Summary
Detta manuskript beskriver en metod för att visualisera och kvantifiera lokaliserad översättning händelser i subcellulär fack. Den strategi som föreslås i detta manuskript kräver en grundläggande confocal bildsystem och reagenser och är snabbt och kostnadseffektivt.
Abstract
De mekanismer som reglerar mRNA översättning är inblandade i olika biologiska processer, såsom germ line utveckling, celldifferentiering och organogenes, liksom i flera sjukdomar. Talrika publikationer har övertygande visat att särskilda mekanismer tätt reglera mRNA översättning. Ökat intresse för översättning-inducerad regleringen av proteinuttryck har lett till utvecklingen av nya metoder att studera och följa de novo proteinsyntes i cellulo. De flesta av dessa metoder är dock komplexa, vilket gör dem dyra och ofta begränsa antalet mRNA mål som kan studeras. Detta manuskript föreslår en metod som kräver endast grundläggande reagenser och en confocal fluorescens imaging system att mäta och visualisera de förändringar i mRNA översättning som sker i någon cellinje under olika förhållanden. Denna metod användes nyligen till att Visa lokaliserad översättning i vidhäftande celler subcellulära strukturer under en kort tid, vilket ger möjligheten att visualisera de novo översättning för en kort period under en mängd biologiska processer eller validera förändringar i translationell aktivitet som svar på specifika stimuli.
Introduction
Regleringen av översättning av olika cellulära funktioner har föranlett många forskargrupper att utveckla nya verktyg och metoder för att bestämma subcellulär lokalisering av mRNA översättning och reglerade proteinsyntes1,2 ,3,4. Dessa senaste tekniska framsteg möjliggör en bättre förståelse för de mekanismer som omfattar översättning uppreglering eller förtryck av specifika mRNA under biologiska processer, såsom neuronal utveckling, narkotika svar och metastas5 ,6,7,8. Men kräver de flesta av dessa metoder dyra eller farliga reagenser och särskild utrustning som inte kanske är tillgängliga för de flesta laboratorier. Som sådan, utvecklades en kostnadseffektiv metod för snabb bedömning av översättning händelser för att specifikt kringgå dessa potentiella problem. Denna metod upptäcker akut translationell modulationer som inträffar under specifika cellulära processer och tillåter också för lokalisering av översättning använder konfokalmikroskopi.
Metoderna som beskrivs här användes för att övervaka lokaliserad Översättning inom subcellulär fack kallas fördelande inledande centers (SIC)5. SICs är övergående strukturer finns i seedade celler som är lokaliserade ovanpå begynnande vidhäftning komplex. Även om SICs och vidhäftning komplex är distinkta, är deras öden nära förbundna. SICs är faktiskt kända att gradvis försvinna vid fokal vidhäftning komplexa mognad in en vidhäftning webbplats under den inledande fasen av vidhäftning. Vi fann att RNA-bindande proteiner kända för att specifikt styr mRNA översättning (t.ex. Sam68, FMRP och G3BP1) och polyadenylated RNAs berikades inom dessa strukturer5. Använder de metoder som beskrivs här, visade vi att regleringen av SIC-associerade mRNA översättning fungerar som en kontrollpunkt som möjliggör seedade celler för att konsolidera celladhesion. Denna metod, baserad på puromycin införlivande, kunde anses en anpassad version av den ytan avkänning av översättning assay (solnedgång). Protein puromycilation utvecklades ursprungligen för att mäta globala proteinsyntes priser med hjälp av en icke-radioaktivt märkt aminosyra, och erbjuder ett effektivt sätt att visualisera de novo proteinsyntes9. Denna metod förlitar sig på puromycin, ett antibiotikum som blockerar översättning genom för tidig kedjeavbrott i Ribosomen10inneboende beteende. Puromycin är faktiskt strukturliknande till tyrosyl-tRNA, som tillåter för iblandning i elongating peptidkedjor via bildandet av en peptidbindning. Puromycin bindning till en växande kedja peptid förhindrar emellertid en ny peptidbindning bildas med den nästa aminoacyl-tRNAen, eftersom puromycin har ett icke-hydrolyserbar amide band i stället för den hydrolyserbar ester bond Funna i tRNAs. Således, införlivandet av puromycin i elongating polypeptider resultat i förtida frisläppandet av många trunkerade puromycilated polypeptider motsvarar aktivt översatta mRNA9,11,12 .
Med den här metoden, det var möjligt att bedöma aktiv Översättning inom en kort tid änka (t.ex. 5 min) under cellulär adhesion med hjälp av en specifik antikropp riktad mot puromycin på celler som kompletterades med antibiotika för 5 minuters perioder bearbeta5vid olika tidpunkter under celladhesion. Precisionen i denna analys bygger på mycket specifika antikroppar riktade mot den puromycilated delen. Immunofluorescerande upptäckt av den puromycilated polypeptiden ger en allmän subcellulär fördelningen av nyligen översatt mRNA, som också kan kvantifieras med stor noggrannhet med confocal bildsystem.
Därför erbjuder denna metod ett relevant alternativ för ett stort antal laboratorier studerar translationell reglerande mekanismer som är inblandade i processer såsom neuronala granulering6,13,14, 15, morphogen mRNA lokalisering och översättning under utveckling16,17. Det är också väl lämpad att studera lokaliserade eller konkurrensbetingat översättning under snabba biologiska händelser, såsom cellmigration, vidhäftning eller invasion, eller helt enkelt bedöma läkemedelsbehandlingar som kan inducera translationell ändringar5, 7 , 18. Sammantaget denna metod möjliggör visualisering av lokaliserade eller kontrollerad översättning händelser på en snabb, exakt och kostnadseffektiv sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bestämning av Puromycilation villkor
Obs: denna teknik beskriver den metod som används för att bedöma lokaliserad översättning under i MRC-5 cell adhesion processen 5. Som puromycilation kan göras i någon cell, är det viktigt att optimera puromycilation villkoren för de särskilda cellinjer som ska användas, eftersom de behandling villkor inte är identiska för varje cell linje när det gäller puromycin koncentrationen och önskad inkubationstiden. För att visa hur dessa villkor definieras, tre exempel cellinjer (dvs. HeLa, MRC-5 och Huh-7) behandlades med ökande koncentrationer av puromycin för olika inkubationstider ( figur 1).
- Växa identiska antalet celler i ett 24-väl plåt i 0,5 mL av den lämpliga komplett odlingsmedium 16 h före provningen. Utsäde 30.000 MRC-5 celler, 50.000 HeLa cells eller 50.000 HuH-7 celler per brunn. Se till att undvika att överskrida 60-70% sammanflödet (figur 1A).
- Förbereda 6 slangar med 1,5 mL komplett cellodlingsmedium med ökande koncentrationer av puromycin (0, 5, 10, 15, 20 och 30 µg/mL). Pre varma vid 37 ° C.
- För varje koncentration av puromycin medium (beredd i steg 1.2), överföra 0,5 mL från varje röret in 6 nya rören och lägga till Kungliga Automobilklubben med en slutlig koncentration på 50 µg/mL i alla 6 nya rör. Pre varma vid 37 ° C.
- Ändra mediet med 0,5 mL av komplett odlingsmedium (rad 1 och 2). För den tredje raden, tillsätt 0,5 mL av komplett odlingsmedium kompletteras med 50 µg/mL Kungliga Automobilklubben ( figur 1B).
Obs: Kungliga Automobilklubben behandling har etablerat sig som den bästa negativa kontrollen för protein puromycilation på grund av dess förmåga att blockera översättning töjning. Eftersom puromycin inkorporering kräver översättning töjning, Kungliga Automobilklubben behandling leder till en förlust av puromycilated protein signaler 5 , 18. - Inkubera i 15 minuter vid 37 ° C (5% CO 2).
- Tillsätt 0,5 mL av det puromycin medlet bereddes i steg 1.2 till den andra raden att få slutliga koncentrationer av 0, 2,5, 5, 7,5, 10 och 15 µg/mL, respektive i kolumnerna A, B, C, D, E och F. På samma gång, tillsätt 0,5 mL av puromycin till Kungliga Automobilklubben-kompletteras medium (steg 1.3) i den tredje raden ( figur 1 c).
- Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C (5% CO 2).
- Tillsätt 0,5 mL av det puromycin medlet bereddes i steg 1.2 i första raden att få slutliga koncentrationer av 0,0 2,5, 5, 7,5, 10 och 15 µg/mL ( figur 1 c).
- Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C (5% CO 2).
- Tvätta vart väl från 1 till 3 rader med 1 mL iskallt 1 X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 5 min efter tillsats av puromycin till brunnar i den första raden (tvätta två gånger). Tillsätt 75 µL av 1 X Laemmli buffert (4% sodium dodecyl sulfate (SDS), 4% 2-merkaptoetanol, 0,120 M Tris HCl pH 6.8, 0,004% bromofenolblått och 10% glycerol) att få hela-cell lysates för varje villkor.
- Kör 10% SDS-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) med 1/3 av beredda proverna för att bedöma puromycin införlivande.
- Bestämma nivån på puromycin införlivande genom Western blot analys med hjälp av en anti puromycin antikropp (12 D 10) utspätt i förhållandet av 1:25,000 i primär antikropp inkubation buffert (2% bovint serumalbumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 och 0,01% Natriumazid).
Obs: Representativa bilder motsvarar olika cell linje extrakt gjort som beskrivs i steg 1 visas som exempel i figur 2.
- Bestämma nivån på puromycin införlivande genom Western blot analys med hjälp av en anti puromycin antikropp (12 D 10) utspätt i förhållandet av 1:25,000 i primär antikropp inkubation buffert (2% bovint serumalbumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 och 0,01% Natriumazid).
2. I Cellulo Lokaliserad översättning visualisering
Obs: den teknik som beskrivs här användes för att bedöma lokaliserad Översättning inom SICs i MRC-5 celler under den vidhäftning process 5. Även om MRC-5 celler används här, andra cellinjer kan användas med den samma metod som beskrivs i steg 2.1.
- Cell förberedelse.
- Lossa MRC-5 celler med 0,25% trypsin/2,21 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) i Hank ' s balanserad Salt lösning (HBSS). Pellet cellerna genom centrifugering (5 min vid 200 x g) i en 15 mL koniskt centrifugrör och upphäva dem i Dulbecco ' s ändrad Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) på 40 000 celler/mL efter räknar med en räknande kammare.
- Inkubera suspenderade celler vid 37 ° C under varsam rotering med en tube rotator i 20 min för att behålla dem i suspension.
Obs: Detta steg är avgörande för fullständig dissociation av fokal vidhäftning komplexen. - Tallrik 2 mL av suspenderade MRC-5 celler (40 000 celler/mL) i två 35 mm glasbotten rätter. Använd den första 35 mm glasbotten skålen för puromycilation analysen (se steg 2.1.5) och använda andra som en negativ kontroll (se steg 2.1.6).
- Hålla cellerna vid 37 ° C (5% CO 2) för 55 min att cellulär adhesion och SIC bildandet.
- Lägg till puromycin till medium i 35-mm glasbotten maträtter (assay) med hjälp av koncentrationen som tidigare definierats i avsnitt 1. För att behandla MRC-5 celler, använda 10 µg/mL puromycin för 5 min vid 37 ° C (5% CO 2).
- Som en negativ kontroll, lägga Kungliga Automobilklubben i andra 35 mm glasbotten skålen 40 min efter sådd cellerna för att förbehandla dem med 50 µg/mL Kungliga Automobilklubben ( figur 2B). Sedan 15 min efter Kungliga Automobilklubben dessutom lägga till puromycin till medium med hjälp av samma koncentration och inkubation tid som i steg 2.1.5 (t.ex. användning 10 µg/mL puromycin för 5 min vid 37 ° C (5% CO 2) för MRC-5).
- Tvätta varje platta två gånger med 2 mL iskallt 1 X PBS och fixa cellerna med 1 mL 4% formaldehyd (utspädd i 1 X PBS) under 15 minuter vid rumstemperatur (RT).
Försiktighet: PARAFORMALDEHYD strikt användas i en kemisk huva.
- Immunfärgning.
- Efter PARAFORMALDEHYD fixering, tvätta tre gånger med 2 mL 1 X PBS och inkubera i 500 µL av PBS-TritonX-100 (0,5%) i 20 min på RT att permeabilize cellerna.
- För att förhindra ospecifik antikropp bindande, blockera provet med 500 µL PBS – BSA (1%) i 20 min på RT.
- Tvätta tre gånger med 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) och inkubera med 300 µL anti puromycin antikropp (12 D 10) efter utspädning 1:12,500 i 1 X PBS för 1 h på RT.
- Tvätta 3 gånger med 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) och inkubera med 300 µL av antimus IgG konjugerat till en fluorophore (här, 488 nm) utspätt i PBS att visualisera puromycilated polypeptider och med phalloidin-konjugerad till en annan fluorophore (här, 555 nm) att visualisera F-aktin. Inkubera i 1 h på RT.
- Tvätta tre gånger med 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) och sedan Inkubera i 5 min på RT i 300 µL i PBS-Tween20 (0,1%) kompletteras med 1 µg/mL 4 ', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI).
- Tvätta tre gånger med 2 mL PBS-Tween20 (0,1%) och tvätta sedan med 2 mL 1 X PBS. Hindrar cellerna från att torka genom att hålla provet i 2 mL 1 X PBS under Bild Förvärvandet.
3. Immunofluorescerande bild förvärvandet
Obs: följande metod kan användas med alla kommersiellt tillgängliga confocal bildsystem.
- Bestämma den lämpliga inställningar för varje fluorophore att maximera det dynamiska omfånget för kvantifiering.
Obs: Representativ kvantifiering kan endast erhållas om pixel mättnad undviks och signal tröskelvärdet justeras korrekt. Dessa inställningar kan uppnås genom att noggrant justera laser kraften, hög spänning (HV), viktökning, och förskjutning.- Justera zoom faktor (5 X) och antalet pixlar (512 x 512) att optimera pixelstorlek.
Obs: Detta bör vara minst 2,3 - gånger mindre än optisk upplösning, enligt Nyquist sats. - Minska spolningshastighet (12,5-20 µs/pixel) och använder i genomsnitt (2 - 3 gånger) för att förbättra signal-brus-förhållandet enligt de inställningar som nämns ovan.
- Justera zoom faktor (5 X) och antalet pixlar (512 x 512) att optimera pixelstorlek.
- Manuellt bestämma lämpliga toppen och botten fokal plan längs z-axeln med optimal stegstorlek (0,4 µm/skiva).
Obs: Steg storlek planet bestäms av den axiella resolution dividerat med 2.3, enligt Nyquist sats. 20-25 lager är oftast nödvändigt för att täcka hela cellen djup fastsittande celler. - Skaffa en confocal bild av en hela enda cell med en 60 X planerar Apo oljeimmersionsobjektivet (1.42 numerisk bländare).
4. Immunofluorescerande bild kvantifiering
- bestämning av anrikning.
- Öppna en bild som motsvarar lagrets z-planet av intresse från förvärvade cell datafilen med hjälp av programmet ImageJ (freeware finns på http://fiji.sc).
- Dra en linje med verktyget linje ritning (Tool bar → rak) genom regioner av cellen där kvantifiering önskas. Ändra linjebredden genom att dubbelklicka på " rak; " intensitet medelvärdet kommer att vara genom bredden på linjen (inställd på 8 i figur 3).
Obs: En tunnare linje är att föredra att undvika signal överlappning från olika strukturer. - Efter linjen är korrekt inställd, profil signal densitet längs den beslutsamma axeln (menyraden → analysera → Rita profil).
Obs: Öppnas ett nytt fönster som visar en profil som motsvarar signal intensiteten för varje pixel i den valda kanalen (specifika fluorophore) längs linjen för avsnittet valda z-planet.- Upprepa processen för varje kanal som motsvarar fluorophore används (dvs. en kvantifiering för 488, en för 568, och en för 405).
Obs: Intensitet signalvärdet kommer alltid beställas efter orientering på den ritade linjen.
- Upprepa processen för varje kanal som motsvarar fluorophore används (dvs. en kvantifiering för 488, en för 568, och en för 405).
- För att få numeriska gråskala värden för varje pixel i den profil som motsvarar kvantifieringar av det markerade lagret i z-planet, kopiera profildata (menyraden i bildfönstret → kopiera) och klistra in den i något kalkylprogram.
- Upprepa steg 4.1.1-4.1.4 för varje z-planet avsnitt av förvärvade confocal bilden och varje kanal där kvantifiering önskas.
Obs: Kvantifiering av olika z-planet lager kan slås samman för att få en allmän bedömning av den särskilda anrikningen av signalen genom att beräkna summan för varje pixel längs linjen för varje z-planet lager. Denna typ av sammanslagning kan endast uppnås om den linje dragen är identisk för varje z-planet lager ingår i medelvärdena. - Som en alternativ metod för hela-cell kvantifiering av olika kanaler med ett stort antal lager, använda makrot kallas StackprofileData (se den Kompletterande fil).
Obs: Det här makrot finns fritt på https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt och kan användas enligt följande:- Klistra in makrot till en textfil och spara det.
- Öppna bildfilen som innehåller alla de confocal skikten av cellen.
- Rita en linje, som beskrivs i steg 4.1.2, öppna ett nytt fönster om du vill importera makrot (menyraden → Plugins → makron → kör), Välj den tidigare sparade textfilen som motsvarar den StackprofileData makron och klicka på " öppna. "
Obs: Följande makro import, ett nytt fönster heter " resultat " öppnas och alla kvantifiering längs den beslutsamma axeln visas för varje z-planet lager och kanal i bildfilerna. - Kopiera data för varje kanal (menyraden → redigera → kopia) att få grafiska profil representation motsvarar de signal kvantifieringar. Klistra in den i något kalkylprogram. Beräkna summan för varje kanal för varje pixel längs linjen för varje z-planet lager. Använda dessa värden för att skapa en grafisk representation liknar den som presenteras i figur 3.
- Kvantifiering av signal i en utsedda cellulära area eller volym.
- Öppna bildfilen med ImageJ programvara.
- Rita ett område för att beteckna området av intresse med funktionen geometriska formen (verktyg bar → " rektangel, " " ovala, " eller " polygon ").
Obs: Kvantifiering värdet kommer att fastställas för den areal som motsvarar den dragna formen. - Justera tröskelnivån för att undvika någon bakgrund signal (menyraden → bild justera → tröskel), ett nytt fönster visas att representera pixel stödnivåerna i histogrammet form. Ändra värdena för att inkludera/utesluta pixlar i kvantifiering med skjutreglaget. Välj ett tröskelvärde som eliminerar röda pixlar utanför cellen, som pixlar i rött kommer att ingå i kvantifieringen.
- Definiera parametrarna mätning för att kvantifiera pixel signalen inom det valda området, utan bakgrund signal (menyraden → analysera → ange mätningar), och kontrollera det " gräns för tröskel " och den " integrerad täthet " lådor.
- Mäta kvantitativa värdena för det valda området (menyraden → analysera → åtgärd).
Obs: Signal intensiteten kvantifiering kommer att presenteras i ett nytt fönster under den " IntDen "-ID som motsvarar produkten av de grå medelvärdena och antalet pixlar inom det valda området. - Rita ett område som omfattar hela cellen med hjälp av en geometrisk form (verktyg bar → " rektangel, " " ovala, " eller " polygon ") och fortsätt med stegen 4.2.3-4.2.5 att erhålla ett värde motsvarande den totala signalen. Beräkna förhållandet mellan signalen inom det valda området över hela signalen att få procent av signalen inom intresseområdet.
- Upprepa steg 4.2.2-4.2.6 att erhålla kvantifiering av cellvolym för varje z-plan. Anpassa den geometriska formen behövs.
- Klistra in uppgifterna samlats in från de " resultaten " windows för varje z-planet lager till ett kalkylblad för grafisk presentation och att hitta ett medelvärde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att noggrant Observera översättningen händelser med puromycin införlivande, är det viktigt att fastställa optimala förutsättningar för varje cellinje eftersom varje visar olika puromycin inkorporering kinetik (figur 1)9,11 ,12,18. Därför, för att validera puromycin införlivande, är det nödvändigt att behandla den önskade cellinje med ett standardiserat spektrum av ökande koncentrationer av puromycin (1.0, 2,5, 5,0, 7.5, 10,0 och 15,0 µg/mL) under olika tidsperioder (5 och 10 min). För att bedöma lokaliserad översättning eller en tidigt svar på missbruksbehandling, kortare ruvningstid är program (t.ex. mindre än 5 min), eftersom den möjliggör direkt utvärdering av händelserna translationell direkt efter en specifik behandling. Helst puromycin signalen bör vara lätt påvisbara men bör också undvika mättnad (figur 2). Som avbildas i figur 2 (vänster paneler), är en godtagbar puromycin koncentration 7,5-10,0 µg/mL för MRC-5 och HeLa, medan 5.0-7,5 µg/mL puromycin föreslås för va-7. Optimering av de experimentella parametrarna är avgörande eftersom målet med denna metod är inte att fullständigt inhibera alla translationell töjning vid tidpunkten för inledande utan att tagga nyligen synthetized polypeptidkedjor under översättning att upptäcka akut variationer i översättning. Denna inledande fas i protokollet bör inte försummade, så överdriven puromycin tillgänglighet och förlängd behandlingstid kommer att orsaka stora oönskade konsekvenser. Såsom framgår av figur 2 (rätt panelerna), kommer att celler behandlas i 10 min med en hög puromycin koncentration generera mestadels mindre puromycilated polypeptider (t.ex. Huh-7, 7,5 µg/mL eller mer för 10 min). Dessa mindre polypeptider kommer diffusa snabbare i cellen, vilket kan störa korrekt bedöma subcellulär lokalisering. Ett annat problem är att ökad proteolys uppstår vid överdriven puromycin behandling19. Detta resultat observerades i MRC-5 och HeLa celler behandlas i 10 min, som visade minskad signalintensitet i närvaro av 10 eller 15 µg/mL puromycin. Båda dessa fenomen är vilseledande om puromycin inkorporering bedöms genom immunofluorescens eftersom ökad diffusion förhindrar korrekt visualisering av översättning lokalisering, medan puromycin-inducerad nedbrytning minskar kraftigt upptäckt känslighet. Dessa oönskade konsekvenser undviks lätt genom att korrekt definiera optimala experimentella förhållanden, som beskrivs i avsnitt 1 i protokollet.
Samtidigt visualisera puromycin införlivande, är det också viktigt att utföra lämpliga kontroller. Som visas i figur 3A, kan puromycin inkorporering blockeras effektivt genom tillsats av Kungliga Automobilklubben 50 µg/mL, en förening som är kända för att hämma översättning töjning20 och således puromycin införlivande. Problemet visas i figur 3B, som visar att Kungliga Automobilklubben behandling effektivt hindras de flesta av den signal som motsvarar puromycin införlivande i vidhäftande MRC-5 celler. Faktiskt, medan puromycilated peptider kan visualiseras i celler behandlas med puromycin bara, en svag signal detekteras i celler som behandlades även med Kungliga Automobilklubben identiska färgning villkor. Alternativt kan ett annat antibiotikum (anisomycin) också användas som en negativ kontroll, eftersom den har förmågan att blockera peptidyl transferasen verksamhet5 och har visat sig vara lika effektivt som Kungliga Automobilklubben på att blockera puromycin inkorporering5 ,18
Efter Immunofluorescerande bild förvärv är det möjligt att bedöma den allmänna lokaliseringen av puromycilated polypeptider motsvarar nyligen synthetized proteiner (figur 4). Bildlager väljs på olika djup i vidhäftande cellerna, så att signalen intensiteten i subcellulär fack bedömas i olika cell plan. Som sådan, är det möjligt att jämföra den lokaliserade puromycilation reaktionen på botten av cellen (figur 4A), i mitten av cellen (figur 4B) eller toppen av cellen (figur 4 c). Ligger något ovanför begynnande och maturating vidhäftning strukturer, observeras SICs oftast i mitten av cellen. Som förväntat, har intensiva puromycilation upptäckts i SICs, tyder på att mRNA översättning är isolerade till dessa subcellulära strukturer. Som tidigare nämnts är det möjligt att jämföra signalintensitet längs en önskad axel. Denna jämförelse är endast möjligt om bilderna förvärvade inte omfattar mättade pixlar, vilket visas i rött i gråskalebilden (andra paneler från toppen) erhålls med mikroskopet operativsystem. Dessa bilder kan importeras till programmet ImageJ för kvantifiering och analys av pixel intensiteten längs en utsedda axel. Pixel kvantifiering kan återges grafiskt (mellersta panelen) att illustrera relativa pixel intensiteten på utsedda platser längs axeln. En närmare titt på skäret i övre panelerna visar SIC-aktin gränser (i rött) och en grön signal inom struktur som motsvarar högaktiv översättning evenemang, som är berikad inom dessa strukturer (nedre delen). Men denna kvantifiering metod inte är det bästa sättet att fastställa den exakta procentandelen av total översättning som förekommer i dessa strukturer, det är visuellt informativ genom att tillåta för snabb bedömning av signalintensitet och är en god approximation av det signal distribution i hela cellen.
För att få en kvantitativ fördelning av signalen i hela hela cellen, användas en annan metod. I figur 5visas en av de viktigaste stegen är att beteckna områden av intresse som behöver kvantifieras för varje z-planet komponera confocal bildfiler. Detta uppdrag kan uppnås med hjälp av olika ritverktyg i ImageJ. Med denna metod, är det möjligt att kvantifiera antingen ett enskilt område eller flera områden, som kan sedan jämfört, subtraheras, eller ens sammanställt. De huvudsakliga svårigheterna är att: (i) hitta den optimala imaging villkor som undvika pixel mättnad och bakgrund signal, som kan förvränga kvantitativa värdet av erhållna signalen, och (ii) fastställa optimal kalibrering av tröskeln i ImageJ. Förutsatt att båda dessa villkor är optimal, är denna kvantifiering metod mycket reproducerbara samtidigt fortfarande lätt att utföra. Före bild förvärv är det också viktigt att noggrant bestämma z-hyvlar av cellen valt för kvantifiering nedre och övre gräns. I fall presenteras i figur 4, motsvarar den nedre delen resolution gränsen för syftet, som ofta inkluderar kontaminerande flyktig fluorescens, vilket kan minska förhållandet SIC/cell kroppen signal. Som tidigare nämnts, SICs är involverade i vidhäftning webbplats bildning och mognad; Därför är SIC strukturer ligger något ovanför nyligen bildar vidhäftning komplex, som utesluter flyktig fluorescens från de understa lagrarna. Således, SIC-bundna puromycilation signalen är knappt synliga i de nedre delarna, medan vi kan tydligt obsErve det i mittsektionen, förklara ökad förhållandet av SIC/cell kroppen signalerar i regionen mellersta jämfört med de nedre eller övre plan.
Figur 1. Experimentell framställning av puromycin behandling optimering beskrivs i avsnitt 1.
(A) en 24-väl representation av celler som dirigeras för experimentet (steg 1.1). (B) Schematisk bild av steg 1.4 visar medium förändringen i raderna 1 och 2 av 24-väl plattan och tillägg av Kungliga Automobilklubben (CHX) till varje brunn på tredje raden för en slutlig koncentration på 50 µg/mL. (C) Schematisk bild av puromycin behandling i andra och tredje rader (steg 1,6) 15 min efter steg 1.4. (D) Schematisk bild av puromycin behandling i den första raden (steg 1,8) 5 min efter steg 1,6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bestämning av optimala förutsättningar för puromycin införlivande.
Western blot analys av den hela-cellen extrahera från (A)MRC-5, (B) Huh-7, och (C) HeLa cells, inkuberas med ökande koncentrationer av puromycin (0, 2,5, 5, 7,5, 10 och 15 µg/mL) för en period av 5 min (vänster paneler) eller 10 min (höger paneler). Puromycilated peptider som hittades med en antikropp mot puromycin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Hämning av puromycilation med hjälp av Kungliga Automobilklubben.
(A) Western blot som visar effekten av Kungliga Automobilklubben på en 5-min puromycilation-analysen. Inkorporering effektivitet i MRC-5, Huh-7 och HeLa cells efter mock (PBS 1 X) eller Kungliga Automobilklubben behandling. (B) Confocal bild som visar effekten av Kungliga Automobilklubben på puromycin införlivande. MRC-5 celler före behandlades med antingen PBS (mock) eller Kungliga Automobilklubben för 15 min och sedan kompletteras med 10 µg/mL puromycin + PBS 1 X (till vänster) eller 10 µg/mL puromycin + 50 µg/mL Kungliga Automobilklubben (höger panel) för 5 min. Puromycilated proteiner upptäcktes använda en antikropp mot puromycin (grön). F-aktin upptäcktes med hjälp av phalloidin (röd), och kärnan var fläckade av DAPI (blå). Skär till höger motsvarar en 2.5 x förstoring på den vita rutan. Barer = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kvantifiering av translationell aktiviteten i SICs i vidhäftande MRC-5 celler.
(A-C) Representativ confocal bild av vidhäftande MRC-5 celler behandlas med 10 µg/mL puromycin för 5 min. De bilder som presenteras motsvarar den nedre (A), mellersta (B)och övre (C) delar av cellen. De övre panelerna visar puromycilated proteinerna detekteras med hjälp av en antikropp mot puromycin (grön). F-aktin upptäcktes med hjälp av phalloidin (röd), och kärnan var fläckade av DAPI (blå). Skär till höger motsvarar en 2 x förstoring på den vita rutan. Barer = 10 μm. Mittersta panelerna visar avsaknad av mättade pixlar, vilket skulle ha varit markerade i rött. Lägre paneler Visa en grafisk representation av puromycilated protein anrikning i en vidhäftande MRC-5-cell genom att jämföra signal intensiteten för puromycin (grön), F-aktin (röd) och DAPI (blå) längs cell axeln anges med den vita pilen. (D-F) De bilder som presenteras motsvarar den 4.4 x förstoring infoga av de SICs presenteras i (A-C). Kvantifieringen visar SIC gränsen (röda toppar: aktin), samt lokaliserad Översättning inom SICs (gröna toppar: puromycin) i den lägsta (D), mitten (E), och de övre (F) regionerna i cellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Hela-cell signal kvantifiering av puromycilated proteiner i vidhäftande MRC-5 celler.
(A) bestämning av signalen inom olika områden i z-planet bottenlagret på en vidhäftande MRC-5-cell. (Till vänster) Val av område (jag) som täcker totalityen av cellen för att erhålla ett kvantitativt värde som motsvarar totala cellular signalen för detta z-planet skikt. (Mitten panel) Urval av cellulära området motsvarar kärnan och den cytoplasmiska delen som inte inkluderar SIC (II). (Höger panel) Visualisering av området motsvarande till SICs (III) genom att subtrahera det värde som erhålls från området II från det värde som erhålls för hela cellen (område jag). Barer = 10 μm. (B) kvantitativa pixelvärden för varje område anges i tabellen för bilden föreställande området valet i (A), följt av en graf som visar andelen (%) av signal hittades i SICs. (C) bestämning av signalen inom olika områden i z-planet mitten lagret av en vidhäftande MRC-5-cell. (Till vänster) Urval av området (I) som täcker totalityen av cellen för att erhålla ett kvantitativt värde som motsvarar totala cellular signalen för detta z-planet skikt. (Mitten panel) Urval av området cell motsvarar kärnan och den cytoplasmiska delen som inte inkluderar SIC (II). (Höger panel) Visualisering av området motsvarande till SICs (III) genom att subtrahera värdet erhålls för området II från det värde som erhålls för hela cellen (område jag). (D) kvantitativa pixelvärden för varje område anges i tabellen för bilden föreställande området valet i (C), följt av en graf som visar andelen (%) av den signal som hittades i SICs. (E) bestämning av signalen inom olika områden av lagrets övre z-planet på en vidhäftande MRC-5-cell. (Till vänster) Urval av området (I) som täcker totalityen av cellen för att erhålla ett kvantitativt värde som motsvarar summacell signalen för detta z-planet skikt. (Mitten panel) urval av området cell motsvarar kärnan och den cytoplasmiska delen som inte inkluderar SICs (II). (Höger panel) Visualisering av området motsvarande till SICs (III) genom att subtrahera värdet erhålls för området II från det värde som erhålls för hela cellen (område jag). (F) kvantitativa pixelvärden för varje område anges i tabellen för bilden föreställande området valet i (E), följt av en graf som visar andelen (%) av den signal som hittades i SICs. (G) kvantifiering värden för alla z-planet lager från cellen presenteras ovan, inklusive en beräknas för z-plan presenteras i A (z = 1), C (z = 9), och E (z = 19), som markeras i rött på bordet. (H) grafisk representation av procentandelen av signalen återfinns i SICs i hela volymen hela cellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Senaste tekniska framsteg har gjort för en bättre förståelse av mekanismerna som är involverade i translationell uppreglering eller förtryck av specifika mRNA i biologiska processer, såsom neuronal utveckling, narkotika svar och metastaser. De kostnadseffektiva metoder som beskrivs här tillåter översättning händelser till visualiseras i celler för att studera hur RNA-bindande proteiner reglerar metastaserande processer, såsom cellulär adhesion, migration och invasion.
Även om många metoder för att bedöma de novo protein översättning har utvecklats, delar de alla samma strategi, där den förlängning polypeptiden innehåller modifierade aminosyror med en detekterbar biexponentiellt etiketten. Först av dessa metoder bygger på 35S-märkt arginin införlivande i det nyligen översatt proteinet. Även om det är effektivt för att jämföra allmänna priser översättning under särskilda förhållanden, gör användningen av radiomärkt aminosyror denna metod oattraktiv till de flesta forskarlag. Därav, utveckling av nya metoder med icke-radioaktiva etiketter, såsom solnedgång, klicka på-it, eller metoden TRICK erbjuds nya möjligheter att bedöma och följa i vivo översättning händelser. Även om det är genialt, tillåta de flesta av dessa metoder endast för bedömning av översättning händelser efter läkemedelsbehandling eller specifika cellulära händelser med hjälp av en specifik exogena cDNA konstruera av specifika mål, att begränsa experiment att redan fastställda mål . Detta är sant för TRICK strategi4, vilken för translationell regleringen av ett enda exogent uttryckt mRNA mål kan bedömas. Även om det möjliggör validering av translationell aktivering av endogena mRNA, är ”klick-IT” metod minimal inkubationstiden för AHA iblandning minst 1 h13, vilket anses alltför länge för mest akuta översättning mekanismer.
Mycket mångsidig och enkel att ställa in, kräver den metod som beskrivs här att de kritiska steg följas i den inledande fasen av protokollet. I de representativa resultat visas olika cellinjer kommer att ha olika puromycin inkorporering kinetik, som kan helt enkelt bero på ämnesomsättningen av varje cellinje, som verkar vara fallet för MRC-5 celler5,21. Faktiskt, icke-omvandlad celler är inte lika proliferativ som HeLa, och därför protein massa förnyelse är mindre robust än i celler. Detta bör beaktas när du använder protokollet. Följaktligen är den första delen av protokollet avgörande för resten av metoden. Att noggrant bestämma koncentrationen av puromycin och längden på inkubation kommer att möjliggöra en bättre bedömning av översättningen inträffar under experimentet. Som nämnts ovan, behandling med en överdriven mängd puromycin ökar andelen små puromycilated polypeptider och verkar stimulera proteolys, vilket lätt kan leda till en felaktig tolkning av normalt förekommande translationell händelser19 . Som en tumregel behövs ju längre inkubationstiden, den mindre puromycin en kortare ruvningstid kräver en högre puromycin koncentration. Koncentration/tiden kan anpassas till särskilda experimentella begränsningar.
De metoder som presenteras här är mycket anpassningsbar och kan enkelt modifieras enligt behandling tillämpas eller biologiskt processen studerade. Puromycin inkorporering möjliggör snabb bedömning av förändringar i översättning kinetik under en kort tid, medan metoden kvantifiering ger mycket informativa bilder av cellulära händelser. Även om kraftfulla, har dessa metoder begränsningar som måste beaktas. Puromycin kommer att införlivas i proteiner nyligen syntetiseras från alla mRNA som översätts aktivt. Av denna anledning, den puromycilation metod som beskrivs här kanske inte är lämpad att studera specifika mål (dvs, enda mRNA), men det är perfekt att få en allmän översikt över translationell aktivitet inom en enstaka cell eller en cell befolkningen. Som nämnts ovan, överdriven puromycin har stora nackdelar, och puromycin doser och behandlingstider bör definieras noggrant, såsom föreslagits i protokollet. Verkligen, som visas i figur 2, överdriven puromycin tillgänglighet kommer att resultera i bildandet av mindre puromycilated polypeptider som diffus snabbare i cellen, vilket leder till felaktig subcellulär lokalisering data. Dessutom är ökad proteolys känt att uppstå efter överdriven puromycin behandling19, en effekt som kan leda till en fullständig förlust av signal.
Även om inte så specifik som Klicka-it eller TRICK metoder, den strategi som föreslås här är mycket lättillgänglig och tillåter för snabb bedömning av allmänna förändringar i översättning kinetik. Även om andra metoder är bättre lämpade för specifika applikationer, kan puromycin inkorporering analyser utföras som en kompletterande kontroll. Verkligen, om experimentet behöver visa att ett specifikt mRNA mål är den enda som påverkas i ett särskilt tillstånd, är det nödvändigt att visa att detta inte orsakas av en allmän ökning i översättning. Som sådan, kunde negativa puromycin inkorporering bevisa för detta fall. Denna metod är dessutom väl lämpad för att observera generella förändringar i översättning priser. Därför kan det användas för att visa en översättning förtryck mekanism, som i fallet med stress granule bildandet9, eller att validera om Kungliga Automobilklubben behandling används i den inledande fasen av translationell komplexa fraktionering effektivt blockerar töjning22. Det är också viktigt att nämna att även om kvantifiering metoderna som beskrivs i avsnitt 2.3 och 2.4 avser experiment med fokus på puromycin färgning, kan de tillämpas på någon typ av konkurrensbetingat färgning med olika typer av fluorophores. Faktiskt, dessa kvantifiering metoder kan användas för att kvantifiera den cellulära fördelningen av en molekyl eller protein och kan även verifiera localizationen av ett mål i särskilda subcellulär kupé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) för den kritiska behandlingen av manuskriptet. Vi tackar Cell Imaging enheten för Research Center för deras tekniskt bistånd. M.-É. Huot är en Junior 1 forskning lärd av Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Detta arbete fick stöd av kanadensiska institut för hälsa forskning (tilldela CIHR, mopp-286437 till M.-É. Huot).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
