kuluçkaya
- Yıkama PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile üç kez ve daha sonra 5 1 µg/mL ile 4 takıma min için RT, içinde 300 µL PBS-Tween20 (% 0,1), kuluçkaya ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- 2 mL PBS-Tween20 (% 0,1) ile üç kez yıkayın ve 2 mL 1 X PBS ile yıkayın. Hücreleri örnek 2 mL 1 X PBS resim alma sırasında tutarak kurumasını önlemek.
3. İmmünfloresan resim alma
Not: aşağıdaki metodoloji-ebilmek var olmak kullanılmış ile piyasada bulunan herhangi bir confocal görüntüleme sistemi.
Miktar için dinamik alanı en üst düzeye çıkarmak için- belirleme uygun ayarları için her fluorophore.
Not: Temsilcisi miktar yalnızca piksel doygunluk kaçınılması ve sinyal eşik düzgün ayarlanır elde edilebilir. Bu ayarları, dikkatle lazer gücü, yüksek voltaj, ayarlayarak elde kazanç, ve ofset.- Ayarlama yakınlaştırma faktörü (5 X) ve piksel boyutunu optimize etmek için piksel (512 x 512).
Not: Bu Nyquist teoremi göre optik çözünürlük, en azından 2,3 - kat daha küçük olmalıdır. - İnceden inceye gözden geçirmek hız (12,5-20 µs/piksel) azaltmak ve yukarıda belirtilen ayarlara göre sinyal-gürültü oranı artırmak için (2 - 3 kez) ortalama kullanın.
- Ayarlama yakınlaştırma faktörü (5 X) ve piksel boyutunu optimize etmek için piksel (512 x 512).
- El ile uygun üst belirlemek ve odak uçaklar en uygun adım boyu (0.4 µm/dilim) ile z ekseni boyunca alt.
Not: Adım boyutu uçak 2.3 tarafından bölünmüş Aksiyel çözünürlük Nyquist teoremi göre belirlenir. Genellikle 20-25 katmanları yapışık hücreleri tüm hücre derinliği karşılamak gereklidir. - Tüm bir tek hücre bir 60 X Apo planı yağı daldırma hedefi (1,42 sayısal diyafram) ile confocal bir görüntüsünü elde.
4. İmmünfloresan görüntü miktar
- zenginleştirme belirlenmesi.
- ImageJ yazılım (freeware http://fiji.sc kullanılabilir) kullanarak alınan hücre veri dosyasından faiz z-uçak katmanına karşılık gelen bir görüntüyü açmak.
- Çizgi çizme aracını kullanarak çizgi çizin (araç çubuğu → düz) nerede miktar isteniyorsa hücre bölgelerinde aracılığıyla. Üzerinde çift tıklatarak çizgi genişliğini değiştirmek " düz; " yoğunluk değerleri (8 şekil 3 ' de ayarla) çizginin genişliğini üzerinden ortalama olarak.
Not: Daha ince bir çizgi sinyal örtüşme farklı yapılardan önlemek için tercih edilir.
Yolun doğru şekilde ayarladıktan sonra - profil kararlı eksen boyunca sinyal yoğunluğu (menü çubuğu → analiz → arsa profil).
Not: Seçili z-uçak bölümü için hattı boyunca sinyal yoğunluğu (özel fluorophore) seçilen kanalın her piksel için karşılık gelen bir profili gösteren yeni bir pencere açılacaktır.- Tekrar işlem için kullanılan fluorophore karşılık gelen her kanal (Yani, bir miktar için 488, 568 ve 405 için bir tane).
Not: Sinyal yoğunluk değeri her zaman çizilmiş çizgiyi yönünü takip sıralanır.
- Tekrar işlem için kullanılan fluorophore karşılık gelen her kanal (Yani, bir miktar için 488, 568 ve 405 için bir tane).
- Gri ölçekli sayısal değerler seçili z-uçak katman quantifications için karşılık gelen profil her piksel için elde etmek için profil verileri kopyalayın (Görüntü penceresinin menü çubuğundan → kopya) ve herhangi bir elektronik tablo yazılımı yapıştırın. Confocal elde edilen görüntünün her z-uçak bölüm ve miktar istendiği nerede her kanal için
- Yinele adımları 4.1.1-4.1.4.
Not: Farklı z-uçak katmanları miktar toplam değeri her z-uçak katman hattı boyunca her pikselin hesaplayarak sinyal özel zenginleştirme genel bir değerlendirmesini elde etmek için havuza alınmış. Çizilen çizgi ortalama değerlerde dahil her z-uçak katman aynı ise bu tür havuz sadece elde edilebilir. - Farklı kanalları çok sayıda Katmanlar ile bütün hücreli miktar için alternatif bir yöntem, StackprofileData olarak adlandırılan makroyu kullanmak (bkz. Ek dosya).
Not: Bu makro https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt serbestçe erişilebilir ve aşağıdaki gibi kullanılabilir:- makro bir metin dosyasına yapıştırın ve bunu kaydedin
- Hücre confocal katmanları içerir görüntü dosyasını açın.
- Bir çizgi çizin, 4.1.2. adımda açıklandığı gibi makro almak için yeni bir pencere açın (menü çubuğu → eklentileri → makroları → çalıştırmak), StackprofileData makro karşılık gelen önceden kaydettiğiniz metin dosyasını seçin ve tıklatın " açık. "
Not: makro ithalat, yeni bir pencere adlı " sonuçları "-ecek açık ve tüm miktar kararlı eksen boyunca her z-uçak katmanı için listelenen ve resim dosyalarında mevcut kanal. - Her kanal için veri kopyala (menü çubuğu → düzenleme → kopya) sinyal quantifications karşılık gelen grafik profili temsil elde etmek için. Herhangi bir elektronik tablo yazılımı yapıştırın. Her kanal boyunca her z-uçak katmanı için yolun her piksel için toplam değerini hesaplamak. Grafik şekil 3 ' te sunulan benzer oluşturmak için bu değerleri kullanın.
- Sinyal belirlenmiş hücresel alanda veya birim miktar.
- ImageJ yazılımı ile belgili tanımlık imge eğe açık.
- Çizmek geometrik form işlevini kullanarak ilgi alanı belirtmek için bir alan (araç çubuğu → " dikdörtgen, " " oval, " veya " çokgen ").
Not: Çizilmiş forma karşılık gelen alan için miktar değeri belirlenecektir. - Herhangi bir arka plan sinyal önlemek için eşik düzeyi ayarlamak (menü çubuğu → görüntü ayarı → eşik); piksel yoğunluklarda çubuk grafik formunda temsil etmek için yeni bir pencere açılacaktır. Kaydırıcıyı kullanarak miktar piksellerindeki içerme/dışlama üzere değerleri değiştirin. Kırmızı renkte piksel miktar dahil olarak, hücre dışında kalan kırmızı pikseller ortadan kaldıran bir eşik seçin.
- Arka plan sinyal olmadan seçili alanı içinde piksel sinyal ölçmek için ölçü parametrelerini tanımlamak (menü çubuğu → analiz → ayarla ölçümleri) ve kontrol etmek emin olun " Eşik sınırı " ve " entegre yoğunluk " kutuları.
- Seçili alan için sayısal değerleri ölçmek (menü çubuğu → analiz → ölçü birimi).
Not: Sinyal şiddeti miktar-ecek sunulmak altında yeni bir pencerede " IntDen " ürün ortalama gri değerleri ve seçili alanı içinde piksel sayısını temsil eden kimlik. - Çizmek geometrik formu kullanarak hücrenin tamamını içeren bir alanı (araç çubuğu → " dikdörtgen, " " oval, " veya " çokgen ") ve toplam sinyal için karşılık gelen bir değer elde etmek için adımlar 4.2.3-4.2.5 ile devam edin. İlgi alanı içinde sinyal yüzde elde etmek için tüm sinyal üzerinde seçili alanı içinde sinyal oranını hesaplamak.
- Miktar her z-uçak için hücre hacmi elde etmek için Yinele adımları 4.2.2-4.2.6. Geometrik formu gerektiği gibi uyum.
- Kopyala/Yapıştır üzerinden elde edilen veriler " sonuçları " windows için grafik tasvir ve ortalama bir değer bulmak için bir elektronik tabloya her z-uçak katmanı için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doğru bir şekilde puromisindir birleşme kullanarak çeviri olayları gözlemlemek için her farklı puromisindir birleşme Kinetik (şekil 1)9,11 gösterir çünkü her hücre satırı için en uygun koşulları belirlemek için önemlidir ,12,18. Bu nedenle, puromisindir birleşme doğrulamak için istenen hücre kültürünü puromisindir konsantrasyonları artan standartlaştırılmış bir spektrum ile tedavi etmek gerekli olduğunu (1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10,0 ve 15,0 µg/mL) farklı süreler (5 ve 10 dk) için. Yerelleştirilmiş çeviri veya ilaç tedavisi için erken bir tepki değerlendirmek için bir kısa kuluçka zamanı tercih (Örneğin, daha az 5 dk), gibi doğrudan belirli bir tedavi aşağıdaki translasyonel olayları doğrudan değerlendirme için sağlar. İdeal olarak, puromisindir sinyal kolayca detectable olmalı ama aynı zamanda doygunluk noktasına (Şekil 2) kaçınmalısınız. 5.0-7,5 µg/mL puromisindir ha-7 için önerilmektedir, ancak Şekil 2 ' de (sol kapı aynası) gösterildiği gibi bir kabul edilebilir puromisindir 7,5-10,0 µg/mL MRC-5 ve HeLa, bölgedir. Bu yöntem tamamen inisiyasyon şu anda tüm translasyonel uzama inhibe değil ama yeni synthetized polipeptid zincirleri çeviri sırasında akut algılamak için etiketlemek için hedeftir çünkü deneysel parametreleri duruma getirilmesi önemlidir Çeviri değişimler. Protokol ilk bu aşamada ihmal edilen, gibi aşırı puromisindir durumu olmamalı ve genişletilmiş tedavi süresi önemli istenmeyen sonuçlara neden. Şekil 2 ' de (doğru panelleri) gibi yüksek puromisindir konsantrasyon ile 10 min için tedavi hücreleri çoğunlukla daha küçük puromycilated polipeptitler (Örneğin, ha-7, 7.5 µg/mL veya daha fazla 10 dk) oluşturur. Bu küçük polipeptitler daha hızlı hücre altı yerelleştirme doğru bir şekilde değerlendirilmesi ile etkileşebilir hücredeki yaygın. Başka bir sorundur bu artan proteolizis aşırı puromisindir tedavi19oluşur. Bu sonuç düşük sinyal şiddeti 10 ya da 15 µg/mL puromisindir huzurunda gösterdi 10 min için tedavi MRC-5 ve HeLa hücreleri gözlendi. Bu olayların her ikisi de yanıltıcı ise artmış Difüzyon Çeviri Yerelleştirme, doğru görselleştirme engellediğinden puromisindir kaynaklı bozulması büyük ölçüde azaltır, ancak puromisindir birleşme ayirt tarafından değerlendirilir algılama hassasiyeti. Bu istenmeyen sonuçları kolayca düzgün en iyi deneysel koşullar, tanımlayarak protokolü1 bölümünde açıklandığı gibi kaçınılmalıdır.
Puromisindir birleşme görüntülenmesi sırasında ayrıca uygun denetimleri gerçekleştirmek önemlidir. Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi puromisindir birleşme verimli bir şekilde 50 µg/mL sikloheksimit, çeviri uzama20 ve böylece puromisindir birleşme etkisizleştirmek için bilinen bir bileşik toplama tarafından bloke edilebilir. Bu davranış sikloheksimit tedavi verimli bir şekilde puromisindir birleşme yapisan MRC-5 hücrelerde karşılık gelen sinyal çoğunu engelledi gösteren şekil 3B, gösterilir. Gerçekten de, puromycilated peptidler sadece puromisindir ile tedavi hücrelerdeki görüntülenmeyecektir ise de aynı boyama koşullar altında sikloheksimit ile tedavi edilen hücreleri sinyali zayıf algılanır. Bu peptit transferaz etkinlik5 engelleme yeteneği ve sikloheksimit puromisindir birleşme5 engelleme, olabildiğince verimli olduğu gösterilmiştir gibi alternatif olarak, başka bir antibiyotik (anisomycin) de bir negatif kontrol kullanılabilir ,18
İmmünfloresan resim alma, puromycilated polipeptitler yeni synthetized proteinler (şekil 4) karşılık gelen genel lokalizasyonu değerlendirmek mümkündür. Görüntü katmanlarının farklı hücre uçak değerlendirilmek için hücre altı bölmeleri sinyal şiddeti sağlayan yapışık hücreleri içinde farklı derinliklerde seçilir. Bu nedenle, yerelleştirilmiş puromycilation reaksiyon (şekil 4A), orta (şekil 4B) hücrenin veya (şekil 4 c) hücrenin üstüne hücreyi alt karşılaştırmak mümkündür. SICs biraz doğmakta olan ve maturating yapışma yapıları yer alan, hücrenin ortasında çoğunlukla gözlenir. Beklendiği gibi yoğun puromycilation SICs, mRNA çeviri için bu hücre altı yapıları izole olduğunu düşündüren algılanır. Daha önce de belirtildiği gibi istenen bir eksen boyunca sinyal şiddeti karşılaştırmak mümkündür. Alınan görüntüleri gri tonlamalı resimdeki kırmızı görünür doymuş piksel dahil etmezseniz bu karşılaştırma yalnızca mümkündür (üstten ikinci panelleri) elde yazılımı çalışan mikroskop kullanarak. Bu görüntüleri miktar ve belirlenmiş bir eksen boyunca piksel yoğunluğu analizini ImageJ yazılımı içine alınabilir. Pixel miktar grafik olarak temsil edilebilir (orta Masası göreli piksel yoğunluğu belirlenen konumlarda eksen boyunca göstermek için). Üst panelleri INSERT daha yakından bakmak SIC-aktin sınırları (kırmızılı) ve bu yapılar (alt bölüm) içinde zenginleştirilmiş son derece aktif çeviri olaylara karşılık gelen yapı yeşil sinyal gösterir. Bu miktar yöntemi bu yapılar içinde meydana gelen toplam çeviri tam yüzdesini belirlemek için en iyi yolu olmasa da, bu hızlı sinyal şiddeti değerlendirilmesi için izin vererek görsel olarak bilgilendirici ve iyi bir yaklaşım hücre boyunca sinyal dağıtım.
Bütün hücre boyunca sinyal nicel bir dağılım elde etmek için başka bir yöntemi kullanılmalıdır. Şekil 5' te gösterildiği gibi önemli adımlar confocal görüntü dosyaları oluşturma her z-uçak için sayısal gerek ilgi alanları belirtmek için biridir. Bu atama ImageJ içinde bulunan farklı bir çizim aracı kullanılarak elde edilebilir. Bu yöntemi kullanarak, tek bir alana veya birden çok alanı, daha sonra karşılaştırıldığında, düşülen, veya bile derlenmiş ölçmek mümkündür. Ana zorluklar vardır: (i) bul optimum görüntüleme koşulları önlemek piksel doygunluk ve arka plan sinyal, elde edilen sinyal nicel değeri yanlış, ve kurmak (II) en uygun eşik kalibrasyonu ImageJ içinde. Bu koşulların her ikisi de en iyi olduğu varsayılırsa, bu miktar hala gerçekleştirmek kolay kalan son derece tekrarlanabilir yöntemidir. Resim alma önce dikkatle z-uçak miktar için seçili hücrenin alt ve üst sınırlarını belirlemek önemlidir. Şekil 4' de olması durumunda, alt bölümde genellikle SIC/hücre vücut sinyal oranı azaltabilir fani Floresans kirletici içeren amacı, çözünürlük sınırının karşılık gelir. Daha önce bahsedilen, SICs söz konusu olursa yapışma site oluşumu ve olgunlaşma; Bu nedenle, SIC yapıları biraz yapışma kompleksleri, fani floresan en alt katmanlardan hariç yeni şekillendirme yukarıda yer alır. Böylece, SIC bağlı puromycilation sinyal açıkça obs mi ise alt bölümlerde görünür zorErve SIC/hücre vücut artış oranı açıklayan orta bölümünde sinyal için alt veya üst uçaklar karşılaştırıldığında orta bölgesinde.
Şekil 1. 1 bölümünde açıklanan puromisindir tedavi optimizasyonu deneysel gösterimi.
(A) bir 24-iyi temsil deneme (Adım 1.1) için sağlanan hücre. (B) adım 1 ve 2 24-şey plaka ve sikloheksimit (CHX) üçüncü satırında 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon için her şey için ek satırlarda orta değiştirmek gösterilen 1.4 şematik gösterimi. (C) şematik gösterim ikinci ve üçüncü satır (Adım 1.6) puromisindir tedavisinde adım 1.4 sonra 15 dak. (D) şematik gösterim (Adım 1.8) ilk satırda puromisindir tedavinin 5 dk sonra adım 1.6. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Puromisindir birleşme için optimal koşullar belirlenmesi.
Bütün hücre Western blot analizi ayıklamak (A)MRC-5, ha-7 (B) ve (C) HeLa hücreleri, inkübe puromisindir konsantrasyonları artan (0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL) bir süre 5 dk (sol kapı aynası) veya 10 dk (sağ için paneller). Puromycilated peptidler bir antikor puromisindir karşı kullanarak tespit edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Sikloheksimit kullanarak puromycilation inhibisyonu.
(A) sikloheksimit etkisi 5-dk puromycilation tahlil üzerinde gösterilen Western blot. Birleşme verimliliği MRC-5, ha-7 ve sahte (PBS 1 X) veya sikloheksimit tedavi aşağıdaki HeLa hücreleri. (B) Confocal görüntü sikloheksimit etkisini puromisindir birleşme üzerinde gösterilen. MRC-5 hücreleri PBS (sahte) veya sikloheksimit 15 dakika ile önceden tedavi ve 10 µg/mL ile puromisindir + PBS 1 X (sol panelde) takıma veya 10 µg/mL puromisindir + 50 µg/mL sikloheksimit (doğru kapı aynası) 5 dk. Puromycilated proteinler için algılandı bir antikor puromisindir (yeşil) karşı kullanıyor. F-aktin phalloidin (kırmızı) kullanarak algılandı ve çekirdek DAPI (mavi) ile lekeli. Ekler sağda beyaz kutu bir 2.5 x büyütme düzeyini karşılık gelir. Barlar 10 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Miktar SICs yapisan MRC-5 hücrelerdeki translasyonel faaliyete.
(A-C) Yapisan MRC-5 hücre temsilcisi confocal Resim 5 min için 10 µg/mL puromisindir ile tedavi. Sunulan görüntüleri alt (A), orta (B)ve hücrenin üst (C) bölümleri karşılık gelir. Üst panelleri bir antikor puromisindir (yeşil) karşı kullanarak tespit puromycilated proteinler göster. F-aktin phalloidin (kırmızı) kullanarak algılandı ve çekirdek DAPI (mavi) ile lekeli. Ekler sağda beyaz kutu bir 2 x büyütme düzeyini karşılık gelir. Barlar 10 mikron =. Orta kapı aynası kırmızı renkte doymuş piksel yokluğu göster. Alt panelleri grafik puromycilated protein zenginleştirme yapisan bir MRC-5 hücre puromisindir (yeşil), F-aktin sinyal şiddeti karşılaştırarak (kırmızı) gösterir ve DAPI (mavi) hücre eksen boyunca beyaz okla gösterilen. (D-F) Sunulan görüntüleri karşılık 4.4 x büyütme ekleme (A-C) sunulan SICs. Miktar SIC sınır gösterir (kırmızı tepeler: aktin), yanı sıra SICs içinde yerelleştirilmiş çeviri (yeşil tepeler: puromisindir) en düşük (D), (E), orta ve hücrenin üst (F) bölgeler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. Bütün hücre sinyal miktar yapisan MRC-5 hücrelerdeki puromycilated proteinlerin.
(A) alt z-uçak katmanı bir yapisan MRC-5 hücrenin farklı alanlarda içinde sinyal belirlenmesi. (Sol kapı aynası) Toplam hücresel sinyal bu z-uçak katman için karşılık gelen bir sayısal değer elde etmek için hücrenin bütünlüğü kapsayan seçim alanının (I). (Orta paneli) Çekirdek ve does değil sitoplazmik bölümü için karşılık gelen hücresel çevrenin SIC (II) içerir. (Doğru kapı aynası) Görsel olarak SICs (III) alan II tüm cep telefonu için elde edilen değer üzerinden alınan değeri çıkararak karşılık gelen alan (alan ben). Barlar 10 mikron =. (B) her alan için nicel piksel değerleri oranı (%) gösteren bir grafik tarafından takip alan seçimi (a), tasvir eden görüntü için sinyal SICs. bulundu listelenen tablo (C) farklı alanlarda orta z-uçak katmanı bir yapisan MRC-5 hücre içinde sinyal belirlenmesi. (Sol kapı aynası) Toplam hücresel sinyal bu z-uçak katman için karşılık gelen bir sayısal değer elde etmek için hücrenin bütünlüğü kapsayan seçim alanının (I). (Orta paneli) Çekirdek ve does değil sitoplazmik bölümü için karşılık gelen hücre alanının SIC (II) içerir. (Doğru kapı aynası) Görsel olarak SICs (III) için alan II tüm cep telefonu için elde edilen değer üzerinden alınan değeri çıkararak karşılık gelen alan (alan ben). (D) kantitatif piksel değerlerini her alan için görüntü oranı (%) gösteren bir grafik tarafından takip alan seçimi (C) olarak tasvir için SICs. bulunan sinyal listelenen tablo (E) farklı alanlarda bir yapisan MRC-5 hücre üst z-uçak tabakası içinde sinyal belirlenmesi. (Sol kapı aynası) Toplam hücre sinyal bu z-uçak katman için karşılık gelen bir sayısal değer elde etmek için hücrenin bütünlüğü kapsayan seçim alanının (I). (Orta Masası) çekirdeği ve does değil sitoplazmik bölümü için karşılık gelen hücre alan seçim SICs (II) içerir. (Doğru kapı aynası) Görsel olarak SICs (III) için alan II tüm cep telefonu için elde edilen değer üzerinden alınan değeri çıkararak karşılık gelen alan (alan ben). (F) kantitatif piksel değerlerini her alan için görüntü oranı (%) gösteren bir grafik tarafından takip alan seçiminde (E), tasvir için SICs. bulunan sinyal listelenen tablo (G) da dahil olmak üzere tüm yukarıda sunulan hücreden z-uçak katmanları için miktar değerleri, hesaplanan için z-uçak A sunulan (z = 1), C (z = 9) ve E (z = 19), hangi masada Kırmızı vurgulanır. (H) tüm hücre hacmi SICs içinde bulunan sinyal yüzdesi grafik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son teknolojik gelişmeler mekanizmaları translasyonel upregulation ilgili daha iyi bir anlayış ya da nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz gibi biyolojik süreçleri içinde belirli mRNA'ların baskı için izin vermiş. Burada açıklanan düşük maliyetli metodoloji nasıl RNA bağlanıcı proteinler hücre adezyon, geçiş ve işgali gibi metastatik işlemleri düzenleyen çalışma hücrelerdeki görüntülenmeyecektir çeviri olayları sağlar.
De novo protein çeviri değerlendirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir rağmen aynı strateji elongating polipeptid değiştirilmiş amino asitler ile algılanabilir bir yan öğesini içerir, paylaşıyorlar. Bu yöntemlerden ilk 35S radiolabeled arginin birleşme yeni çevrilmiş protein içine kullanır. Belirli koşullar altında çevirinin genel oranları karşılaştırmak için verimli olmasına rağmen radiolabeled amino asitler bu yöntem çoğu araştırma ekipleri için zevksiz kullanır. Bu nedenle, roman geliştirme yöntemleri günbatımı gibi radyoaktif olmayan etiketleri kullanarak tıklayın-BT veya hile yaklaşım sunulan yeni fırsatları değerlendirmek ve in vivo çeviri olayları gözlemlemek. Her ne kadar ustaca, bu yöntemlerin çoğu sadece çeviri olayları takip değerlendirmesi için ilaç tedavisi veya belirli bir eksojen cDNA kullanarak belirli hücresel olaylar belirli hedefleri, deneyler zaten tanımlanmış hedeflere sınırlama oluşturmak izin . Bu değerlendirilmek için tek bir exogenously ifade mRNA hedef translasyonel düzenlenmesi için sağlayan dolabı yaklaşım4için doğrudur. Endojen mRNA'ların translasyonel aktivasyonu doğrulamak için sağlar, "Click-IT" yöntemi en az kuluçka süresi AHA birleşme için çok uzun en akut çeviri mekanizmaları için kabul edilen en az 1 s13, olsa da.
Son derece çok yönlü ve kurulumu kolay olmakla birlikte, burada açıklanan yöntemi kritik adımlar Protokolü'nün ilk aşamasında uyulması gerektirir. Temsilcisi sonuçlarında gösterilen, farklı hücre hatları sadece durum MRC-5 hücreleri5,21gibi görünüyor gibi her hücre kültürünü metabolizma hızı nedeniyle olabilir farklı puromisindir birleşme Kinetik olacaktır. Gerçekten de, Sigara dönüştürülmüş hücreler HeLa proliferatif değildir ve bu nedenle, protein toplu yenileme dönüştürülmüş hücrelerinde daha az daha güçlü. Bu iletişim kuralı kullanıldığında dikkate alınmalıdır. Buna göre protokol ilk bölümünü yöntemi geri kalanı için önemlidir. Dikkatle puromisindir konsantrasyonu ve kuluçka uzunluğunu belirleme deneme sırasında meydana gelen çeviri daha iyi bir değerlendirme için izin verir. Yukarıda belirtildiği gibi tedavi puromisindir aşırı miktarda küçük puromycilated polipeptitler oranını artırır ve kolayca normalde meydana gelen yanlış yorumlanmasına yol açabilecek proteolizis teşvik etmek gibi görünüyor translasyonel olaylar19 . Daha kısa bir kuluçka süresi puromisindir yoğun gerektirir, ancak kural olarak uzun kuluçka süresi daha az puromisindir, gereklidir. Konsantrasyon/saat belirli deneysel sınırlamalar için adapte edilebilir.
Burada sunulan yöntemleri son derece uyumlu ve kolayca uygulanan tedavi veya biyolojik göre değiştirilebilir işlem okudu. Miktar yöntemi hücresel olaylar son derece bilgilendirici görüntüler sunarken puromisindir birleşme hızlı değerlendirilmesi çeviri Kinetik değişimler zaman, kısa bir süre içinde sağlar. Her ne kadar güçlü, bu yöntemler dikkate alınması gereken bazı kısıtlamalara sahiptir. Puromisindir aktif olarak çevrilen tüm mRNA'ların yeni sentezlenmiş protein içine dahil edilecek. Bu nedenle, burada açıklanan puromycilation yöntemi belirli hedefleri (Yani, tek mRNA) çalışmaya uygun olmayabilir, ama tek bir hücre veya bir hücre nüfus içindeki translasyonel etkinliği genel bir bakış elde etmek idealdir. Yukarıda belirtildiği gibi aşırı puromisindir büyük sakıncaları vardır ve puromisindir dozlarda ve tedavi süreleri dikkatli bir şekilde tanımlanmasını, iletişim kuralı olarak önerilen. Gerçekten de, Şekil 2' de gösterildiği gibi aşırı puromisindir durumu lider hatalı hücre altı yerelleştirme veri için hücre içinde daha hızlı diffüz daha küçük puromycilated polipeptitler oluşumuna neden olur. Ayrıca, artan proteolizis aşırı puromisindir tedavi19, tam bir sinyal kaybına neden bir etkisi sonra oluştuğu bilinmektedir.
Olabildiğince kesin olmamakla birlikte tıklayın-BT veya hile yöntemleri, burada önerilen yaklaşım son derece erişilebilir ve çeviri Kinetik genel değişiklikleri hızlı bir değerlendirme sağlar. Diğer yöntemler daha iyi özel uygulamalar için uygun olsa bile, puromisindir birleşme deneyleri ek bir denetim olarak gerçekleştirilebilir. Gerçekten de, belirli bir mRNA hedef belirli bir durumda etkilenen tek kişi olduğunu göstermek deneme ihtiyacı varsa, bu çeviri genel bir artış neden olduğu değil göstermek gereklidir. Bu nedenle, negatif puromisindir birleşme bu dava için kanıt sağlayabilir. Ayrıca, bu yöntem de genel çeviri yapılan gözlem için uygundur. Bu nedenle, bir çeviri baskı mekanizması, stres granül oluşumu9, olduğu gibi göstermek için veya sikloheksimit tedavi translasyonel karmaşık ayırma başlangıç aşamasında kullanılan etkili bir şekilde engelliyorsa doğrulamak için kullanılabilir uzama22. 2.3 ve 2.4 bölümlerinde açıklandığı miktar yöntemleri puromisindir boyama üzerinde odaklanan deneyler ile ilgili olsa da, onlar compartmentalized boyama fluorophores türleri kullanarak herhangi bir türü için uygulanabilir, söz önemlidir. Gerçekten de, bu miktar yöntemler bir molekül veya protein hücresel dağılımını ölçmek için kullanılabilir ve hatta bir hedef belirli bir hücre altı yerde lokalizasyonu doğrulamak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Hücre görüntüleme birimi teknik yardım için araştırma merkezinin teşekkür ediyoruz. M.-É. Huot olan bir Junior 1 araştırma bilim adamı Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Bu eser Kanada kurumları, Sağlık (sayı CIHR, paspas-286437 M.-É için hibe. araştırma tarafından desteklenmiştir Huot).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
