Summary
Este manuscrito describe un método para visualizar y cuantificar eventos traducción localizada en compartimientos subcelulares. El enfoque propuesto en este manuscrito requiere un sistema de proyección de imagen confocal básico y reactivos y es rápida y rentable.
Abstract
Los mecanismos de regulación de la traducción del mRNA están implicados en varios procesos biológicos, como el desarrollo de líneas germinales, diferenciación celular y organogénesis, así como en múltiples enfermedades. Numerosas publicaciones han demostrado convincentemente que mecanismos específicos bien regulan la traducción del mRNA. Creciente interés en la regulación inducida por la traducción de la expresión de la proteína ha llevado al desarrollo de nuevos métodos para estudiar y seguir de nuevo proteína síntesis de cellulo. Sin embargo, la mayoría de estos métodos es compleja, haciéndolos costosos y a menudo limitar el número de objetivos de mRNA que pueden estudiarse. Este manuscrito propone un método que requiere sólo reactivos básicos y un sistema de imagen confocal de la fluorescencia para medir y visualizar los cambios en la traducción de ARNm que se producen en cualquier línea celular en diversas condiciones. Este método fue utilizado recientemente para mostrar traducción localizada en las estructuras subcelulares de las células adherentes durante un período corto de tiempo, ofreciendo así la posibilidad de visualizar traducción de novo durante un corto período durante una variedad de biológico procesos o de validar cambios en actividad traslacional en respuesta a estímulos específicos.
Introduction
La regulación de la traducción de diversas funciones celulares ha llevado a muchos equipos de investigación para desarrollar nuevas herramientas y métodos para determinar la localización subcelular de la traducción del mRNA y proteína regulada síntesis1,2 ,3,4. Estos avances tecnológicos recientes permiten una mejor comprensión de los mecanismos que implican el upregulation de la traducción o la represión de los mRNAs específicos durante los procesos biológicos, como el desarrollo neuronal, la respuesta de la droga y metástasis5 ,6,7,8. Sin embargo, la mayoría de estos métodos requieren reactivos caros o peligrosos y equipamiento específico que podría no estar disponible para la mayoría de los laboratorios. Como tal, fue desarrollado un método rentable para permitir la evaluación rápida de los eventos de traducción para específicamente evitar estos posibles problemas. Este método detecta agudas modulaciones traslacionales que se producen durante procesos celulares específicos y también permite la localización de la traducción usando microscopia confocal.
Se utilizaron los métodos descritos aquí para supervisar la traducción localizada dentro de compartimentos subcelulares llamado difusión de centros (SIC) de iniciación5. SICs son estructuras transitorias encontradas células sembradas que se localizan encima de los complejos de adhesión naciente. Aunque SICs y complejos de adhesión son distintos, sus destinos están íntimamente ligados. De hecho, SICs conocen a desaparecer poco a poco sobre maduración complejos de adhesión focal en un sitio de adherencia durante la fase inicial de adhesión. Hemos encontrado que las proteínas de unión de ARN conocidas para controlar específicamente la traducción del mRNA (p. ej., Sam68, FMRP y G3BP1) y cofia RNAs fueron enriquecidos dentro de estas estructuras5. Utilizando los métodos descritos aquí, demostramos que la regulación del mRNA SIC asociados traducción actúa como un punto de control que permite sembrar células para consolidar la adhesión celular. Este método, basado en la incorporación de puromicina, podría considerarse una versión adaptada de la detección superficial de prueba de traducción (SunSET). Originalmente desarrollado para medir las tasas de síntesis de proteína global utilizando un aminoácido marcado no radiactivo, proteína puromycilation ofrece una manera eficiente para visualizar de novo de síntesis de proteínas9. Este método se basa en el comportamiento intrínseco de puromicina, un antibiótico que bloquea la traducción a través de terminación prematura de la cadena en el ribosoma10. De hecho, la puromicina es estructuralmente análogo a Tirosil-ARNt, que permite la incorporación en alargar las cadenas de péptido a través de la formación de un enlace peptídico. Sin embargo, Unión de puromicina a una cadena creciente del peptide impide que un nuevo enlace peptídico formándose con el aminoacil-tRNA siguiente, puesto que la puromicina tiene un enlace de amida no hidrolizable en vez del enlace de éster hidrolizable en tRNAs. Así, la incorporación de puromicina alarga polipéptidos resulta en la liberación prematura de numerosos polipéptidos puromycilated truncada correspondiente a mRNA activamente traducido9,11,12 .
Usando este método, fue posible evaluar la traducción activa dentro de una viuda de corto plazo (por ejemplo, 5 minutos) durante la adhesión celular usando un anticuerpo específico contra puromicina en células que fueron complementados con el antibiótico durante períodos de 5 minutos en diferentes momentos durante la adhesión celular proceso5. La precisión de este ensayo se basa en anticuerpos altamente específicos dirigidos contra la molécula de puromycilated. Detección inmunofluorescente del polipéptido puromycilated proporciona una distribución subcelular general del mRNA recién traducida, que también se puede cuantificar con gran precisión utilizando sistemas de proyección de imagen confocales.
Por lo tanto, este método ofrece una opción relevante para un gran número de laboratorios estudio traslacionales mecanismos implicados en procesos como la granulación neuronal6,13,14, 15, morfogen mRNA, traducción y localización durante el desarrollo de16,17. También es idóneo para estudiar traducción localizada o compartimentada durante rápidos acontecimientos biológicos, como la migración celular, adherencia o invasión, o simplemente evaluar los tratamientos con fármacos que pueden inducir cambios traslacional5, 7 , 18. en general, este método permite la visualización de eventos de traducción localizada o controlados de una manera rápida, precisa y rentable.
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Protocol
1. determinación de las condiciones de Puromycilation
Nota: esta técnica describe el método utilizado para evaluar la traducción localizada durante la MRC-5 adhesión celular proceso 5. Como puromycilation se puede hacer en cualquier celular, es importante optimizar las condiciones de puromycilation para las líneas celulares específicas a utilizar, porque las condiciones de tratamiento no son idénticas para cada línea celular en cuanto a la concentración de puromicina y deseado tiempo de incubación. Para mostrar cómo se definen estas condiciones, tres líneas de células de ejemplo (es decir, HeLa, MRC-5 y Huh-7) fueron tratadas con el aumento de las concentraciones de puromicina para tiempos de incubación diferentes ( figura 1).
- Crecer idéntico número de células en un plato 24-well en 0,5 mL de la apropiada completa cultura medio 16 h antes de la prueba. Semilla de 30.000 células MRC-5, 50.000 células HeLa o 50.000 HuH-7 células por pocillo. Asegúrese de evitar superar la confluencia de 60-70% (figura 1A).
- Preparar 6 tubos con 1,5 mL de medio de cultivo de célula completa con el aumento de las concentraciones de puromicina (0, 5, 10, 15, 20 y 30 μg/mL). Previamente caliente a 37 ° C.
- Para cada concentración de medio de puromicina (preparado en el paso 1.2), transferir 0,5 mL de cada tubo en 6 nuevos tubos y añadir cicloheximida en una concentración final de 50 μg/mL a los 6 nuevos tubos. Previamente caliente a 37 ° C.
- Cambiar el medio con 0,5 mL de medio de cultivo completo (fila 1 y 2). Para la tercera fila, agregar 0,5 mL de medio de cultivo completo suplementado con 50 μg/mL de cicloheximida ( figura 1B).
Nota: Tratamiento de la cicloheximida se ha establecido como el mejor control negativo para proteína puromycilation debido a su capacidad para bloquear la elongación de la traducción. Debido a incorporación de puromicina requiere elongación de la traducción, cicloheximida tratamiento conduce a una pérdida de puromycilated proteína señales 5 , 18. - Incubar por 15 min a 37 ° C (5% CO 2).
- Añadir 0,5 mL del medio de puromicina preparado en el paso 1.2 para la segunda fila para obtener concentraciones finales de 0, 2.5, 5, 7.5, 10 y 15 μg/mL, respectivamente, en las columnas A, B, C, D, E y f el. Al mismo tiempo, Añadir 0,5 mL de puromicina al medio suplementada con cicloheximida (paso 1.3) en la tercera fila ( figura 1).
- Incubar 5 min a 37 ° C (5% CO 2).
- Añadir 0,5 mL del medio de puromicina preparado en el paso 1.2 a la primera fila para obtener concentraciones finales de 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 y 15 μg/mL ( figura 1).
- Incubar 5 min a 37 ° C (5% CO 2).
- Lavar cada una de las filas 1 a 3 con 1 mL de helado 1 X tamponada fosfato solución salina (PBS) 5 min después de la adición de puromicina en los pocillos de la fila primera (colada dos veces). Añadir 75 μl de tampón de X Laemmli 1 (4% sodio dodecil sulfato (SDS), 4% 2-Mercaptoetanol, 0.120 M Tris HCl pH 6.8, 0.004% azul de bromofenol y un 10% de glicerol) para obtener Lisados celulares para cada condición de.
- Carrera 10% electroforesis en gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando 1/3 de las muestras preparadas para evaluar la incorporación de puromicina.
- Determinar el nivel de incorporación de puromicina por análisis de Western blot utilizando un anticuerpo anti-puromicina (12 D 10) diluido en una proporción de 1: 25,000 en tampón de incubación del anticuerpo primario (2% albúmina de suero bovino (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 y 0.01% azida de sodio).
Nota: Imágenes representativas correspondientes a células diferentes extractos de línea como se describe en el paso 1 se muestran como ejemplos en la figura 2.
- Determinar el nivel de incorporación de puromicina por análisis de Western blot utilizando un anticuerpo anti-puromicina (12 D 10) diluido en una proporción de 1: 25,000 en tampón de incubación del anticuerpo primario (2% albúmina de suero bovino (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 y 0.01% azida de sodio).
2. En Cellulo Localizada traducción de visualización
Nota: se utilizó la técnica descrita aquí para evaluar traducción localizada en SICs en células MRC-5 durante el proceso de adhesión 5. Aunque las células MRC-5 se usan aquí, pueden utilizarse otras líneas celulares con la misma metodología descrita en el paso 2.1.
- Preparación de la célula.
- Separar MRC-5 células en 0.25% tripsina/2,21 mM ácido etilendiaminotetracético (EDTA) de Hank ' s solución sal balanceada (HBSS). Sedimenten las células por centrifugación (5 min a 200 x g) en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL y suspender en Dulbecco ' s medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS) 40.000 células/ml después de contar con una cámara de conteo.
- Incubar las células suspendidas a 37 ° C bajo rotación suave usando un agitador de tubo por 20 min para mantener en suspensión.
Nota: Este paso es vital para permitir la completa disociación de los complejos de adhesión focal. - Placa 2 mL de suspensión células MRC-5 (40.000 células/mL) en dos platos de fondo de cristal de 35 mm. Utilice el primer plato de fondo de cristal de 35 mm para el ensayo de puromycilation (ver paso 2.1.5) y utilizar la segunda como un control negativo (ver paso 2.1.6).
- Mantener las células a 37 ° C (5% CO 2) por 55 min permitir la adhesión celular y SIC formación.
- Puromicina agregar al medio en los platos de fondo de cristal de 35 mm (ensayo), utilizando la concentración previamente definida en la sección 1. Para el tratamiento de las células MRC-5, use 10 puromicina μg/mL durante 5 minutos a 37 ° C (5% CO 2).
- Como un control negativo, añadir cicloheximida al segundo plato de fondo de cristal de 35 mm 40 min después de la siembra de las células para tratarlas previamente con cicloheximida 50 de μg/mL ( figura 2B). Luego, 15 minutos después de la adición de cicloheximida, añade puromicina al medio utilizando al mismo tiempo de incubación y concentración como en el paso 2.1.5 (p. ej., uso 10 μg/mL de puromicina durante 5 minutos a 37 ° C (5% CO 2) por MRC-5).
- Lave cada plato dos veces con 2 mL de helado 1 X PBS y fijar las células con 1 mL de formaldehído al 4% (diluido en 1 X PBS) durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
PRECAUCIÓN: Paraformaldehido debe utilizarse estrictamente en una campana química.
- Immunostaining.
- Tras fijación de paraformaldehido, lavar tres veces con 2 mL de 1 X PBS e incubar en 500 μl de PBS-TritonX-100 (0,5%) por 20 min a temperatura ambiente para permeabilizar las células.
- Para evitar la Unión de anticuerpos no específicos, bloquean la muestra con 500 μl PBS – BSA (1%) por 20 min a TA.
- Lavar tres veces con 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e incubar con 300 μL de 1:12,500 de anticuerpos anti-puromicina (12 D 10) diluida en 1 X PBS para 1 h a TA.
- Lave 3 veces con 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e incubar con 300 μL de anti-ratón IgG conjugado con un fluoróforo (aquí, 488 nm) diluido en PBS para visualizar puromycilated polipéptidos y con phalloidin-conjugado a otro fluoróforo (aquí, 555 nm) para visualizar la F-actina. Incubar durante 1 h a RT.
- Lavar tres veces con 2 mL de PBS-Tween20 (0.1%) y luego incubar 5 min a temperatura ambiente en 300 μL de PBS-Tween20 (0.1%) suplementado con 1 μg/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Lavar tres veces con 2 mL de PBS-Tween20 (0.1%) y luego lavar con 2 mL de 1 X PBS. Evitar que las células de secado, manteniendo la muestra en 2 mL de 1 X PBS durante la adquisición de la imagen.
3. Adquisición de imagen inmunofluorescente
Nota: la siguiente metodología se puede utilizar con cualquier sistema de imagen confocal disponible en el mercado.
Configuración- determinar el apropiado para cada fluoróforo para aprovechar al máximo el rango dinámico para la cuantificación.
Nota: Representante cuantificación sólo puede obtener si se evita la saturación de píxeles y el umbral de señal se ajusta correctamente. Esta configuración puede ser logrado ajustando cuidadosamente la energía del laser, alto voltaje (HV), ganancia, y el desplazamiento. Factor de- ajuste el zoom (5 X) y el número de píxeles (512 x 512) para optimizar el tamaño del pixel.
Nota: Esto debe ser por lo menos 2.3 - veces más pequeño que la resolución óptica, según el teorema de Nyquist. - Disminuir la velocidad de escaneo (12.5-20 μs/pixel) y promedio (2 - 3 veces) para mejorar la relación señal a ruido según la configuración mencionada.
- ajuste el zoom (5 X) y el número de píxeles (512 x 512) para optimizar el tamaño del pixel.
- Manualmente determinar el más apropiado e inferior planos focales a lo largo del eje z con el tamaño de paso óptimo (0,4 μm/slice).
Nota: El plano del tamaño de paso es determinado por la resolución axial dividida por 2,3, según el teorema de Nyquist. Por lo general, son necesarias para cubrir la profundidad de toda la célula de células adherentes capas de 20-25. - Adquirir una imagen confocal de una sola célula entera con un objetivo de inmersión de aceite X Plan Apo 60 (apertura numérica 1.42).
4. Cuantificación de imagen inmunofluorescente
- determinación del enriquecimiento.
- Abra una imagen correspondiente a la capa z-plano de interés desde el archivo de datos de celular adquirida utilizando el software ImageJ (freeware disponible en http://fiji.sc).
- Dibujar una línea usando la herramienta de línea de dibujo (barra de herramientas → recto) a través de las regiones de la celda donde se desea la cuantificación. Modificar el ancho de la línea haciendo doble clic en " recta; " los valores de intensidad se media a través de la anchura de la línea (a las 8 en la figura 3).
Nota: Una línea más delgada es preferible para evitar la superposición de la señal de diferentes estructuras. - Después de la línea correctamente, perfil de la densidad de la señal en el eje determinado (barra de menús → análisis → Perfil de parcela).
Nota: Nuevo se abrirá una ventana que muestra un perfil correspondiente a la intensidad de la señal de cada píxel del canal seleccionado (fluoróforo específico) a lo largo de la línea de la sección seleccionada del plano z.- Repetir el proceso para cada canal corresponde al fluoróforo utilizado (es decir, una cuantificación de 488, uno para 568 y uno de 405).
Nota: El valor de la intensidad de la señal siempre se ordenará siguiendo la orientación de la línea dibujada.
- Repetir el proceso para cada canal corresponde al fluoróforo utilizado (es decir, una cuantificación de 488, uno para 568 y uno de 405).
- Para obtener los valores numéricos escala de gris de cada píxel del perfil correspondiente a las cuantificaciones de la capa seleccionada del plano z, copiar los datos del perfil (barra de menús en la ventana de la imagen → Copy) y pegar en cualquier programa de hoja de cálculo. 4.1.1-4.1.4
- Repita los pasos para cada sección del plano z de la imagen confocal adquirida y cada canal que se desee cuantificación.
Nota: La cuantificación de diferentes capas de plano z puede combinarse para obtener una evaluación general del enriquecimiento especial de la señal de calculando el valor de la suma de cada píxel a lo largo de la línea para cada capa del plano z. Este tipo de agrupación sólo se logra si la línea es idéntica para cada capa del plano z en los valores medios. - Como un método alternativo para la cuantificación de células completas de diferentes canales con un gran número de capas, utilice la macro llamada StackprofileData (véase el Archivo suplementario).
Nota: Esta macro es accesible libremente en https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt y puede ser utilizada como sigue:- pega la macro en un archivo de texto y guardar todo
- Abrir el archivo de imagen que incluye todas las capas confocales de la célula.
- Dibujar una línea, como se describe en el paso 4.1.2, abrir una nueva ventana para importar la macro (barra de menús → Plugins → Macros → ejecutar), elegir el archivo de texto guardado anteriormente correspondiente a la macro StackprofileData y haga clic en " abierto "
Nota: Después de la importación de macro, una nueva ventana llamada " resultados " se abrirá y todos la cuantificación a lo largo del eje determinado se mostrará para cada plano z capa y canal presentes en los archivos de imagen. - Copiar los datos para cada canal (barra de menú → editar → copia) para obtener la representación gráfica del perfil correspondiente a las cuantificaciones de la señal. Pegar en cualquier programa de hoja de cálculo. Calcular el valor de la suma de cada canal de cada pixel a lo largo de la línea para cada capa del plano z. Use estos valores para crear una representación gráfica similar a la que se presenta en la figura 3.
- Cuantificación de la señal en un área designada para celular o.
- Abrir el archivo de imagen con el software ImageJ.
- Dibujar un área para denotar el área de interés con la función de la forma geométrica (barra de herramientas → " rectángulo, " " oval, " o " polígono ").
Nota: Se determinará el valor de cuantificación para el área correspondiente a la forma dibujada. - Ajustar el nivel de umbral para evitar cualquier señal de fondo (menú → ajuste de la imagen → umbral); aparecerá una nueva ventana para representar las intensidades de píxeles en forma de histograma. Cambiar los valores para incluir/excluir los píxeles de la cuantificación mediante el control deslizante. Seleccionar un umbral que elimina píxeles rojos fuera de la célula, como píxeles resaltados en rojo serán incluidos en la cuantificación.
- Definir los parámetros de medición para cuantificar la señal de píxeles dentro de la zona seleccionada, sin señal de fondo (menú → analizar → establecer medidas) y asegúrese de comprobar la " límite umbral " y la " densidad integrada " cajas de.
- Medir los valores cuantitativos del área seleccionada (barra de menús → análisis → medida).
Nota: La cuantificación de intensidad de señal se presentará en una ventana nueva en la " IntDen " identificación, que representa el producto de los valores promedio de gris y el número de píxeles dentro de la zona seleccionada. - Dibujar un área que incluye a toda la célula mediante una forma geométrica (barra de herramientas → " rectángulo, " " oval, " o " polígono ") y proceder con los pasos 4.2.3-4.2.5 para obtener un valor correspondiente a la señal total. Calcular el cociente de la señal dentro de la zona seleccionada sobre toda la señal para obtener el porcentaje de la señal dentro del área de interés.
- Repetir pasos 4.2.2-4.2.6 para obtener la cuantificación del volumen de la célula para cada plano z. Adaptar la forma geométrica según sea necesario.
- Copiar y pegar los datos obtenidos de la " resultados " windows para cada capa del plano z en una hoja de cálculo para la representación gráfica y para encontrar un valor medio.
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Representative Results
Para observar con precisión eventos de traducción mediante la incorporación de puromicina, es fundamental para determinar las condiciones óptimas para cada línea celular porque cada uno demuestra diferentes puromicina incorporación cinética (figura 1)9,11 ,12,18. Por lo tanto, para validar la incorporación de puromicina, es necesario tratar la línea celular deseada con una gama estandarizada de aumentar las concentraciones de puromicina (1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 y 15.0 μg/mL) para diferentes periodos de tiempo (5 y 10 min). Evaluar la traducción localizada o una respuesta temprana al tratamiento farmacológico, es un tiempo de incubación más corto preferido (por ejemplo, menos de 5 minutos), que permite la evaluación directa de los acontecimientos traslacionales inmediatamente después de un tratamiento específico. Idealmente, la señal de puromicina debe ser fácilmente perceptible pero también debe evitar el punto de saturación (figura 2). Como se muestra en la figura 2 (paneles de la izquierda), una concentración aceptable puromicina es 7.5-10.0 μg/mL para el MRC-5 y HeLa, mientras que sugiere para Huh-7 5.0-7.5 μg/mL de puromicina. Optimización de los parámetros experimentales es crucial porque el objetivo de este método no es completamente inhiben elongación traduccional todos en el momento de la iniciación sino a nuevas cadenas del polipéptido sintetizado durante la traducción para detectar aguda variaciones en la traducción. Esta fase inicial en el Protocolo no debe ser puromicina desatendidas, como la excesiva disponibilidad y tiempo de tratamiento prolongado causará importantes consecuencias no deseadas. Como se observa en la figura 2 (paneles de la derecha), las células tratadas por 10 min con una concentración alta de puromicina generará sobre todo más pequeño polipéptidos puromycilated (p. ej., Huh-7, 7.5 μg/mL o más durante 10 minutos). Estos polipéptidos más pequeños se difunden más rápidamente en la célula, que puede interferir con la evaluación con precisión de localización subcelular. Otro problema es que ese aumento de la proteólisis ocurre con puromicina excesivo tratamiento19. Este resultado fue observado en células MRC-5 y HeLa tratadas durante 10 min, que demostró la intensidad de señal disminuida en presencia de 10 o 15 μg/mL de puromicina. Estos fenómenos son engañosos si incorporación puromicina se evalúa por inmunofluorescencia ya que mayor difusión impide la visualización precisa de la localización de la traducción, mientras que disminuye enormemente la degradación inducida por la puromicina sensibilidad de detección. Estas consecuencias no deseadas son fácilmente evitadas por definir adecuadamente las condiciones experimentales óptimas, como se describe en la sección 1 del Protocolo.
Mientras visualizas incorporación de puromicina, también es importante realizar controles adecuados. Como se muestra en la Figura 3A, incorporación de puromicina puede bloquearse eficazmente mediante la adición de cicloheximida de 50 μg/mL, un compuesto conocido por inhibir la traducción elongación20 y así la incorporación de puromicina. Este comportamiento se muestra en la figura 3B, que demuestra que tratamiento cicloheximida prevenir eficientemente la mayor parte de la señal correspondiente a incorporación de puromicina en células MRC-5 adherentes. De hecho, mientras que los péptidos puromycilated se pueden visualizar en las células tratadas con puromicina solamente, se detecta una señal débil en células que fueron también tratadas con cicloheximida en idénticas condiciones de tinción. Por otra parte, otro antibiótico (anisomycin) puede usarse como un control negativo, ya que tiene la capacidad de bloquear la peptidil transferasa actividad5 y ha demostrado ser tan eficiente como cicloheximida en bloqueo incorporación de puromicina5 ,18
Adquisición de imagen inmunofluorescente, es posible evaluar la localización general de polipéptidos puromycilated correspondiente a recién sintetizado las proteínas (figura 4). Se seleccionan las capas de imagen a diferentes profundidades dentro de las células adherentes, permitiendo que la intensidad de la señal en compartimientos subcelulares a evaluarse en planos diferentes de la célula. Como tal, es posible comparar la reacción de puromycilation localizada en la parte inferior de la célula (Figura 4A), el centro de la célula (Figura 4B), o la parte superior de la célula (figura 4). Situado ligeramente por encima de las estructuras de adhesión nacientes y maduros, SICs se observan sobre todo en el centro de la célula. Como era de esperar, puromycilation intenso se detecta en el SICs, sugiriendo que la traducción del mRNA es aislado a estas estructuras subcelulares. Como se mencionó anteriormente, es posible comparar la intensidad de la señal a lo largo de un eje deseado. Esta comparación sólo es posible si las imágenes adquiridas no incluyen pixeles saturados, que aparezcan en rojos en la imagen en escala de grises (segundo paneles de la parte superior) obtienen con el microscopio, software de operación. Estas imágenes se pueden importar en el software ImageJ para cuantificación y análisis de la intensidad del pixel a lo largo de un eje designado. La cuantificación de pixel puede representarse gráficamente (panel central) para ilustrar la intensidad de píxeles relativa en las posiciones designadas en el eje. Un vistazo a la inserción en los paneles superiores muestra límites de SIC-actina (en rojo) y una señal verde dentro de la estructura que corresponde a eventos de traducción altamente activa, que se enriquecen dentro de estas estructuras (sección inferior). Aunque este método de cuantificación no es la mejor manera de determinar el porcentaje exacto de la traducción total que ocurre en estas estructuras, es visualmente informativo por lo que permite la evaluación rápida de la intensidad de la señal y es una buena aproximación de la distribución de señal a lo largo de la célula.
Para obtener una distribución cuantitativa de la señal a lo largo de la célula entera, debe utilizarse otro método. Como se muestra en la figura 5, uno de los pasos clave es denotar las áreas de interés que deben cuantificarse para cada plano z componen los archivos de imagen confocal. Esta tarea puede lograrse utilizando una herramienta de dibujo diferentes en ImageJ. Usando este método, es posible cuantificar un área única o múltiples áreas, que pueden entonces comparadas, restar o incluso compiladas. Las principales dificultades son: (i) encontrar la proyección de imagen óptima condiciones que evitar la saturación de píxeles y señal de fondo, que puede tergiversar el valor cuantitativo de la señal obtenida y (ii) establecer una óptima calibración del umbral en ImageJ. Asumiendo que ambas de estas condiciones son óptimas, este método de cuantificación es altamente reproducible permaneciendo fáciles de realizar. Antes de la adquisición de la imagen, también es importante determinar cuidadosamente los límites inferiores y superiores de los planos de z de la celda seleccionada para la cuantificación. En el caso presentado en la figura 4, la sección inferior se corresponde con el límite de resolución del objetivo, que a menudo incluye contaminantes fluorescencia evanescente, que puede disminuir la relación de señal de cuerpo celular SIC. Como se mencionó anteriormente, SICs están involucrados en la formación de adherencias sitio y maduración; por lo tanto, estructuras SIC se encuentran ligeramente arriba recién formando complejos de adhesión, que excluye la fluorescencia evanescente de las capas de más abajo. Así, la señal de puromycilation SIC enlazado es apenas visible en las secciones inferiores, mientras que claramente podemos obsErve en la sección media, explicando la mayor proporción de cuerpo SIC/celular señal en la región media en comparación con los planos superiores o inferiores.
Figura 1. Representación experimental de la optimización del tratamiento de puromicina que se describe en la sección 1.
(A) una representación de 24 pocillos de células ser sembradas para el experimento (paso 1.1). (B) representación esquemática de paso 1.4 que muestran el cambio medio en las filas 1 y 2 de la placa de 24 pocillos y la adición de cicloheximida (CHX) en cada pocillo de la tercera fila para una concentración final de 50 μg/mL. (C) representación esquemática del tratamiento puromicina en la segunda y tercera filas (criterio 1.6) 15 min después paso 1.4. (D) representación esquemática del tratamiento puromicina en la primera fila (paso 1.8) 5 min después de paso 1.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Determinación de las condiciones óptimas para la incorporación de puromicina.
Extraiga el análisis Western blot de la célula entera de (A)MRC-5, (B) Huh-7 y las células HeLa (C) , se incubaron con el aumento de las concentraciones de puromicina (0, 2,5, 5, 7.5, 10 y 15 μg/mL) durante un período de 5 minutos (paneles de la izquierda) o 10 minutos (a la derecha paneles). Puromycilated péptidos fueron detectadas usando un anticuerpo contra puromicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Inhibición de la puromycilation con cicloheximida.
(A) Western blot mostrando el efecto de cicloheximida en un ensayo de 5-min puromycilation. Eficacia de la incorporación en MRC-5, Huh-7 y células HeLa después de mock (PBS 1 X) o tratamiento de cicloheximida. (B) imagen Confocal mostrando el efecto de cicloheximida en incorporación de puromicina. Células MRC-5 fueron previamente tratadas con PBS (falso) o cicloheximida durante 15 min y luego suplidas con 10 μg/mL de puromicina + PBS 1 X (panel izquierdo) o 10 μg/mL de puromicina + 50 μg/mL de cicloheximida (panel derecho) para las proteínas de Puromycilated 5 minutos fueron detectados utilizando un anticuerpo contra la puromicina (verde). F-actina fue detectada usando phalloidin (rojo), y el núcleo fue teñido con DAPI (azul). Inserta a la derecha corresponde a un aumento de 2.5x de la caja blanca. Barras = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Cuantificación de la actividad traslacional en SICs en células MRC-5 adherentes.
(A-C) Representante de imagen confocal de células MRC-5 adherentes tratada con 10 puromicina μg/mL durante 5 minutos. Las imágenes presentadas corresponden a la parte inferior (A), medio (B)y superior (C) partes de la célula. Los paneles superiores muestran las proteínas puromycilated detectadas utilizando un anticuerpo contra la puromicina (verde). F-actina fue detectada usando phalloidin (rojo), y el núcleo fue teñido con DAPI (azul). Inserta a la derecha corresponde a un aumento de 2 x de la caja blanca. Barras = 10 μm. Los paneles medios demostración la ausencia de pixeles saturados, que habría sido resaltado en rojo. Los paneles inferiores muestran una representación gráfica de puromycilated enriquecimiento de proteína en un adherente células MRC-5 comparando la intensidad de la señal de puromicina (verde), F-actina (rojo) y DAPI (azul) en el eje de la célula indicada por la flecha blanca. (D-F) Las imágenes presentadas corresponden a la 4.4 x insertar aumentos de lo SICs presentado en (A-C). La cuantificación muestra la frontera SIC (picos rojo: actina), así como traducción localizada en el SICs (verde de picos: puromicina) en el más bajo (D), el centro (E), y las regiones superiores (F) de la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Cuantificación de la señal de celulares de proteínas puromycilated en células MRC-5 adherentes.
(A) determinación de la señal en diferentes áreas de la capa de fondo plano z de un adherente células MRC-5. (Panel izquierdo) Selección del área (I) que abarca la totalidad de la célula para obtener un valor cuantitativo correspondiente a la señal celular total para esta capa z-plane. (Panel del medio) Selección de la zona celular correspondiente al núcleo y la porción citoplasmática que no incluye SIC (II). (Panel derecho) Visualización de la zona correspondiente al SICs (III) restando el valor obtenido del área II del valor obtenido para la célula entera (zona I). Barras = 10 μm. (B) valores de los píxeles cuantitativa para cada área se enumeran en la tabla de la imagen que representa a la selección de áreas en (A), seguido por un gráfico que muestra la proporción (%) de señal en SICs. (C) determinación de la señal en diferentes áreas de la capa de plano z media de un adherente células MRC-5. (Panel izquierdo) Selección de la zona (I) que abarca la totalidad de la célula para obtener un valor cuantitativo correspondiente a la señal celular total para esta capa z-plane. (Panel del medio) Selección de la zona de la célula correspondiente para el núcleo y la porción citoplasmática que no incluye SIC (II). (Panel derecho) Visualización de la zona correspondiente al SICs (III) restando el valor obtenido para el área II del valor obtenido para la célula entera (zona I). (D) valores de los píxeles cuantitativa para cada área se enumeran en la tabla de la imagen que representa a la selección de áreas en (C), seguido por un gráfico que muestra la proporción (%) de la señal encontrada en SICs. (E) determinación de la señal en diferentes áreas de la capa superior del plano z de un adherente células MRC-5. (Panel izquierdo) Selección de la zona (I) que abarca la totalidad de la célula para obtener un valor cuantitativo correspondiente a la señal total de la célula de esta capa del plano z. (Panel medio) la selección de la zona de la célula correspondiente para el núcleo y la porción citoplasmática que no incluye SICs (II). (Panel derecho) Visualización de la zona correspondiente al SICs (III) restando el valor obtenido para el área II del valor obtenido para la célula entera (zona I). (F) valores de los píxeles cuantitativa para cada área se enumeran en la tabla de la imagen que representa a la selección de áreas en (E), seguido por un gráfico que muestra la proporción (%) de la señal encontrada en SICs. (G) valores de cuantificación de todas las capas del plano z de la célula que se presenta arriba, incluyendo uno calculado para z-planos presentados en el A (z = 1), C (z = 9) y E (z = 19), que se resaltan en rojo sobre la mesa. (H) representación gráfica del porcentaje de la señal encontrado en SICs en todo el volumen de toda la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Avances tecnológicos recientes han permitido una mejor comprensión de los mecanismos implicados en el upregulation traslacional o la represión de los mRNAs específicos en procesos biológicos, como metástasis, respuesta de la droga y desarrollo neuronal. La metodología rentable aquí descrita permite eventos de traducción para ser visualizados en las células para el estudio de cómo las proteínas RNA-que ata regulan procesos metastásicos, como la adhesión celular, la migración y la invasión.
Aunque se han desarrollado numerosos métodos para evaluar la traducción de proteínas de novo , todos ellos comparten la misma estrategia, en el que el polipéptido alarga incorpora aminoácidos modificados etiquetados una molécula detectable. El primero de estos métodos se basa en 35incorporación radiactiva S arginina en la proteína recientemente traducida. Aunque es eficiente para la comparación de las tasas generales de traducción bajo condiciones específicas, el uso de aminoácidos radiactivos hace este método atractivo para la mayoría de equipos de investigación. Por lo tanto, el desarrollo de métodos utilizando etiquetas no radiactivo, como puesta de sol, Click-it, o el enfoque de truco, ofrece nuevas oportunidades para evaluar y observar en vivo eventos de traducción. Aunque ingeniosa, la mayoría de estos métodos sólo permite la evaluación de eventos de traducción tras tratamiento farmacológico o eventos celulares específicos usando un cDNA exógeno específico construcción de los objetivos específicos, limitar los experimentos objetivos ya identificados . Esto es cierto para el truco enfoque4, que permite la regulación traduccional de un solo objetivo de mRNA expresado exógenamente para evaluarse. Aunque se permite para la validación de la activación traslacional de mRNAs endógena, el tiempo de incubación mínimo de método de "Click-IT" para la incorporación de la AHA es al menos 1 h13, que es considerado demasiado largo para los mecanismos de traducción más agudos.
Aunque muy versátil y fácil de configurar, el método aquí descrito requiere seguir los pasos críticos en la fase inicial del protocolo. Como se muestra en los resultados representativos, diferentes líneas celulares tendrán cinética de incorporación de diferentes puromicina, que simplemente puede ser debido a la tasa metabólica de cada línea celular, como parece ser el caso de5,de las células MRC-521. De hecho, las células no transformadas no son como proliferativas como HeLa, y por tanto, la renovación total de la proteína es menos robusta que en las células transformadas. Esto debe tenerse en cuenta cuando se utiliza el protocolo. Por consiguiente, la primera parte del protocolo es fundamental para el resto del método. Determinar cuidadosamente la concentración de puromicina y la duración de incubación permitirá una mejor evaluación de la traducción que ocurre durante el experimento. Como se mencionó anteriormente, el tratamiento con una cantidad excesiva de puromicina aumenta el ratio de puromycilated pequeños polipéptidos y parece estimular la proteólisis, que fácilmente podría conducir a una interpretación errónea de que normalmente ocurren eventos traslacionales19 . Como regla general, cuanto más el tiempo de incubación, el menos puromicina es necesaria, mientras que un tiempo más corto de incubación requiere una mayor concentración de puromicina. El tiempo de concentración puede ser adaptado a las particulares limitaciones experimentales.
Los métodos presentados aquí son altamente adaptables y pueden modificarse fácilmente según el tratamiento aplicado o el biológico proceso estudiado. Incorporación de puromicina permite la evaluación rápida de los cambios en la cinética de la traducción durante un período corto de tiempo, mientras que el método de cuantificación proporciona imágenes altamente informativos de eventos celulares. Aunque poderosos, estos métodos tienen limitaciones que deben considerarse. Puromicina se incorporarán a las proteínas recién sintetizadas de los mRNAs que activamente se traducen. Por esta razón, el método de puromycilation descrito aquí puede no ser adecuado para el estudio objetivos específicos (es decir, solo mRNAs), pero es ideal para obtener una visión general de la actividad traslacional dentro de una sola célula o una población celular. Como se mencionó anteriormente, excesiva puromicina tiene grandes inconvenientes, y deben definirse cuidadosamente puromicina dosificaciones y tiempos de tratamiento, como propuesta en el protocolo. De hecho, como se muestra en la figura 2, la disponibilidad de puromicina excesiva resultará en la formación de pequeños polipéptidos de puromycilated que difunden más rápidamente en la célula, llevando a datos inexactos localización subcelular. Además, aumento de la proteolisis se sabe para ocurrir después de puromicina excesivo tratamiento19, un efecto que podría resultar en una pérdida completa de la señal.
Aunque no tan específica como los métodos de truco o Click-it, el enfoque propuesto aquí es muy accesible y permite la evaluación rápida de cambios generales en la cinética de la traducción. Incluso si otros métodos son los más adecuados para aplicaciones específicas, ensayos de incorporación de puromicina pueden realizarse como un control suplementario. De hecho, si el experimento tiene que mostrar que un objetivo específico del ARNm es la única afectada en una condición particular, es necesario mostrar que esto no es causado por un aumento general en la traducción. Como tal, incorporación de puromicina negativo podría proporcionar evidencia para este caso. Además, este método es idóneo para observar cambios generales en las tasas de traducción. Por lo tanto, puede ser utilizado para mostrar un mecanismo de represión de traducción, como en el caso de la formación del gránulo de estrés9, o para validar si tratamiento de cicloheximida en la fase inicial de traslacional fraccionamiento complejo bloquea eficientemente alargamiento22. También es importante mencionar que, aunque los métodos de cuantificación descritos en las secciones 2.3 y 2.4 se refieren a experimentos centrándose en la coloración de la puromicina, que podrían ser aplicados a cualquier tipo de coloración compartimentado usando varios tipos de fluoróforos. De hecho, estos métodos de cuantificación podrían ser utilizados para cuantificar la distribución celular de una molécula o proteína y pueden incluso validar la localización de un blanco en un compartimiento subcelular específico.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canadá) para la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a la unidad de la proyección de imagen del celular del centro de investigación para su asistencia técnica. É M. Huot es becario de investigación Junior 1 de Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Este trabajo fue financiado por los institutos canadienses de salud investigación (concesión número CIHR, RP-286437 a M.-É. Huot).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
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