Summary
Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.
Abstract
Os mecanismos de regulação tradução do mRNA estão envolvidos em diversos processos biológicos, tais como o desenvolvimento de linha germinal, diferenciação celular e organogênese, bem como em várias doenças. Inúmeras publicações têm demonstrado convincentemente que mecanismos específicos firmemente regulam tradução do mRNA. Aumento do interesse na regulação da expressão da proteína induzida em tradução tem levado ao desenvolvimento de novos métodos de estudar e seguir de novo proteína síntese em cellulo. No entanto, a maioria desses métodos é complexa, tornando-os dispendiosos e muitas vezes limitar o número de destinos de mRNA que podem ser estudados. Este manuscrito propõe um método que requer somente reagentes básicos e um sistema de imagens de fluorescência confocal para medir e visualizar as alterações na tradução de mRNA que ocorrem em qualquer linha de celular em diversas condições. Este método foi usado recentemente mostrar tradução localizada nas estruturas subcelulares de células aderentes durante um curto período de tempo, oferecendo assim a possibilidade de visualizar a tradução de novo por um curto período durante uma variedade de biológicas processos ou de Validando alterações na atividade translacional em resposta a estímulos específicos.
Introduction
O Regulamento de tradução por diferentes funções celulares levou muitas equipes de investigação para desenvolver novas ferramentas e métodos para determinar a Localização subcellular da tradução do mRNA e proteína regulamentado síntese1,2 ,3,4. Estes recentes avanços tecnológicos permitem uma melhor compreensão dos mecanismos que envolvem a tradução upregulation ou a repressão de mRNAs específicos durante processos biológicos, tais como o desenvolvimento neuronal, a resposta de drogas e metástase5 ,6,7,8. No entanto, a maioria desses métodos requerem equipamentos específicos que podem não estar disponíveis para a maioria dos laboratórios e reagentes caros ou perigosos. Como tal, um método de baixo custo para permitir a rápida avaliação de eventos de tradução foi desenvolvido para especificamente contornar esses problemas potenciais. Este método detecta modulações translacionais agudas que ocorrem durante os processos celulares específicos e também permite a localização de tradução usando microscopia confocal.
Os métodos descritos aqui foram usados para monitorar uma tradução localizada dentro de compartimentos subcellular chamado espalhamento iniciação centros (SIC)5. SICs são transitórias estruturas encontradas nas células semeadas que são localizadas no topo de complexos de adesão nascente. Embora SICs e complexos de adesão são distintos, seus destinos estão intimamente ligados. Com efeito, SICs são conhecidos por desaparecer gradualmente após maturação complexo de adesão focal em um site de adesão durante a fase inicial de adesão. Descobrimos que RNA-proteínas conhecidas para controlar especificamente tradução mRNA (por exemplo, Sam68, FMRP e G3BP1) e polyadenylated RNAs foram enriquecidos dentro estas estruturas5. Usando os métodos descritos aqui, nós mostramos que o Regulamento de SIC-associada mRNA tradução age como uma barreira, permitindo semeado células para consolidar a adesão celular. Este método, baseado na incorporação de puromicina, poderia ser considerado uma versão adaptada da superfície de sensoriamento de tradução do ensaio (pôr do sol). Originalmente desenvolvido para medir as taxas de síntese de proteína global usando um aminoácido não-radioativa etiquetado, proteína puromycilation oferece uma maneira eficiente de Visualizar de síntese de proteínas de novo 9. Esse método depende o comportamento intrínseco de puromicina, um antibiótico que bloqueia a tradução por meio de encerramento prematuro da cadeia no Ribossoma10. Com efeito, a puromicina é estruturalmente análoga ao tRNA-correntes, que permite a incorporação alongando cadeias peptídicas através da formação de uma ligação peptídica. No entanto, vinculação de puromicina para uma crescente cadeia peptídica impede que uma nova ligação peptídica sendo formado com o próximo aminoacil-tRNA, desde puromicina tem uma ligação Amida não hidrolisável em vez da ligação éster hidrolisável encontrada em tRNAs. Assim, a incorporação de puromicina alongando polipeptídeos resulta na liberação prematura de numerosos polipeptídeos de puromycilated truncado correspondente ativamente traduzido do mRNA9,11,12 .
Usando este método, foi possível avaliar tradução ativa dentro de uma viúva de curto período de tempo (por exemplo, 5 min) durante a adesão celular usando um anticorpo específico dirigido contra puromicina em células que foram suplementados com o antibiótico para períodos de 5-min em pontos de tempo diferentes durante a adesão célula processo5. A precisão deste teste depende altamente específicos anticorpos dirigidos contra a fracção puromycilated. Detecção de imunofluorescência do polypeptide puromycilated fornece uma repartição geral subcellular do mRNA recentemente traduzidas, que também pode ser quantificada com grande precisão usando sistemas de imagiologia confocal.
Portanto, esse método oferece uma opção relevante para um grande número de laboratórios estudando mecanismos de regulação traducional envolvidos em processos como granulação neuronal6,13,14, 15, morphogen mRNA de localização e tradução durante desenvolvimento16,17. Também é adequado para estudar tradução localizada ou compartimentada durante rápidas eventos biológicos, tais como a migração celular, adesão ou invasão, ou simplesmente avaliar tratamentos com drogas que podem induzir alterações translacional5, 7 , 18. em geral, esse método permite que para a visualização de eventos tradução localizadas ou controlada de uma forma rápida, precisa e econômica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. determinação das condições de Puromycilation
Nota: esta técnica descreve o método usado para avaliar a tradução localizada durante o MRC-5 célula adesão processo 5. Como puromycilation pode ser feito em qualquer célula, é importante otimizar as condições de puromycilation para as linhas de célula específica a ser usado, porque as condições de tratamento não são idênticas para cada linha de celular em termos de concentração de puromicina e o desejado tempo de incubação. Para mostrar como essas condições são definidas, três linhas de célula exemplo (ou seja, HeLa, MRC-5 e 7-Huh) foram tratadas com concentrações crescentes de puromicina para tempos de incubação diferentes ( Figura 1).
- Crescer números idênticos de células em uma placa de 24 em 0,5 mL do adequado completam 16 h antes do teste de meio de cultura. MRC-5 células de semente 30.000, 50.000 células HeLa ou 50.000 HuH-7 células por poço. Certifique-se de evitar exceder a confluência de 60-70% (figura 1A).
- Preparar 6 tubos com 1,5 mL de meio de cultura celular completa com concentrações crescentes de puromicina (0, 5, 10, 15, 20 e 30 µ g/mL). Pré-aquecido a 37 ° C.
- Para cada concentração do meio de puromicina (preparado no passo 1.2), de transferir 0,5 mL de cada tubo para 6 tubos de novos e adicionar cicloheximida em uma concentração final de 50 µ g/mL para todos os 6 tubos de novos. Pré-aquecido a 37 ° C.
- Mudar o meio com 0,5 mL de meio de cultura completo (linha 1 e 2). Para a terceira linha, adicionar 0,5 mL de meio de cultura completo suplementado com 50 µ g/mL de cicloheximida ( figura 1B).
Nota: Tratamento de cicloheximida foi estabelecido como o melhor controle negativo para puromycilation de proteína devido à sua capacidade de bloquear do alongamento. Porque a incorporação de puromicina requer do alongamento, cicloheximida tratamento leva a uma perda de puromycilated proteína sinais 5 , 18. - Incube por 15 min a 37 ° C (5% CO 2).
- Adicionar 0,5 mL do meio de puromicina preparado na etapa 1.2 para a segunda linha para obter concentrações finais de 0, 2,5, 5, 7,5, 10 e 15 µ g/mL, respectivamente, nas colunas A, B, C, D, E e F. Ao mesmo tempo, adicionar 0,5 mL de puromicina no meio de cicloheximida-completada (etapa 1.3) na terceira linha ( Figura 1).
- Incubar durante 5 min a 37 ° C (5% CO 2).
- Adicionar 0,5 mL do meio de puromicina preparado na etapa 1.2 para a primeira linha para obter concentrações finais de 0.0, 2.5, 5, 7,5, 10 e 15 µ g/mL ( Figura 1).
- Incubar durante 5 min a 37 ° C (5% CO 2).
- Cada um lavar bem a partir de soro de linhas 1 a 3 com 1 mL de gelado 1 X tamponada fosfato (PBS) 5 min após a adição de puromicina poços de primeira linha (lavar duas vezes). Adicionar 75 µ l de tampão de X Laemmli 1 (4% sulfato dodecyl de sódio (SDS), 4% de 2-Mercaptoetanol, 0.120 M Tris HCl pH 6,8, 0,004% azul de bromofenol e 10% de glicerol) para obter células inteiras lysates para cada condição.
- Run 10% eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) usando 1/3 das amostras preparadas para avaliar a incorporação de puromicina.
- Determinar o nível de incorporação de puromicina por análise ocidental do borrão, usando um anticorpo antipuromicina (12 D 10) diluído na proporção de 1: 25.000 em tampão de incubação do anticorpo primário (2% soro de Albumina bovina (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 e 0,01% azida de sódio).
Nota: Imagens representativas correspondente à célula diferentes extratos de linha feitos conforme descrito na etapa 1 são mostradas como exemplos na Figura 2.
- Determinar o nível de incorporação de puromicina por análise ocidental do borrão, usando um anticorpo antipuromicina (12 D 10) diluído na proporção de 1: 25.000 em tampão de incubação do anticorpo primário (2% soro de Albumina bovina (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 e 0,01% azida de sódio).
2. Em Cellulo Localizada a visualização de tradução
Nota: A técnica descrita aqui foi usada para avaliar a tradução localizada dentro SICs em MRC-5 células durante o processo de adesão 5. Embora MRC-5 células são usadas aqui, outras linhas de células podem ser usadas com a mesma metodologia descrita no passo 2.1.
- Celular preparação.
- Desanexar MRC-5 células usando 0,25% tripsina/2,21 ácido etilenodiaminotetracético de mM (EDTA) em Hank ' s solução sal equilibrado (HBSS). As células de pelotas por centrifugação (5 min x 200g) em um tubo de centrifuga conico de 15 mL e suspendê-las em Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS) 40.000 células/ml, depois de contar com uma câmara de contagem.
- Incube as celulas suspensas a 37 ° C sob rotação suave usando um rotador tubo por 20 min para mantê-las em suspensão.
Nota: Este passo é fundamental para permitir a completa dissociação dos complexos adesão focal. - Placa 2 mL de suspensão MRC-5 células (40.000 células/mL) em dois pratos de 35mm vidro-fundo. Use o primeiro prato que 35mm vidro-fundo para o ensaio de puromycilation (consulte a etapa 2.1.5) e usar o segundo como um controle negativo (consulte a etapa 2.1.6).
- Manter as células a 37 ° C (5% CO 2) por 55 min permitir a adesão celular e formação de SIC.
- Add puromicina ao meio nos pratos 35mm vidro-fundo (ensaio) usando a concentração previamente definida na secção 1. Para tratar o MRC-5 células, usar 10 puromicina µ g/mL por 5 min a 37 ° C (5% CO 2).
- Como um controle negativo, adicionar cicloheximida para o segundo prato de 35mm vidro-fundo 40 min após a propagação das células pre-tratá-los com 50 cicloheximida µ g/mL ( Figura 2B). Em seguida, 15 min após a adição de cicloheximida, adicione puromicina ao meio usando o mesmo tempo de concentração e incubação como na etapa 2.1.5 (por exemplo, uso 10 µ g/mL de puromicina por 5 min a 37 ° C (5% CO 2) para MRC-5).
- Lavar cada placa duas vezes com 2 mL de gelado 1 X PBS e consertar as células com 1 mL de formol 4% (diluído em 1X PBS) durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT).
Cuidado: Paraformaldehyde deve ser usado estritamente em uma capa química.
- Immunostaining.
- Após a fixação do paraformaldehyde, lavar três vezes com 2 mL de 1X PBS e incubar em 500 µ l de PBS-TritonX-100 (0,5%) por 20 min no RT para permeabilize as células.
- Para impedir a ligação de anticorpos inespecíficos, bloquear a amostra com 500 µ l de PBS – BSA (1%) por 20 min no RT.
- Lavar três vezes com 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e incube com 300 µ l de 1:12,500 anticorpo antipuromicina (12 D 10) diluído em 1X PBS por 1h no RT.
- Lavar 3 vezes com 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e incube com 300 µ l de anti-mouse IgG conjugada com um fluoróforo (aqui, 488 nm) diluído em PBS para visualizar puromycilated polipeptídeos e com conjugados a faloidina para outro fluoróforo (aqui, 555 nm) Visualizar F-Actina. Incubar durante 1 h em RT.
- Lavar três vezes com 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e então incubar durante 5 min à RT em 300 µ l de PBS-Tween20 (0,1%) suplementado com 1 µ g/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Lavar três vezes com 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e em seguida lavar com 2 mL de 1X PBS. Impedir as células de secagem, mantendo a amostra em 2 mL de 1X PBS durante a aquisição de imagens.
3. Aquisição de imagens de imunofluorescência
Nota: A metodologia a seguir pode ser usada com qualquer sistema da imagem latente confocal comercialmente disponível.
Configurações de- determinar o apropriado para cada fluoróforo para maximizar a gama dinâmica para quantificação.
Nota: Quantificação representante só pode ser obtida se a saturação de pixel é evitada e o limiar de sinal está ajustado corretamente. Essas configurações podem ser alcançado ajustando cuidadosamente a potência do laser, de alta tensão (HV), ganhar, e o deslocamento. Fator- ajustar o zoom (5x) e o número de pixels (512 x 512) para otimizar o tamanho de pixel.
Nota: Isto deve ser pelo menos 2.3 - vezes menor do que a resolução óptica, de acordo com o teorema de Nyquist. - Diminuir a velocidade de varredura (12,5-20 µs/pixel) e usar uma média (2 - 3 vezes) para melhorar a relação sinal-ruído de acordo com as configurações mencionadas acima.
- ajustar o zoom (5x) e o número de pixels (512 x 512) para otimizar o tamanho de pixel.
- Manualmente determinar o top apropriado e planos focais ao longo do eixo z com o tamanho de passo ótimo (0,4 µm/fatia) de fundo.
Nota: O avião do tamanho de etapa é determinado pela resolução axial dividida por 2.3, de acordo com o teorema de Nyquist. Normalmente, 20-25 camadas são necessárias para cobrir a profundidade de toda a célula de células aderentes. - Adquirir uma imagem confocal de uma única célula inteira com um 60 objetivo de imersão de óleo X plano Apo (1,42 abertura numérica).
4. Quantificação de imagem imunofluorescência
- determinação de enriquecimento.
- Abrir uma imagem correspondente à camada de z-plano de interesse do arquivo de dados adquiridos de célula usando o software ImageJ (freeware disponível em http://fiji.sc).
- Desenhar uma linha usando a ferramenta de linha de desenho (barra de ferramentas → em linha reta) através das regiões da célula onde a quantificação é desejada. Modificar a largura da linha clicando duas vezes em " em linha reta; " vão ser média dos valores de intensidade através da largura da linha (fixado em 8 na Figura 3).
Nota: Uma linha mais fina é a preferida para evitar a sobreposição de sinal de diferentes estruturas.
Perfil de - depois que a linha está definida corretamente, a densidade de sinal ao longo do eixo determinado (barra de menu → Analyze → traçar perfil).
Nota: Uma nova janela abrirá que mostra um perfil correspondente à intensidade de sinal para cada pixel do canal selecionado (específico fluoróforo) ao longo da linha para a seção selecionada do plano z.- Repita o processo para cada canal correspondente para o fluoróforo usado (isto é, uma quantificação para 488, um para 568 e outra para o 405).
Nota: O valor de intensidade de sinal serão sempre ordenado seguindo a orientação da linha desenhada.
- Repita o processo para cada canal correspondente para o fluoróforo usado (isto é, uma quantificação para 488, um para 568 e outra para o 405).
- Para obter os valores de cinza escala numéricos para cada pixel do perfil correspondente as quantificações da camada selecionada plano z, copiar os dados de perfil (barra de menu na janela de imagem → copiar) e cole-o em qualquer software de planilha eletrônica. 4.1.1-4.1.4
- repita os passos para cada seção do plano z da imagem confocal adquirida e cada canal onde a quantificação é desejada.
Nota: A quantificação das diferentes camadas de z-plano pode ser agrupada para obter uma avaliação geral do enriquecimento especial do sinal calculando o valor da soma de cada pixel, ao longo da linha para cada camada plano z. Este tipo de pool só será possível se a linha desenhada é idêntica para cada camada de z-plano constam os valores médios de. - Como um método alternativo para a quantificação de células inteiras de canais diferentes, com um grande número de camadas, use a macro chamada StackprofileData (consulte o Arquivo suplementar).
Nota: Esta macro pode ser acessada livremente em https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt e pode ser usada da seguinte maneira:- Cole a macro em um arquivo de texto e salvá-lo
- Abrir o arquivo de imagem que inclua todas as camadas confocal da célula.
- Desenhar uma linha, conforme descrito na etapa 4.1.2, abrir uma nova janela para importar a macro (barra de menu → Plugins → Macros → executar), escolher o arquivo de texto salvo anteriormente correspondente a macro StackprofileData e clique " abrir... "
Nota: Sequência da importação de macro, uma nova janela chamada " resultados " será aberto e todos da quantificação ao longo do eixo determinado serão listados para cada camada de z-plano e canal presentes nos arquivos de imagem. - Copiar os dados para cada canal (barra de menu → editar → cópia) para obter a representação gráfica do perfil correspondente as quantificações de sinal. Colá-lo em qualquer software de planilha eletrônica. Calcule o valor da soma de cada canal para cada pixel, ao longo da linha para cada camada plano z. Usar esses valores para criar uma representação gráfica semelhante ao apresentado na Figura 3.
- Quantificação do sinal em um volume ou área designada celular.
- Abrir o arquivo de imagem com software ImageJ.
- Desenhar uma área para denotar a área de interesse, usando a função de forma geométrica (barra de ferramentas → " retângulo, " " oval, " ou " polígono ").
Nota: O valor de quantificação será determinado pela área correspondente ao formulário desenhado. - Ajustar o nível de limiar para evitar qualquer sinal de fundo (barra de menu → ajustar a imagem → limiar); uma nova janela aparecerá para representar as intensidades pixel em forma de histograma. Altere os valores para incluir/excluir pixels na quantificação usando o controle deslizante. Selecione um limiar que elimina pixels vermelhos fora da célula, como pixels destacadas em vermelho serão incluídas na quantificação.
- Definir os parâmetros de medida para quantificar o sinal de pixel dentro da área selecionada, sem sinal de fundo (barra de menu → Analyze → conjunto de medições) e certifique-se de verificar o " limite de limiar " e o " densidade integrada " caixas.
- Medir os valores quantitativos para a área selecionada (barra de menu → Analyze → medida).
Nota: Quantificação de intensidade do sinal será apresentada em uma nova janela sob o " IntDen " identificação, que representa o produto dos valores médios de cinza e o número de pixels dentro da área selecionada. - Desenhar uma área que inclui toda a célula usando uma forma geométrica (barra de ferramentas → " retângulo, " " oval, " ou " polígono ") e prosseguir com passos 4.2.3-4.2.5 para obter um valor correspondente para o total de sinal. Calcular a relação do sinal dentro da área selecionada sobre o sinal inteiro para obter a porcentagem do sinal dentro da área de interesse.
- 4.2.2-4.2.6 passos de repetição para obter a quantificação do volume de célula para cada plano z. Adaptar a forma geométrica, conforme necessário.
- Copiar/colar os dados obtidos a partir da " os resultados " windows para cada camada de z-plano em uma planilha para representação gráfica e para encontrar um valor médio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para observar com precisão eventos de tradução usando a incorporação de puromicina, é fundamental para determinar as condições ideais para cada linha de celular porque cada mostra diferentes puromicina incorporação cinética (Figura 1)9,11 ,12,18. Portanto, para validar a incorporação de puromicina, é necessário tratar a linha de celular desejado com um espectro normalizado de concentrações crescentes de puromicina (1.0, 2,5, 5,0, 7,5, 10,0 e 15,0 µ g/mL) por diferentes períodos de tempo (5 a 10 min). Para avaliar a tradução localizada ou uma resposta inicial ao tratamento medicamentoso, um menor tempo de incubação é preferencial (por exemplo, menos do que 5 min), pois permite a avaliação direta dos eventos translacionais diretamente a seguir um tratamento específico. Idealmente, o sinal de puromicina deve ser facilmente detectável, mas também deve evitar o ponto de saturação (Figura 2). Conforme representado na Figura 2 (painéis à esquerda), uma concentração de puromicina aceitável é 7.5-10,0 µ g/mL para MRC-5 e HeLa, Considerando que 5,0-7,5 µ g/mL de puromicina é sugerido para Huh-7. Otimização dos parâmetros experimentais é crucial, porque o objetivo desse método é para não inibir completamente todos os alongamento translacional no momento da iniciação, mas a tag recentemente as correntes do polypeptide synthetized durante a tradução para detectar aguda variações na tradução. Esta fase inicial no protocolo não deve ser negligenciada, como excessiva puromicina disponibilidade e tempo de tratamento prolongado causará grandes consequências indesejadas. Como observado na Figura 2 (painéis de certo), as células tratadas por 10 min com uma concentração alta de puromicina gerará principalmente menores puromycilated polipeptídeos (por exemplo, Huh-7, 7,5 µ g/mL ou mais por 10 min). Esses polipeptídeos menores serão difundir mais rapidamente na célula, o que pode interferir com a avaliar com precisão a Localização subcellular. Outro problema é que esse aumento de proteólise ocorre após a puromicina excessivo tratamento19. Este resultado foi observado em células de MRC-5 e HeLa tratadas por 10 min, que mostrou sinal de diminuição da intensidade na presença de 10 ou 15 µ g/mL de puromicina. Ambos estes fenômenos são enganosos, se a incorporação de puromicina é avaliada pela imunofluorescência porque maior difusão impede a visualização precisa de localização de tradução, Considerando que a degradação induzida por puromicina diminui significativamente sensibilidade de detecção. Estas consequências não desejadas são facilmente evitadas definindo adequadamente condições experimentais ideais, conforme descrito na seção 1 do protocolo.
Ao mesmo tempo visualizando a incorporação de puromicina, também é importante realizar um controlo adequado. Como mostrado na Figura 3A, incorporação de puromicina pode ser eficientemente bloqueada pela adição de 50 cicloheximida µ g/mL, um composto conhecido por inibir a tradução alongamento20 e, portanto, a incorporação de puromicina. Esse comportamento é mostrado na Figura 3B, que mostra que tratamento cicloheximida impedido eficientemente a maioria do sinal correspondente à incorporação de puromicina em células aderentes do MRC-5. Com efeito, enquanto os peptídeos de puromycilated podem ser visualizados em células tratadas com puromicina apenas, é detectado um sinal fraco em células que também foram tratadas com cicloheximida sob condições idênticas de coloração. Como alternativa, a outro antibiótico (anisomycin) também pode ser usado como um controle negativo, pois tem a capacidade de bloquear peptidyl transferase atividade5 e foi mostrado para ser tão eficiente quanto cicloheximida na incorporação de puromicina5 de bloqueio ,18
Após a aquisição de imagens de imunofluorescência, é possível avaliar a localização geral do puromycilated polipeptídeos correspondentes a recém synthetized proteínas (Figura 4). Camadas de imagem são selecionadas em diferentes profundidades no interior das células aderentes, permitindo que a intensidade do sinal em compartimentos subcellular ser avaliada em planos diferentes da célula. Como tal, é possível comparar a reação de puromycilation localizadas na parte inferior da célula (Figura 4A), no meio da célula (Figura 4B), ou a parte superior da célula (Figura 4). Situado ligeiramente acima de estruturas de adesão nascente e amadurecimento, SICs são observados principalmente no meio da célula. Como esperado, puromycilation intensa é detectado no SICs, sugerindo que a tradução de mRNA é isolada para estas estruturas subcelulares. Como mencionado anteriormente, é possível comparar a intensidade de sinal ao longo de um eixo desejado. Essa comparação só é possível se as imagens adquiridas não incluem pixels saturados, que aparecem em vermelhos na imagem em tons de cinza (segundo painéis de cima) obtidos utilizando o microscópio software operacional. Estas imagens podem ser importadas para o software ImageJ para quantificação e análise de intensidade ao longo de um eixo designado pixel. A quantificação do pixel pode ser representada graficamente (painel central) para ilustrar a intensidade relativa de pixel em posições designadas ao longo do eixo. Um olhar mais atento a inserir os painéis superior mostra os limites da SIC-actina (em vermelho) e um sinal verde dentro da estrutura que corresponde aos eventos de tradução altamente ativo, que são enriquecidos dentro destas estruturas (parte inferior). Embora este método de quantificação não é a melhor maneira de determinar o percentual exato da tradução total ocorrendo nessas estruturas, é visualmente informativo permitindo a rápida avaliação da intensidade de sinal e é uma boa aproximação da distribuição de sinal em toda a célula.
Para obter uma distribuição quantitativa do sinal em toda a célula inteira, outro método deve ser usado. Como mostrado na Figura 5, uma das principais etapas é denotar as áreas de interesse que precisam ser quantificadas para cada plano z compondo os arquivos de imagem confocal. Esta atribuição pode ser conseguida usando uma ferramenta de desenho diferente encontrada no ImageJ. Usando este método, é possível quantificar a uma única área ou várias áreas, que podem ser comparadas, subtraídas ou até mesmo compiladas. As principais dificuldades são: (i) encontrar a imagem ideal de condições que evitar saturação de pixel e sinal de fundo, que podem deturpar o valor quantitativo do sinal obtido e (ii) estabelecer uma calibração óptima do limiar no ImageJ. Supondo que ambas as condições forem ideais, este método de quantificação é altamente reprodutível, permanecendo ainda fácil de executar. Antes da aquisição de imagens, também é importante determinar cuidadosamente os limites inferior e superiores dos aviões-z da célula selecionada para quantificação. No caso apresentado na Figura 4, a seção inferior corresponde ao limite de resolução do objectivo, que muitas vezes inclui contaminando evanescente da fluorescência, que pode diminuir a taxa de sinal de corpo SIC/célula. Como mencionado anteriormente, SICs estão envolvidos na formação local de aderência e maturação; Portanto, estruturas SIC situam-se ligeiramente acima recém formando complexos de adesão, que exclui a fluorescência evanescente das camadas mais baixas. Assim, o sinal de puromycilation ligados a SIC é pouco visível nas seções inferior, Considerando que podemos claramente obsErve ele na seção intermediária, explicando a maior proporção de corpo SIC/celular sinal na região média em comparação aos planos inferiores ou superiores.
Figura 1. Representação experimental da otimização puromicina tratamento descrita no ponto 1.
(A) uma representação de 24-poço de células sendo propagada para o experimento (etapa 1.1). (B) representação esquemática da etapa 1.4 mostrando a mudança média nas linhas 1 e 2 da placa de 24 poços e a adição de cicloheximida (CHX) a cada poço da terceira linha para uma concentração final de 50 µ g/mL. (C) representação esquemática da puromicina nas segunda e terceiros linhas (passo 1.6) 15 min após a etapa 1.4. (D) representação esquemática da puromicina na primeira linha (passo 1.8) 5 min depois passo 1.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Determinação das condições ideais para a incorporação de puromicina.
Análise ocidental do borrão da célula inteira extrair do (A)MRC-5, (B) Huh-7 e (C) as células HeLa, incubadas com concentrações crescentes de puromicina (0, 2,5, 5, 7,5, 10 e 15 µ g/mL) por um período de 5 min (painéis esquerdos) ou 10 min (à direita painéis). Peptídeos de Puromycilated foram detectados usando um anticorpo contra puromicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Inibição da puromycilation usando cicloheximida.
(A) borrão ocidental, mostrando o efeito de cicloheximida sobre um ensaio de puromycilation 5-min. Eficiência de incorporação em MRC-5, Huh-7 e as células HeLa após simulação (PBS 1x) ou tratamento de cicloheximida. (B) imagem Confocal mostrando o efeito de cicloheximida na incorporação de puromicina. MRC-5 células foram pré-tratadas com PBS (simulação) ou cicloheximida por 15 min e depois completadas com 10 µ g/mL de puromicina + PBS 1x (painel esquerdo) ou 10 µ g/mL de puromicina + 50 µ g/mL de cicloheximida (painel direito) para 5 min. Puromycilated proteínas foram detectados usando um anticorpo contra puromicina (verde). F-Actina foi detectado usando faloidina (vermelho), e o núcleo estava manchado com DAPI (azul). Inserções no lado direito correspondem a uma ampliação de 2,5 x de caixa branca. Bares = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Quantificação da atividade translacional em SICs em células aderentes do MRC-5.
(A-C) Imagem confocal representativa das células aderentes do MRC-5 tratados com 10 puromicina µ g/mL por 5 min. As imagens apresentadas correspondem a parte inferior (A), médio (B)e superior (C) partes da célula. Os painéis superiores mostram as proteínas puromycilated detectadas utilizando um anticorpo contra puromicina (verde). F-Actina foi detectado usando faloidina (vermelho), e o núcleo estava manchado com DAPI (azul). Inserções no lado direito correspondem a uma ampliação de 2x de caixa branca. Bares = 10 μm. Os painéis de médios comprovar a ausência de pixels saturados, o que poderia ter sido destacadas em vermelho. Os painéis inferiores mostram uma representação gráfica de enriquecimento de proteína puromycilated em uma célula de MRC-5 aderente, comparando a intensidade de sinal por puromicina (verde), F-Actina (vermelho), e DAPI (azul) ao longo do eixo da célula indicada pela seta branca. (D-F) As imagens apresentadas correspondem a 4.4 x inserção de ampliação dos SICs apresentado em (A-C). A quantificação mostra a fronteira da SIC (picos vermelhos: actina), bem como uma tradução localizada dentro do SICs (verde picos: puromicina) no mais baixo (D), meio (E), e as regiões superiores (F) da célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Quantificação de células inteiras sinal de puromycilated de proteínas nas células aderentes do MRC-5.
(A) determinação do sinal dentro de diferentes áreas da camada de z-plano de fundo de uma célula de MRC-5 aderente. (Painel esquerdo) Seleção de área (I), cobrindo a totalidade da célula para obter um valor quantitativo correspondente ao sinal de celular total para esta camada plano z. (Painel do meio) Seleção da área celular correspondente para o núcleo e a parte citoplasmática que não inclui SIC (II). (Painel direito) Visualização da área correspondente para o SICs (III) subtraindo o valor obtido a partir da área II do valor obtido para a célula inteira (área eu). Bares = 10 μm. (B) valores de pixel quantitativos para cada área estão listados na tabela para a imagem representando a seleção de área em (A), seguida por um gráfico mostrando a proporção (%) do sinal encontrado no SICs. (C) determinação do sinal dentro de diferentes áreas da camada de z-plano média de uma célula de MRC-5 aderente. (Painel esquerdo) Seleção da área de (I), cobrindo a totalidade da célula para obter um valor quantitativo correspondente ao sinal de celular total para esta camada plano z. (Painel do meio) Seleção da área de célula correspondente para o núcleo e a parte citoplasmática que não inclui SIC (II). (Painel direito) Visualização da área correspondente para o SICs (III) subtraindo o valor obtido para a área II do valor obtido para a célula inteira (área eu). (D) valores de pixel quantitativos para cada área estão listados na tabela para a imagem representando a seleção de área em (C), seguida por um gráfico mostrando a proporção (%) do sinal encontrado no SICs. (E) determinação do sinal dentro de diferentes áreas da camada superior de z-plano de uma célula de MRC-5 aderente. (Painel esquerdo) Seleção da área de (I), cobrindo a totalidade da célula para obter um valor quantitativo correspondente ao sinal de celular total para esta camada plano z. (Painel médio) seleção da área de célula correspondente para o núcleo e a parte citoplasmática que não inclui SICs (II). (Painel direito) Visualização da área correspondente para o SICs (III) subtraindo o valor obtido para a área II do valor obtido para a célula inteira (área eu). (F) valores de pixel quantitativos para cada área estão listados na tabela para a imagem representando a seleção de área em (MI), seguida por um gráfico mostrando a proporção (%) do sinal encontrado no SICs. (G) quantificação valores para todas as camadas de z-plano da célula apresentada acima, incluindo um calculados para z-aviões apresentados na (z = 1), C (z = 9) e (z = 19), que são destacadas em vermelho em cima da mesa. (H) a representação gráfica da percentagem de sinal encontrado no SICs em todo o volume de toda a célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avanços tecnológicos recentes permitiram uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação alta translacional ou a repressão de mRNAs específicos em processos biológicos, tais como o desenvolvimento neuronal, a resposta de drogas e metástase. A metodologia econômica descrita aqui permite que eventos de tradução ser visualizado em células para estudar como RNA-proteínas regulam processos metastáticos, como adesão celular, migração e invasão.
Apesar de inúmeros métodos para avaliar a tradução de proteínas de novo têm sido desenvolvidos, todos eles compartilham a mesma estratégia, no qual o polipeptídeo alongando incorpora modificados aminoácidos marcados com um moiety detectável. O primeiro desses métodos se baseia em 35incorporação S-radiolabeled arginina a proteína recém traduzida. Embora seja eficiente para comparar as taxas gerais de tradução sob condições específicas, o uso de aminoácidos radiolabeled torna este método pouco atraente para a maioria das equipes de pesquisa. Portanto, o desenvolvimento do romance métodos usando rótulos não-radioativo, como o pôr do sol, clique-lo, ou a abordagem de truque, ofereceu novas oportunidades para avaliar e observar, na vivo , eventos de tradução. Embora engenhoso, a maioria desses métodos só permite a avaliação de eventos de tradução após tratamento medicamentoso ou eventos celulares específicos usando um cDNA exógeno específico construir de metas específicas, limitando os experimentos para destinos já identificados . Isto é verdadeiro para o truque abordagem4, que permite o Regulamento translacional de um único alvo de mRNA exogenamente expressa para ser avaliado. Embora permite a validação da ativação translacional de mRNAs endógenas, o tempo de incubação mínima do método de "Clique-lo" para a incorporação de AHA é pelo menos 1 h13, que é considerado muito longo para os mecanismos de tradução mais agudos.
Embora altamente versátil e fácil de configurar, o método descrito aqui requer que a crítica ser seguida na fase inicial do protocolo. Conforme os resultados representativos, linhas de célula diferente terá cinética de incorporação de puromicina diferente, que pode ser simplesmente devido à taxa metabólica de cada linha de celular, como parece ser o caso para MRC-5 células5,21. Com efeito, as células não-transformadas não são tão proliferativas como HeLa, e portanto, renovação em massa de proteína é menos eficiente do que em células transformadas. Isso deve ter em conta ao usar o protocolo. Nesse sentido, a primeira parte do protocolo é fundamental para o resto do método. Cuidadosamente, determinar a concentração de puromicina e o comprimento da incubação permitirá uma melhor avaliação da tradução ocorrem durante o experimento. Como mencionado acima, o tratamento com uma quantidade excessiva de puromicina aumenta a proporção de polipeptídeos pequenos puromycilated e parece estimular a proteólise, que poderia facilmente levar a uma má interpretação do normalmente ocorrem eventos translacionais19 . Como regra geral, quanto mais o tempo de incubação, a menos puromicina é necessária, Considerando que um menor tempo de incubação requer uma maior concentração de puromicina. O concentração/tempo pode ser adaptado às limitações experimentais particulares.
Os métodos apresentados aqui são altamente adaptávelas e pode ser facilmente modificados de acordo com o tratamento aplicado ou o biológico processo estudado. Incorporação de puromicina permite a avaliação rápida das alterações na cinética de tradução durante um curto período de tempo, enquanto o método de quantificação fornece imagens altamente informativas de eventos celulares. Embora poderoso, esses métodos têm limitações que devem ser consideradas. Puromicina será incorporada em proteínas recém sintetizadas todos os mRNAs que ativamente são traduzidos. Por esta razão, o método de puromycilation descrito aqui pode não ser adequado para estudar metas específicas (ou seja, único mRNAs), mas é ideal para obter uma visão geral da atividade de translação dentro de uma única célula ou uma população de células. Como mencionado acima, puromicina excessiva tem grandes inconvenientes e puromicina dosagens e tempos de tratamento devem ser cuidadosamente definidos, como proposto no protocolo. Com efeito, conforme mostrado na Figura 2, disponibilidade de puromicina excessiva resultará na formação de menores puromycilated polipeptídeos que difundem-se mais rapidamente na célula, levando a dados de Localização subcellular imprecisas. Além disso, proteólise aumentada é conhecido para ocorrer após puromicina excessivo tratamento19, um efeito que pode resultar em uma perda completa do sinal.
Embora não tão específico quanto a métodos de truque ou clique-lo, a abordagem aqui proposta é altamente acessível e permite a rápida avaliação de alterações gerais na cinética de tradução. Mesmo que outros métodos são mais adequados para aplicações específicas, ensaios de incorporação de puromicina podem ser realizados como um controle complementar. Com efeito, se o experimento precisa mostrar que uma meta específica do mRNA é o único afetado em uma determinada condição, é necessário mostrar que isto não é causado por um aumento geral na tradução. Como tal, incorporação de puromicina negativo poderia fornecer evidências para este caso. Além disso, este método é adequado para observar alterações gerais em taxas de tradução. Portanto, ele pode ser usado para mostrar a um mecanismo de repressão de tradução, como no caso da formação de grânulo stress9, ou para validar se tratamento cicloheximida usado na fase inicial de translação complexa fracionamento está bloqueando com eficiência alongamento de22. Também é importante mencionar que, embora os métodos de quantificação descritos nas seções 2.3 e 2.4 relacionam experiências, concentrando-se na coloração de puromicina, eles poderiam ser aplicados a qualquer tipo de coloração compartimentada, usando vários tipos de fluorophores. Com efeito, estes métodos de quantificação podem ser usados para quantificar a distribuição celular de uma molécula ou proteína e nem podem validar a localização de um alvo em um compartimento específico subcellular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Quebec, Canadá) para a leitura crítica do manuscrito. Agradecemos a célula Imaging unidade do centro de pesquisa para sua assistência técnica. M.-é Huot é um estudioso de pesquisa Junior 1 do de Fonds Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Este trabalho foi apoiado pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (número CIHR, MOP-286437 de M.-nao de concessão. Huot).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
