Summary
Dette manuskriptet beskriver en metode for å visualisere og kvantifisere lokaliserte oversettelse hendelser i subcellular rom. Tilnærmingen foreslått i dette manuskriptet krever en grunnleggende AC confocal imaging system og reagenser og er rask og kostnadseffektiv.
Abstract
Mekanismer regulere mRNA oversettelse er involvert i ulike biologiske prosesser, som bakterie linje utvikling, celledifferensiering og organogenesen, samt flere sykdommer. Flere publikasjoner har overbevisende vist at spesifikke mekanismene tett regulere mRNA oversettelse. Økt interesse oversettelse-indusert regulering av protein uttrykk har ført til utvikling av nye metoder å studere og følge de novo protein syntese i cellulo. De fleste av disse metodene er imidlertid kompleks, noe som gjør dem dyrt og ofte begrenser antall mRNA mål som kan studeres. Dette manuskriptet foreslår en metode som krever bare grunnleggende reagenser og en AC confocal fluorescens tenkelig system for å måle og visualisere endringene i mRNA oversettelse oppstår i enhver celle linje under ulike forhold. Denne metoden ble nylig brukt vil vise lokaliserte oversettelse i subcellular strukturer av tilhenger celler over en kort periode, dermed tilby se de novo oversettelse for en kort periode under en rekke biologiske prosesser eller validere endringer i translasjonsforskning aktivitet som svar på bestemte stimuli.
Introduction
Regulering av oversettelse av cellulære funksjoner har bedt mange forskergrupper å utvikle nye verktøy og metoder for å bestemme den subcellular lokaliseringen av mRNA oversettelse og regulert protein syntese1,2 ,3,4. Disse siste teknologiske fremskritt tillate for en bedre forståelse for mekanismene oversettelse oppregulering eller undertrykkelse av bestemte mRNAs under biologiske prosesser, som neuronal utvikling, narkotika-respons og metastasering5 ,6,7,8. Men krever de fleste av disse metodene dyre eller farlige reagenser og bestemt utstyr som ikke kanskje er tilgjengelig for de fleste laboratorier. Som sådan, ble en kostnadseffektiv metode til å tillate rask vurdering av oversettelse hendelser utviklet for å spesifikt omgå disse potensielle problemer. Denne metoden oppdager akutt translasjonsforskning modulasjoner som oppstår under bestemte cellulære prosesser og gir også mulighet for lokalisering av oversettelse med AC confocal mikroskopi.
Metodene som er beskrevet her ble brukt til å overvåke lokaliserte oversettelse i subcellular rom kalt spre innvielsen sentre (SIC)5. SICs er forbigående strukturer i seeded celler som er lokalisert på begynnende vedheft komplekser. Selv om SICs og vedheft komplekser er distinkte, er deres skjebne nært knyttet. Faktisk er SICs kjent for å gradvis forsvinner ved fokal vedheft komplekse modning til et vedheft område under den innledende fasen av vedheft. Vi fant ut at RNA-bindende proteiner kjent spesielt kontrollere mRNA oversettelse (f.eks Sam68, FMRP og G3BP1) og polyadenylated RNAs ble beriket innenfor disse strukturer5. Bruke metodene som er beskrevet her, viste vi at regulering av SIC-assosiert mRNA oversettelse fungerer som en checkpoint tillater seeded celler å konsolidere celleadhesjon. Denne metoden, basert på puromycin innlemmelse, kan anses som en tilpasset versjon av overflaten sensing oversettelse analysen (solnedgang). Opprinnelig utviklet for å måle globale protein syntese priser ved bruk av en ikke-radioactively merket aminosyre, tilbyr protein puromycilation en effektiv måte å visualisere de novo protein syntese9. Denne metoden er avhengig av iboende atferden til puromycin, et antibiotikum som blokkerer oversettelse gjennom tidlig kjeden oppsigelse i ribosom10. Faktisk er puromycin strukturelt analoge til tyrosyl-tRNA, som tillater for inkorporering elongating peptid kjeder via dannelsen av et peptid bånd. Puromycin binding til en voksende peptid kjede hindrer imidlertid en ny peptid bånd blir dannet med det neste aminoacyl-tRNA, siden puromycin har et ikke-hydrolysable amid bånd i stedet for hydrolysable ester bond i tRNAs. Dermed resulterer inkorporering av puromycin i elongating polypeptides i tidlig utgivelsen av mange avkortet puromycilated polypeptides tilsvarer aktivt oversatt mRNA9,11,12 .
Bruker denne metoden, det var mulig å vurdere aktive oversettelse innen kort tid enke (f.eks 5 min) under cellular vedheft ved hjelp av et spesifikt antistoff rettet mot puromycin på celler som ble supplert med antibiotikaet for 5 minutters perioder behandle5på ulike tidspunkt under celle vedheft. Presisjonen for denne analysen er avhengig av svært spesifikke antistoffer rettet mot puromycilated moiety. Immunofluorescent påvisning av puromycilated polypeptid gir en generell subcellular repartisjonere av den nylig oversatte mRNA, som også kan kvantifiseres nøyaktig med AC confocal imaging-systemer.
Derfor gir denne metoden et relevant alternativ for mange laboratorier studere translasjonsforskning regulatoriske mekanismer involvert i prosesser som neuronal korning6,13,14, 15morphogen mRNA lokalisering og oversettelse under utvikling16,17. Det er også godt egnet til å studere lokaliserte eller compartmentalized oversettelse under rask biologiske hendelser som celle migrasjon, heft eller invasjon eller bare vurdere medikamentelle behandlinger som kan indusere translasjonsforskning endringer5, 7 , 18. samlet denne metoden tillater for visualisering av lokaliserte eller kontrollert hendelser i en rask, nøyaktig og kostnadseffektiv måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fastsettelse av Puromycilation forhold
Merk: denne teknikken beskriver metoden brukes til å vurdere lokaliserte oversettelse under MRC-5 celle adhesjon prosess 5. Som puromycilation kan gjøres i en celle, er det viktig å optimalisere puromycilation betingelsene for bestemt celle linjene skal brukes, fordi behandling forholdene ikke er identiske for hver celle linje puromycin konsentrasjonen og ønsket inkubasjon tid. For å vise hvordan disse forholdene er definert, tre eksempel linjer (dvs. HeLa MRC-5 og Huh-7) ble behandlet med økende konsentrasjoner av puromycin for forskjellige inkubering ( figur 1).
- Vokse like tall i celler i en 24-vel plate i 0,5 mL av riktige fullføre kultur medium 16 timer før testen. Frø 30.000 MRC-5 celler, 50.000 HeLa celler eller 50.000 HuH-7 celler per brønn. Sørg for å unngå å overskride 60-70% samløpet (figur 1A).
- Forberede 6 rør med 1,5 mL komplett celle kultur medium med økende konsentrasjoner av puromycin (0, 5, 10, 15, 20 og 30 µg/mL). Pre varme på 37 ° C.
- For hver konsentrasjon av puromycin medium (forberedt i trinn 1.2), overføre 0,5 mL fra hver rør i 6 nye rør og legge gapestokk på en siste konsentrasjon av 50 µg/mL til alle 6 nye rør. Pre varme på 37 ° C.
- Endre mediet med 0,5 mL fullstendig kultur medium (rad 1 og 2). Legg til 0,5 mL fullstendig kultur medium med 50 µg/mL av gapestokk ( figur 1B) for den tredje raden.
Merk: Gapestokk behandling er etablert som beste negative kontrollen for protein puromycilation på grunn av sin evne til å blokkere oversettelse forlengelse. Fordi puromycin innlemmelse krever oversettelse forlengelse, gapestokk behandling fører til tap av puromycilated protein signaler 5 , 18. - Ruge i 15 min på 37 ° C (5% CO 2).
- Legge til 0,5 mL av puromycin medium forberedt i trinn 1.2 til andre rad å få siste konsentrasjoner av 0, 2.5, 5, 7.5, 10 og 15 µg/mL, henholdsvis i kolonnene A, B, C, D, E og F. Samtidig, Legg til 0,5 mL puromycin til gapestokk-supplert medium (trinn 1.3) i den tredje raden ( figur 1 c).
- Ruge i 5 min på 37 ° C (5% CO 2).
- Legge til 0,5 mL av puromycin medium forberedt i trinn 1.2 til bolen hente siste konsentrasjoner av 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 og 15 µg/mL ( figur 1 c).
- Ruge i 5 min på 37 ° C (5% CO 2).
- Vask hver godt fra rader 1 til 3 med 1 mL av iskalde 1 X fosfat-bufret saltvann (PBS) 5 min etter tillegg av puromycin brønner i første rad (dobbelt vask). Legge til 75 µL av 1 X Laemmli buffer (4% natrium dodecyl sulfate (SDS), 4% 2-mercaptoethanol, 0.120 M Tris HCl pH 6.8, 0.004% bromophenol blå og 10% glyserol) å få hele-cellers lysates for hvert vilkår.
- Løpe 10% SDS-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) bruker 1/3 av forberedt prøvene for å vurdere puromycin innlemmelse.
- Finne ut hvilket puromycin innlemmelse av Western blot analyse ved hjelp av et anti-puromycin antistoff (12 D 10) fortynnet i forholdet 1:25,000 i primære antistoff inkubasjon buffer (2% bovin serum albumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 og 0,01% Natriumazid).
Merk: Representant bilder tilsvarer ulike celle linje ekstrakter laget som beskrevet i trinn 1 vises som eksempler i figur 2.
- Finne ut hvilket puromycin innlemmelse av Western blot analyse ved hjelp av et anti-puromycin antistoff (12 D 10) fortynnet i forholdet 1:25,000 i primære antistoff inkubasjon buffer (2% bovin serum albumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 og 0,01% Natriumazid).
2. I Cellulo Lokalisert oversettelse visualisering
Merk: teknikken beskrevet her ble brukt til å vurdere lokaliserte oversettelse i SICs i MRC-5 celler under adhesjon prosess 5. Selv om MRC-5 celler brukes her, andre linjer kan brukes med samme metodikk beskrevet i trinn 2.1.
- Celle forberedelse.
- Koble MRC-5 celler med 0,25% trypsin/2.21 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) i Hank ' s balansert Salt løsning (HBSS). Pellets cellene med sentrifugering (5 min 200 x g) i en 15-mL konisk sentrifuge rør og avbryte dem Dulbecco ' s endret Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS) på 40 000 celler/mL etter å telle med en teller kammer.
- Ruge suspendert cellene på 37 ° C mild rotasjon bruker et rør rotator for 20 min beholde dem i suspensjon.
Merk: Dette trinnet er viktig å ha fullført dissosiasjon av fokal vedheft komplekser. - Plate 2 mL suspendert MRC-5 celler (40 000 celler/mL) i to 35 mm glass bunn retter. Bruk den første 35 mm glass-bottom retten for puromycilation analysen (se trinn 2.1.5) og bruke andre som en negativ kontroll (se trinn 2.1.6).
- Holde cellene på 37 ° C (5% CO 2) i 55 min for mobilnettet vedheft og SIC formasjonen.
- Legg til puromycin til medium i 35 mm glass bunn retter (analysen) bruker konsentrasjonen tidligere definert i avsnitt 1. For å behandle MRC-5 celler, bruke 10 µg/mL puromycin for 5 min på 37 ° C (5% CO 2).
- Som en negativ kontroll, legge gapestokk til de andre 35 mm glass-bottom retten 40 min etter seeding cellene å pre-behandle dem med 50 µg/mL gapestokk ( figur 2B). 15 min etter gapestokk, deretter legge til puromycin til mediet bruker samme konsentrasjon og inkubasjon tid som i trinn 2.1.5 (f.eks bruk 10 µg/mL av puromycin etter 5 min på 37 ° C (5% CO 2) for MRC-5).
- Vask hver plate to ganger med 2 mL iskald 1 X PBS og fikse cellene med 1 mL av 4% formaldehyd (utvannet i 1 X PBS) i 15 min ved romtemperatur (RT).
Advarsel: Paraformaldehyde må brukes strengt i kjemisk hette.
- Immunostaining.
- Paraformaldehyde fiksering, vaske tre ganger med 2 mL 1 X PBS og ruge i 500 µL av PBS-TritonX-100 (0,5%) etter 20 min på RT å permeabilize cellene.
- For å forhindre uspesifikke antistoff bindende, blokkere prøven med 500 µL PBS – BSA (1%) for 20 min på rett
- Vask tre ganger med 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) og ruge med 300 µL av anti-puromycin antistoff (12 D 10) fortynnet 1:12,500 i 1 X PBS 1t på RT.
- Vask 3 ganger med 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) og Inkuber med 300 µL av anti-musen IgG konjugert til en fluorophore (her, 488 nm) fortynnet med PBS å visualisere puromycilated polypeptides og phalloidin-konjugerte til en annen fluorophore (her, 555 nm) visualisere F-utgangen. Inkuber 1t på RT.
- Vask tre ganger med 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) og deretter ruge i 5 min på RT i 300 µL av PBS-Tween20 (0,1%) med 1 µg/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Vask tre ganger med 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) og deretter vaske med 2 mL 1 X PBS. Hindre cellene tørker ved å holde prøven i 2 mL 1 X PBS under bildeopptak.
3. Immunofluorescent bildeopptak
Merk: følgende metodene kan brukes med alle kommersielt tilgjengelig AC confocal imaging system.
- Fastslå de riktige innstillingene for hver fluorophore å maksimere det dynamiske området for kvantifisering.
Merk: Representant kvantifisering kan bare hentes hvis pixel metning unngås og signal terskelen er riktig justert. Disse innstillingene kan oppnås ved å justere nøye laser makt, høy spenning (HV), få, og forskyvning.- Juster zoom faktor (5 X) og antall piksler (512 x 512) å optimalisere pikselstørrelsen.
Merk: Dette bør være minst 2.3 - ganger mindre enn den optiske oppløsningen, ifølge Nyquist teoremet. - Redusere skannehastighet (12,5-20 µs/bildepunkt) og bruke gjennomsnitt (2 - 3 ganger) til å forbedre signal-til-støy forholdet i henhold til innstillingene ovenfor.
- Juster zoom faktor (5 X) og antall piksler (512 x 512) å optimalisere pikselstørrelsen.
- Manuelt avgjøre riktig toppen og bunnen fokal fly langs z-aksen med optimal trinn størrelsen (0,4 µm/slice).
Merk: Trinn størrelse flyet bestemmes av aksial oppløsningen delt 2.3, ifølge Nyquist teoremet. 20-25 lag er vanligvis nødvendig for å dekke hele cellen dybden tilhenger celleområde. - Kjøpe et AC confocal bilde av en hel enkelt celle med en 60 X Plan Apo olje nedsenking mål (1.42 numeriske blenderåpning).
4. Immunofluorescent bilde kvantifisering
- fastsettelse av berikelse.
- Åpne et bilde tilsvarer z-fly laget av interesse fra datafilen ervervet cellen ved hjelp av ImageJ programvare (freeware tilgjengelig på http://fiji.sc).
- Tegne en linje ved hjelp av linje tegning verktøyet (verktøylinjen → rett) gjennom regionene i cellen der kvantifisering er ønsket. Endre linjetykkelsen ved å dobbeltklikke " rett; " intensitetsverdiene fargemåleren gjennom bredden på linjen (satt på 8 i Figur 3).
Merk: En tynnere linje er foretrukket å unngå signal overlapping fra ulike strukturer. - Etter at linjen er riktig angitt, profil signal tetthet langs bestemt aksen (menylinjen → analyser → Plot profil).
Merk: Et nytt vindu vil åpne som viser en profil tilsvarer signal intensiteten for hver piksel til den valgte stasjonen (bestemt fluorophore) langs linjen for den valgte z-fly-delen.- Gjenta prosessen for hver kanal tilsvarer fluorophore brukt (dvs. en kvantifisering for 488, én for 568 og for 405).
Merk: Intensitetsverdien signalet alltid ordnes etter retningen på tegnet linjen.
- Gjenta prosessen for hver kanal tilsvarer fluorophore brukt (dvs. en kvantifisering for 488, én for 568 og for 405).
- For å få numeriske gråtoner verdiene for hver piksel i profilen tilsvarer quantifications på det valgte z-fly laget, kopierer profildataene (menylinjen i bildevinduet → kopi) og lim den inn i et regnearkprogram.
- Gjennta punkt 4.1.1-4.1.4 for hver z-fly del av ervervet AC confocal bildet og hver kanal der kvantifisering ønskes.
Merk: Kvantifisering av ulike z-plane lag kan samordnes for å få en generell vurdering av spesielle anriking av signalet ved å beregne summen verdien av hver piksel langs linjen for hvert z-plane lag. Denne typen pooling kan bare oppnås hvis linjen er identisk for hver z-fly laget i mener verdiene. - Som en alternativ metode for hele celle kvantifisering av ulike kanaler med mange lag, kan du bruke makroen som ble kalt StackprofileData (se Ekstra fil).
Merk: Denne makroen er tilgjengelig fritt på https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt og kan brukes som følger:- lime inn makroen til en tekstfil og lagre det.
- Åpne bildefilen som inkluderer alle AC confocal lagene til cellen.
- Tegne, som beskrevet i trinn 4.1.2, åpne et nytt vindu for å importere makroen (menylinjen → Plugins → makroer → kjøre), Velg den lagrede tekstfilen tilsvarer makroen StackprofileData, og klikk " åpne. "
Merk: Følgende makro innførsel, et nytt vindu kalt " resultatene " åpnes og alle kvantifiseringen langs bestemt aksen vises for hvert z-plane lag og kanal i bildefilene. - Kopiere data for hver kanal (menylinjen → Rediger → kopi) å få den grafiske profil representasjonen tilsvarer signal quantifications. Lim den inn i et regnearkprogram. Beregne summen verdien av hver kanal for hver piksel langs linjen for hvert z-plane lag. Bruk disse verdiene til å opprette en grafisk fremstilling lik den som vises i Figur 3.
- Kvantifisering av signal i en angitt mobilnettet område eller volum.
- Åpne bildefilen med ImageJ programvare.
- Tegne et område for å betegne området rundt funksjonen geometriske form (verktøylinjen → " rektangel, " " oval, " eller " polygon ").
Merk: Kvantifisering verdien avgjøres for området tilsvarer tegnet skjemaet. - Justere terskelen for å unngå alle bakgrunn signal (menylinjen → Image Juster → terskel), et nytt vindu vises for å representere pixel intensiteten i histogram-skjemaet. Endre verdiene for å inkludere/utelukke piksler kvantifiseringen ved hjelp av glidebryteren. Velg en terskel som fjerner røde bildepunkter utenfor cellen som piksler uthevet i rødt inkluderes i kvantifiseringen.
- Definerer parameterne måling for å kvantifisere pixel signalet i det valgte området, uten bakgrunn signal (menylinjen → analyser → sette mål), og sjekk den " grensen terskelen " og " integrert tetthet " boksene.
- Måle de kvantitative verdiene for valgte (menylinjen → analyser → mål).
Merk: Signal intensitet kvantifisering vil bli presentert i et nytt vindu under den " IntDen " som representerer av mener grå verdiene og antall piksler i det merkede området. - Tegne et område som omfatter hele cellen med en geometrisk form (verktøylinjen → " rektangel, " " oval, " eller " polygon ") og fortsett med trinn 4.2.3-4.2.5 å få en verdi som tilsvarer det totale signalet. Beregne forholdet mellom signalet i det merkede området over hele signalet å få prosent av signalet i området av interesse.
- Gjenta trinn 4.2.2-4.2.6 å få kvantifisering av cellen volumet for hver z-fly. Tilpasse skjemaet geometriske behov.
- Lime dataene hentes fra den " resultatene " windows for hver z-fly laget i et regneark for grafisk fremstilling og finne en middelverdien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å observere nøyaktig oversettelse hendelser ved hjelp av puromycin innlemmelse, er det viktig å fastslå de optimale forholdene for hver celle linje fordi hvert viser forskjellige puromycin innlemmelse kinetics (figur 1)9,11 ,12,18. Derfor for å validere puromycin innlemmelse, er det nødvendig å behandle ønsket celle linjen med et standardisert spekter av økende konsentrasjoner av puromycin (1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 og 15,0 µg/mL) i ulike tidsperioder (5 og 10 min). For å vurdere lokaliserte oversettelse eller en tidlig svar på behandling, kortere inkubasjon tid er foretrukket (f.eks . mindre enn 5 min), som gjør det mulig for direkte vurdering av translasjonsforskning hendelsene umiddelbart etter en behandling. Ideelt sett puromycin signalet skal være lett synlig men bør også unngå metningspunkt (figur 2). Som avbildet i figur 2 (venstre panel), er en akseptabel puromycin konsentrasjon 7.5-10.0 µg/mL for MRC-5 og jakten, mens 5.0-7,5 µg/mL av puromycin er foreslått for Huh-7. Optimalisering av eksperimentelle parameterne er avgjørende fordi målet med denne metoden er ikke å hemme helt alle translasjonsforskning forlengelse ved innvielsen, men å merke nylig synthetized polypeptid kjeder under oversettelsen å oppdage akutt variasjoner i oversettelse. Denne første fasen i protokollen skal ikke neglisjert, som overdreven puromycin tilgjengelighet og utvidet behandling tid vil føre store uønskede konsekvenser. Som observert i figur 2 (høyre panel), generere celler som behandles for 10 min med en høy puromycin konsentrasjon meste mindre puromycilated polypeptides (f.eks Huh-7, 7,5 µg/mL eller mer for 10 min). Disse mindre polypeptides vil diffus raskere i cellen, som kan forstyrre nøyaktig å vurdere subcellular lokalisering. Et annet problem er at økt proteolyse oppstår ved overdreven puromycin behandling19. Dette resultatet ble observert i MRC-5 og HeLa celler som behandles for 10 min, som viste redusert signal intensiteten i nærvær av 10 eller 15 µg/mL av puromycin. Begge disse fenomenene er villedende hvis puromycin innlemmelse er vurdert av immunofluorescence fordi øket spredning hindrer nøyaktig visualisering av oversettelse lokalisering, mens puromycin-indusert fornedrelse sterkt redusert gjenkjenning følsomhet. Disse uønskede konsekvenser er lett unngått ved riktig definere optimale eksperimentelle forhold, som beskrevet i Seksjon 1 av protokollen.
Mens visualisere puromycin innlemmelse, er det også viktig å utføre riktig kontroller. Som vist i figur 3A, kan puromycin innlemmelse blokkeres effektivt med tillegg av 50 µg/mL gapestokk, et sammensatt kjent for å hemme oversettelse forlengelse20 og dermed puromycin innlemmelse. Dette er vist i figur 3B, som viser at gapestokk behandling effektivt forhindret de fleste av signalet tilsvarer puromycin innlemmelse i tilhenger MRC-5 celler. Faktisk, mens puromycilated peptider kan visualiseres i cellene behandlet med puromycin bare, et svakt signal registreres i celler som ble også behandlet med gapestokk under like flekker. Alternativt kan en annen antibiotika (anisomycin) også brukes som en negativ kontroll, som det har evnen til å blokkere peptidyl transferase aktivitet5 og har vist seg å være så effektiv som gapestokk ved blokkering puromycin innlemmelse5 ,18
Etter immunofluorescent bildeopptak er det mulig å vurdere den generelle lokaliseringen av puromycilated polypeptides tilsvarer nylig synthetized proteiner (Figur 4). Bildelag merket ulike dybder i tilhenger cellene, slik at signalet intensiteten i subcellular rom skal vurderes i ulike celle fly. Som sådan, er det mulig å sammenligne lokaliserte puromycilation reaksjonen på bunnen av cellen (figur 4A), midten av cellen (figur 4B) eller toppen av cellen (figur 4C). Ligger litt over spirende og maturating vedheft strukturer, er SICs mest observert i midten av cellen. Som forventet, oppdages intens puromycilation i SICs, antyder at mRNA oversettelse er isolert til disse subcellular strukturer. Som nevnt tidligere, er det mulig å sammenligne signal intensitet langs en ønsket akse. Denne sammenligningen er bare mulig hvis bildene ervervet ikke inneholder mettet piksler, som blir røde i gråtonebildet (andre paneler fra toppen) innhentet av mikroskopet operativsystemprogramvare. Disse bildene kan importeres til ImageJ programvaren for kvantifisering og analyse av pixel intensiteten langs en bestemt akse. Pixel kvantifiseringen kan representeres grafisk (midten panel) å illustrere relative pixel intensiteten på angitte posisjoner langs aksen. En nærmere titt på innsatsen i øvre panelene viser SIC-utgangen grenser (i rødt) og et grønt signal i strukturen som tilsvarer høyaktiv oversettelse hendelser, som er beriket i disse strukturene (nederst). Selv om denne kvantifisering metoden ikke er den beste måten å fastslå en nøyaktig prosentdel av totale oversettelse oppstår i disse strukturene, det er visuelt informativ ved at for rask vurdering av intensiteten av signalet og er en god tilnærming til den signalet distribusjon over hele cellen.
For å få en kvantitativ fordeling av signalet gjennom hele cellen, brukes en annen metode. Som vist i figur 5, er en av de viktigste trinnene å betegne interesseområder som må være kvantifisert for hver z-plane komponere AC confocal bildefilene. Tildelingen kan oppnås ved hjelp av et annet tegneverktøy i ImageJ. Bruker denne metoden, er det mulig å kvantifisere ett område eller flere områder, som kan deretter forhold, trekkes eller kompilert. De viktigste problemene skal: (i) finner den optimale imaging forhold som unngå pixel metning og bakgrunn signal, som kan fremstille kvantitative verdien av innhentet, og (ii) etablere optimale kalibrering av terskelen i ImageJ. Forutsatt at begge disse betingelsene er optimal, er denne kvantifisering metoden svært reproduserbare og fortsatt lett å utføre. Før bildeopptak er det også viktig å nøye bestemme nedre og øvre grensene for z-flyene i cellen valgt for kvantifisering. I tilfellet vises i Figur 4tilsvarer nederst oppløsning grensen på målet, som inneholder ofte forurensende evanescent fluorescens, noe som kan redusere SIC/celle kroppen signal forholdet. Som tidligere nevnt, SICs er involvert i adhesjon området formasjon og modning; Derfor ligger SIC strukturer litt over nylig dannet vedheft komplekser, som utelukker evanescent fluorescens fra nederste lag. Dermed er SIC-bundet puromycilation signalet knapt synlig i de nederste delene, mens vi kan tydelig obsErve i den midtre delen forklarer økte andelen SIC/celle kroppen signalet i midten regionen forhold til nedre eller øvre flyene.
Figur 1. Eksperimentell representasjon av puromycin behandling optimalisering beskrevet i del 1.
(A) en 24-vel representasjon av celler blir sådd for eksperimentet (trinn 1.1). (B) skjematisk fremstilling av trinn 1.4 viser middels endringen i rad 1 og 2 av 24-vel plate og tillegg av gapestokk (CHX) i hver brønn i tredje rad for en siste konsentrasjon av 50 µg/mL. (C) skjematisk fremstilling av puromycin behandling i andre og tredje radene (trinn 1.6) 15 min etter trinn 1.4. (D) skjematisk fremstilling av puromycin behandling i den første raden (trinn 1.8) 5 min etter trinn 1.6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bestemmelse av de optimale forholdene for puromycin innlemmelse.
Western blot analyse av hele-cellen ekstraktet (A)MRC-5, (B) Huh-7, og (C) HeLa celler, inkubert med økende konsentrasjoner av puromycin (0, 2.5, 5, 7.5, 10 og 15 µg/mL) for en periode på 5 min (venstre panel) eller 10 min (høyre paneler). Puromycilated peptider ble oppdaget ved hjelp av et antistoff mot puromycin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Hemming av puromycilation bruker gapestokk.
(A) Western blot viser effekten av gapestokk på en 5-min puromycilation analysen. Inkorporering effektivitet i MRC-5, Huh-7 og HeLa celler etter mock (PBS 1 X) eller gapestokk behandling. (B) AC Confocal bilde viser effekten av gapestokk på puromycin innlemmelse. MRC-5 celler ble pre-behandlet med PBS (falske) eller gapestokk i 15 min og deretter supplert med 10 µg/mL puromycin + PBS 1 X (venstre panel) eller 10 µg/mL av puromycin + 50 µg/mL av gapestokk (høyre panel) for 5 min. Puromycilated proteiner ble oppdaget bruker et antistoff mot puromycin (grønn). F-utgangen ble oppdaget ved hjelp av phalloidin (rød) og kjernen var farget med DAPI (blå). Setter inn til høyre tilsvarer en 2,5 x forstørrelse på den hvite boksen. Barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kvantifisering av translasjonsforskning aktivitet i SICs i tilhenger MRC-5 celler.
(A-C) Representativt AC confocal bilde av tilhenger MRC-5 cellene behandlet med 10 µg/mL puromycin i 5 minutter. Bildene presentert svarer til bunnen (A), midten (B)og øvre (C) deler av cellen. Den øvre panelene viser puromycilated proteiner oppdaget bruker et antistoff mot puromycin (grønn). F-utgangen ble oppdaget ved hjelp av phalloidin (rød) og kjernen var farget med DAPI (blå). Setter inn til høyre tilsvarer en 2 x forstørrelse på den hvite boksen. Barer = 10 μm. Middels paneler viser fraværet av mettet piksler, som ville ha blitt markert med rødt. Den nedre paneler vise en grafisk fremstilling av puromycilated protein berikelse i en tilhenger MRC-5 celle ved å sammenligne signal intensiteten for puromycin (grønn), F-utgangen (rød) og DAPI (blå) langs celle aksen pilens hvit. (D-F) Bildene presentert tilsvarer den 4.4 x forstørrelse sette av SICs presentert i (-vekselstrøm). Kvantifiseringen viser SIC kantlinjen (rød topper: utgangen), samt lokaliserte oversettelse i SICs (grønn topper: puromycin) i laveste (D), midten (E), og øvre (F) regioner i cellen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Hele celle signal kvantifisering av puromycilated proteiner i tilhenger MRC-5 celler.
(A) fastsettelse av signalet i ulike områder av z-plane botnlaget på en tilhenger MRC-5-cellen. (Venstre panel) Utvalg av området (I) dekker totaliteten av cellen å få en kvantitativ verdi som tilsvarer det totale cellular signalet i dette z-fly laget. (Midten panel) Utvalg av mobilnettet området kjernen og cytoplasmatiske del som ikke inkluderer SIC (II). (Høyre panel) Visualisering av området til SICs (III) ved å trekke verdien fra området II fra verdien for hele cellen (området jeg). Barer = 10 μm. (B) kvantitative bildepunktverdier for hvert område er oppført i tabellen for bildet som viser området utvalget i (A), etterfulgt av en graf som viser andelen (%) av signal finnes i SICs. (C) fastsettelse av signalet i ulike områder av z-plane mellomlag på en tilhenger MRC-5-cellen. (Venstre panel) Utvalg av området (I) dekker totaliteten av cellen å få en kvantitativ verdi som tilsvarer det totale cellular signalet i dette z-fly laget. (Midten panel) Utvalg av celle området kjernen og cytoplasmatiske del som ikke inkluderer SIC (II). (Høyre panel) Visualisering av området til SICs (III) ved å trekke verdien hentes for området II fra verdien for hele cellen (området jeg). (D) kvantitative bildepunktverdier for hvert område er oppført i tabellen for bildet som viser området utvalget i (C), etterfulgt av en graf som viser andelen (%) av i for SICs. (E) fastsettelse av signalet i ulike områder av øvre z-fly laget en tilhenger MRC-5-cellen. (Venstre panel) Utvalg av området (I) dekker totaliteten av cellen å få en kvantitativ verdi som tilsvarer total-celle signalet for dette z-fly laget. (Midtre panel) utvalg av celle området kjernen og cytoplasmatiske del som ikke inkluderer SICs (II). (Høyre panel) Visualisering av området til SICs (III) ved å trekke verdien hentes for området II fra verdien for hele cellen (området jeg). (F) kvantitative bildepunktverdier for hvert område er oppført i tabellen for bildet som viser området utvalget i (E), etterfulgt av en graf som viser andelen (%) av i for SICs. (G) kvantifisering verdier for alle z-plane lagene fra cellen presentert ovenfor, inkludert en beregnet for z-fly presentert i A (z = 1), C (z = 9), og E (z = 19), som er uthevet i rødt på bordet. (H) grafisk fremstilling av ønsket signal finnes i SICs gjennom hele cellen volumet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyere teknologiske fremskritt har lov for en bedre forståelse for mekanismene som er involvert i translasjonsforskning oppregulering eller undertrykkelse av bestemte mRNAs i biologiske prosesser, som neuronal utvikling, narkotika-respons og metastasering. Kostnadseffektiv metodikk beskrevet her kan oversettelse hendelser kan visualiseres i cellene for å studere hvordan RNA-bindende proteiner regulere metastatisk prosesser, som cellular vedheft, migrasjon og invasjon.
Selv om mange metoder for å vurdere de novo protein oversettelsen er utviklet, deler alle samme strategi, der den elongating polypeptid har endret aminosyrer som er merket med en synlig moiety. Først av disse metodene er avhengig av 35S-radiolabeled arginine inkorporering nylig oversatt protein. Selv om det er effektivt for å sammenligne general ratene for oversettelse under bestemte forhold, gjør bruk av radiolabeled aminosyrer denne metoden unappealing å de fleste forskergrupper. Derfor utviklingen av romanen ved hjelp av ikke-radioaktivt etiketter, for eksempel solnedgang, klikk-it eller knep tilnærming, tilbys nye muligheter til å vurdere og observere i vivo oversettelse hendelser. Selv om genial, tillater de fleste av disse metodene bare for vurdering av oversettelse hendelser etter behandling eller bestemte mobilnettet hendelser ved hjelp av en bestemt eksogene cDNA konstruere av konkrete mål, begrense eksperimenter allerede identifiserte mål . Dette gjelder for knep tilnærming4, som tillater translasjonsforskning regulering av et enkelt exogenously uttrykt mRNA mål skal vurderes. Selv om det gir mulighet for validering av translasjonsforskning aktivering av endogene mRNAs, er den "Klikk-IT" metoden minimal inkubasjon AHA innlemmelse minst 1 h13, som er for lang for mest akutte oversettelse mekanismer.
Mens svært allsidig og enkel å konfigurere, krever metoden beskrevet her at kritiske trinnene følges i den første fasen av protokollen. Som vist i representant resultatene, vil forskjellige linjer ha forskjellige puromycin innlemmelse kinetikk, som bare kan skyldes metabolske rate av hver celle linje, som synes å være tilfelle for MRC-5 celler5,21. Faktisk ikke-transformert celler er ikke så proliferativ som HeLa, og derfor protein masse fornyelse er mindre robust enn i transformert celler. Dette bør tas i betraktning når du bruker protokollen. Følgelig, den første delen av protokollen er avgjørende for resten av metoden. Nøye å bestemme konsentrasjonen av puromycin og lengden på inkubasjon vil tillate en bedre vurdering av oversettelsen oppstått under eksperimentet. Som nevnt ovenfor, behandling med en overdreven mengde puromycin øker forholdet av små puromycilated polypeptides og synes å stimulere proteolyse, som kan lett føre til en feiltolkning av normalt translasjonsforskning hendelser19 . Som en tommelfingerregel, er jo lenger den inkubasjon tiden, de mindre puromycin nødvendig, mens kortere inkubasjon tid krever en høyere puromycin konsentrasjon. Konsentrasjon/tiden kan tilpasses bestemte eksperimentelle begrensninger.
Metodene presenteres her er svært praktisk og kan enkelt endres etter kuren anvendt eller biologisk prosess studerte. Puromycin innlemmelse tillater rask vurdering av endringer i oversettelse kinetics over en kort tidsperiode, mens metoden kvantifisering gir svært informativ bilder av mobilnettet hendelser. Selv om kraftig, har disse metodene begrensninger som må vurderes. Puromycin vil bli innarbeidet i proteiner nylig syntetisert fra alle mRNAs som aktivt oversatt. Derfor puromycilation metoden beskrevet her kan ikke være egnet til å studere konkrete mål (dvs. enkel mRNAs), men det er ideelt å få en generell oversikt over translasjonsforskning aktivitet innenfor en enkelt celle eller en celle befolkningen. Som nevnt ovenfor, overdreven puromycin har store ulemper og puromycin doser og behandlingstider bør nøye defineres, som foreslått i protokollen. Faktisk, som vist i figur 2, overdreven puromycin tilgjengelighet vil resultere i dannelsen av mindre puromycilated polypeptides som diffus raskere i cellen, fører til unøyaktig subcellular lokalisering data. I tillegg er økte proteolyse kjent for å oppstå etter overdreven puromycin behandling19, en effekt som kan føre til fullstendig tap av signal.
Selv om ikke så spesifikk som Klikk-it eller knep metoder, tilnærming foreslått her er svært tilgjengelig og tillater rask vurdering av generelle endringer i oversettelse kinetics. Selv om andre metoder er bedre egnet for bestemte programmer, kan puromycin innlemmelse analyser utføres som en utfyllende. Faktisk, hvis eksperimentet må vise at et bestemt mRNA mål er den eneste påvirket i en bestemt tilstand, er det nødvendig å vise at dette ikke er forårsaket av en generell økning i oversettelse. Som sådan, kunne negative puromycin innlemmelse gi bevis for dette tilfellet. Dessuten, denne metoden er godt egnet til å observere generelle endringer i oversettelser. Derfor, den kan brukes til å vise en konverteringsmetode for undertrykkelse, som i tilfelle av stress granule formasjon9, eller validere om gapestokk behandling brukes i den innledende fasen av translasjonsforskning komplekse fraksjoneres effektivt blokkerer forlengelse22. Det er også viktig å nevne at selv om kvantifisering metodene beskrevet i avsnitt 2.3 og 2.4 relatert til eksperimenter med fokus på puromycin flekker, de kan brukes til alle typer compartmentalized flekker bruke ulike typer fluorophores. Faktisk disse kvantifisering metoder kan brukes å kvantifisere mobilnettet distribusjon av et molekyl eller protein og kan også validere lokalisering av et mål i en bestemt subcellular kupé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Quebec, Canada) for kritisk lesing av manuskriptet. Vi takker celle Imaging enheten forskningssenteret for deres kundestøtte. M.-É. Huot er Junior 1 stipendiat av de Fonds Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske institutter for helseforskning (gi nummer CIHR, MOPP-286437 til M.-É. Huot).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
