Summary
Cet article décrit une méthode pour visualiser et quantifier les événements de traduction localisée dans les compartiments subcellulaires. L’approche proposée dans ce manuscrit nécessite un système d’imagerie confocal base et réactifs et est rapide et rentable.
Abstract
Les mécanismes régulant la traduction de l’ARNm sont impliqués dans divers processus biologiques, tels que le développement des lignes germe, la différenciation cellulaire et organogenèse, ainsi que dans plusieurs maladies. Convaincante, nombreuses publications ont montré que des mécanismes spécifiques réglementent étroitement traduction de l’ARNm. Un intérêt accru dans la régulation induite par la traduction de l’expression protéique a conduit à l’élaboration de nouvelles méthodes pour étudier et suivre de novo protéine synthèse en cellulo. Cependant, la plupart de ces méthodes est complexe, ce qui les rend plus coûteux et souvent limitant le nombre de cibles ARNm qui peuvent être étudiés. Cet article propose une méthode qui nécessite seulement de base réactifs et un système d’imagerie confocal fluorescence de mesurer et de visualiser les changements en traduction de l’ARNm qui se produisent dans n’importe quelle ligne de la cellule dans diverses conditions. Cette méthode a récemment été utilisée pour montrer la traduction localisée dans les structures subcellulaires des cellules adhérentes sur une courte période de temps, offrant ainsi la possibilité de visualiser de novo traduction pendant une courte période au cours de diverses biologiques processus ou de validation des modifications dans l’activité traductionnelle en réponse à des stimuli spécifiques.
Introduction
La régulation de la traduction par différentes fonctions cellulaires a incité de nombreuses équipes de recherche pour développer de nouveaux outils et méthodes pour déterminer la localisation subcellulaire de traduction de l’ARNm et de protéines réglementé synthèse1,2 ,3,4. Ces progrès technologiques récents permettent une meilleure compréhension des mécanismes impliquant upregulation de traduction ou de la répression des ARNm spécifiques au cours de processus biologiques, tels que le développement neuronal, la réaction aux médicaments et la métastase5 ,6,7,8. Cependant, la plupart de ces méthodes nécessite des réactifs coûteux ou dangereuses et des équipements spécifiques qui ne sont peut-être pas disponibles pour la plupart des laboratoires. À ce titre, il a développé une méthode rentable pour permettre l’évaluation rapide des événements de traduction pour précisément à contourner ces problèmes potentiels. Cette méthode détecte des modulations translationnelles aiguës qui se produisent au cours de processus cellulaires spécifiques et permet également la localisation de la traduction à l’aide de la microscopie confocale.
Les méthodes décrites ici ont été utilisés pour surveiller une traduction localisée dans les compartiments subcellulaires appelé épandage initiation centres (SIC)5. SICs sont transitoires structures trouvées dans les cellules ensemencées sont localisés sur le dessus de complexes d’adhérence naissante. Bien que SIC et complexes d’adhérence sont distinctes, leurs destins sont étroitement liés. En effet, SICs sont connus pour disparaître progressivement après maturation complexe adhérence focale dans un site d’adhésion au cours de la phase initiale de l’adhérence. Nous avons constaté que les protéines de liaison à l’ARN connues pour contrôler plus précisément traduction ARNm (p. ex., Sam68, FMRP et G3BP1) et polyadénylé RNAs sont enrichis au sein de ces structures5. En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons montré que la régulation de l’ARNm associés à SIC traduction agit comme un point de contrôle permettant ensemencé les cellules afin de consolider l’adhésion cellulaire. Cette méthode basée sur l’incorporation de la puromycine, pourrait être considérée une version adaptée de la détection de surface d’essai de traduction (coucher du soleil). Développé à l’origine pour mesurer les taux de synthèse protéique globale à l’aide d’un acide aminé non-radioactivement marqué, protéine puromycilation offre un moyen efficace pour visualiser de la synthèse protéique de novo 9. Cette méthode repose sur le comportement intrinsèque de la puromycine, un antibiotique qui bloque la traduction via la terminaison de la chaîne prématurée dans le ribosome10. En effet, la puromycine est structurellement analogue aux tyrosyl-tRNA, qui permet de l’incorporer dans allongeant chaînes peptidiques via la formation d’une liaison peptidique. Cependant, liaison de puromycine à une chaîne peptidique croissante empêche une nouvelle liaison peptidique se forment avec la prochain aminoacyl-tRNA, puisque la puromycine a une liaison amide non hydrolysables au lieu de la liaison ester hydrolysables dans l’ARNt. Ainsi, l’incorporation de puromycine allongeant polypeptides se traduit par la sortie prématurée de nombreux polypeptides puromycilated tronqué correspondant à activement traduction ARNm9,11,12 .
En utilisant cette méthode, il était possible d’évaluer la traduction au sein d’une veuve de peu de temps (par exemple, 5 min) au cours de l’adhésion cellulaire à l’aide d’un anticorps spécifique contre la puromycine sur les cellules qui ont été complétées par l’antibiotique pendant 5 min à différents moments au cours de l’adhésion cellulaire traiter5. La précision de ce test s’appuie sur les anticorps hautement spécifiques dirigés contre la portion puromycilated. Détection par immunofluorescence du polypeptide puromycilated fournit une répartition subcellulaire générale de l’ARNm nouvellement traduit, qui peut aussi être évalués avec une grande précision à l’aide de systèmes d’imagerie confocale.
Par conséquent, cette méthode offre une option pertinente pour un grand nombre de laboratoires d’étude des mécanismes de réglementation translationnelles impliqués dans des processus tels que la granulation neuronale6,13,14, 15, localisation d’ARNm autocatalytiques et traduction au cours du développement16,17. Il est aussi bien adapté à l’étude de traduction localisée ou compartimentée au cours rapides événements biologiques, tels que la migration cellulaire, adhérence ou invasion, ou simplement évaluer les traitements médicamenteux qui pourraient induire des changements translationnelle5, 7 , 18. dans l’ensemble, cette méthode permet la visualisation des événements de traduction localisée ou contrôlé d’une manière rapide, précise et rentable.
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Protocol
1. détermination des Conditions de Puromycilation
Remarque : cette technique décrit la méthode utilisée pour évaluer une traduction localisée au cours de la MRC-5 cell adhesion processus 5. Comme puromycilation peut être fait dans n’importe quelle cellule, il est important d’optimiser les conditions de puromycilation pour les lignées de cellules spécifiques à utiliser, parce que les conditions de traitement ne sont pas identiques pour chaque ligne de la cellule en fonction de la concentration de la puromycine et le désiré temps d’incubation. Pour montrer comment ces conditions sont définies, trois lignées de cellules exemple (c'est-à-dire, HeLa, MRC-5 et Huh-7) ont été traitées avec des concentrations croissantes de puromycine pour temps d’incubation différentes ( Figure 1).
- Grow nombres identiques de cellules dans une plaque 24 puits dans 0,5 mL de la remplir le milieu de culture 16 h avant l’essai. Cellules MRC-5 graines 30 000, 50 000 cellules HeLa ou 50 000 HuH-7 cellules par puits. Veillez à éviter de dépasser les 60-70 % confluence (Figure 1 a).
- Préparer 6 tubes avec 1,5 mL de milieu de culture cellulaire complet avec des concentrations croissantes de puromycine (0, 5, 10, 15, 20 et 30 µg/mL). Préchauffez à 37 ° C.
- Pour chaque concentration du milieu puromycine (document établi en étape 1.2), de transférer 0,5 mL de chaque tuyau dans 6 nouveaux tubes et ajouter cycloheximide à une concentration finale de 50 µg/mL à tous les nouveaux tubes de 6. Préchauffez à 37 ° C.
- Changer le milieu avec 0,5 mL de milieu de culture complet (rangs 1 et 2). Pour la troisième ligne, ajouter 0,5 mL de milieu de culture complet additionné de 50 µg/mL de cycloheximide ( Figure 1 b).
NOTE : Traitement de Cycloheximide a été établie comme le meilleur contrôle négatif pour la protéine puromycilation en raison de sa capacité à bloquer l’élongation de la traduction. Car l’incorporation de la puromycine nécessite élongation de la traduction, traitement de cycloheximide entraîne une perte de puromycilated protéine signaux 5 , 18. - Incuber pendant 15 min à 37 ° C (5 % de CO 2).
- Ajouter 0,5 mL de milieu puromycine préparé à l’étape 1.2 à la deuxième rangée pour obtenir la concentration finale de 0, 2.5, 5, 7.5, 10 et 15 µg/mL, respectivement, dans les colonnes A, B, C, D, E et F. Dans le même temps, ajouter 0,5 mL de puromycine au milieu additionné de cycloheximide (étape 1.3) dans la troisième rangée ( Figure 1).
- Incuber pendant 5 min à 37 ° C (5 % de CO 2).
- Ajouter 0,5 mL de milieu puromycine préparé à l’étape 1.2 au premier rang pour obtenir la concentration finale de 0,0, 2.5, 5, 7.5, 10 et 15 µg/mL ( Figure 1).
- Incuber pendant 5 min à 37 ° C (5 % de CO 2).
- Laver chaque bien à partir de salin rangées 1 à 3 avec 1 mL de glacé 1 X tamponnée au phosphate (PBS) 5 min après l’addition de puromycine aux puits de la première ligne (laver deux fois). Ajouter 75 µL de tampon de X Laemmli 1 (4 % dodécylsulfate de sodium (SDS), 4 % de 2-mercaptoéthanol, 0,120 M Tris-HCl pH 6,8, 0,004 % de bleu de bromophénol et 10 % de glycérol) afin d’obtenir des lysats de cellules entières pour chaque condition.
- Run 10 % électrophorèse SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) en utilisant 1/3 des échantillons préparés à évaluer l’incorporation de la puromycine.
- Déterminer le taux d’incorporation de la puromycine par analyse par Western blot, en utilisant un anticorps anti-puromycine (12 D 10) dilué à raison de 1/25 000 au tampon d’incubation de l’anticorps primaire (2 % sérum d’albumine bovine (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 et 0,01 % azoture de sodium).
NOTE : Les images représentatives correspondant aux différentes cellules ligne extraits faits tel que décrit à l’étape 1 sont montrées comme exemples dans la Figure 2.
- Déterminer le taux d’incorporation de la puromycine par analyse par Western blot, en utilisant un anticorps anti-puromycine (12 D 10) dilué à raison de 1/25 000 au tampon d’incubation de l’anticorps primaire (2 % sérum d’albumine bovine (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 et 0,01 % azoture de sodium).
2. En Cellulo Localisée traduction visualisation
Remarque : la technique décrite ici a été utilisée pour évaluer la traduction localisée au sein de la CSI dans les cellules MRC-5 durant le processus d’adhérence 5. Bien que les cellules MRC-5 sont utilisés ici, autres lignées cellulaires peuvent être utilisées avec la même méthodologie décrite à l’étape 2.1.
- Cellule préparation.
- Détacher MRC-5 cellules à l’aide de l’acide éthylènediaminetétraacétique 0,25 % trypsine/2.21 mM (EDTA) dans Hank ' s Balanced Salt Solution (HBSS). Les cellules de granule par centrifugation (5 min à 200 x g) dans un tube à centrifuger conique de 15 mL et suspendez-les dans Dulbecco ' s Modified Eagle moyenne (DMEM) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) à 40 000 cellules/mL après comptage avec une chambre de comptage. Incuber les cellules suspendues à 37 ° C sous rotation douce utiliser un tube pendant 20 min pour les maintenir en suspension les
- .
Remarque : Cette étape est essentielle afin de permettre la dissociation complète des complexes adhérence focale. - Plaque 2 mL de suspension MRC-5 cellules (40 000 cellules/mL) dans les deux plats de fond en verre 35 mm. Utilisez le premier plat 35 mm fond en verre pour le dosage de la puromycilation (Voir l’étape 2.1.5) et utiliser la seconde comme un contrôle négatif (voir étape 2.1.6).
- Garder les cellules à 37 ° C (5 % CO 2) pendant 55 min permettant l’adhésion cellulaire et la formation de SIC.
- Ajouter la puromycine au milieu dans les plats de fond en verre 35 mm (essai) en utilisant la concentration précédemment définie à l’article 1. Pour traiter les cellules MRC-5, utilisez la puromycine 10 µg/mL pendant 5 min à 37 ° C (5 % CO 2).
- Comme témoin négatif, ajouter cycloheximide au deuxième plat 35 mm fond en verre 40 min après l’ensemencement les cellules pour prétraiter avec 50 cycloheximide µg/mL ( Figure 2 b). Puis, 15 minutes après l’addition de cycloheximide, ajoutez la puromycine au milieu en utilisant le même temps de concentration et d’incubation comme au point 2.1.5 (p. ex., utilisation de 10 µg/mL de puromycine pendant 5 min à 37 ° C (5 % CO 2) de la MRC-5).
- Laver chaque assiette deux fois avec 2 mL de glacé 1 X PBS et fixer les cellules avec 1 mL de 4 % de formaldéhyde (diluée dans une solution 1 PBS X) pendant 15 min à température ambiante (RT).
ATTENTION : Paraformaldéhyde doit être utilisé strictement dans une hotte chimique.
- Immunostaining.
- Après fixation de paraformaldéhyde, laver trois fois avec 2 mL de solution 1 PBS X et incuber 20 min à ta pour permeabilize des cellules dans 500 µL de PBS-TritonX-100 (0,5 %).
- Pour empêcher les anticorps non spécifique, bloquer l’échantillon avec 500 µL PBS – BSA (1 %) pendant 20 min à température ambiante.
- Laver trois fois avec 2 mL de PBS-Tween20 (0,1 %) et incuber à 300 µL de 1:12,500 des anticorps anti-puromycine (12 D 10) dilué dans 1 X PBS pendant 1 h à température ambiante.
- Laver 3 fois avec 2 mL de PBS-Tween20 (0,1 %) et incuber à 300 µL de anti-souris IgG conjugué à un fluorophore (ici, 488 nm) dilué dans du PBS à visualiser les polypeptides puromycilated et avec la phalloïdine conjugué à un autre fluorophore (ici, 555 nm) pour visualiser l’actine F. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver trois fois avec 2 mL de PBS-Tween20 (0,1 %) et puis incuber pendant 5 min à RT dans 300 µL de PBS-Tween20 (0,1 %) additionné de 1 µg/mL 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
- Laver trois fois avec 2 mL de PBS-Tween20 (0,1 %) et laver ensuite avec 2 mL de solution 1 PBS X. Empêcher les cellules de séchage en gardant l’échantillon dans 2 mL de solution 1 PBS X lors de l’acquisition de l’image.
3. Acquisition d’images par immunofluorescence
Remarque : la méthode suivante peut être utilisée avec n’importe quel système d’imagerie confocale commercialement disponible.
- Déterminer le cas échéant les paramètres pour chaque fluorophore pour maximiser la plage dynamique pour la quantification.
NOTE : Quantification représentative ne peut être obtenue que si la saturation des pixels est évitée et le seuil de signal est correctement réglé. Ces réglages peuvent être atteints en ajustant soigneusement la puissance du laser, haute tension (HT), le gain, et l’offset. Facteur- régler le zoom (5 X) et le nombre de pixels (512 x 512) afin d’optimiser la taille en pixels.
Remarque : Cela devrait être au moins 2.3 - fois plus petite que la résolution optique, selon le théorème de Nyquist. - Diminuer la vitesse de balayage (12.5-20 µs/pixel) et utiliser une moyenne (2 - 3 fois) pour améliorer le rapport signal-bruit selon les paramètres mentionnés ci-dessus.
- régler le zoom (5 X) et le nombre de pixels (512 x 512) afin d’optimiser la taille en pixels.
- Manuellement déterminer approprié haut et en bas des plans focaux le long de l’axe z avec la taille de palier optimale (0,4 µm/tranche).
Remarque : Le plan étagé taille est déterminé par la résolution axiale divisée par 2.3, selon le théorème de Nyquist. En règle générale, 20-25 couches sont nécessaires pour couvrir la profondeur de la cellule entière de cellules adhérentes. - Acquérir une image confocale d’une cellule unique entière avec un objectif à immersion d’huile X Plan Apo 60 (ouverture numérique 1,42).
4. Par immunofluorescence Image Quantification
- détermination d’enrichissement.
- Ouvrir une image correspondant à la couche de z-plane d’intérêt depuis le fichier de données de cellule acquise en utilisant le logiciel ImageJ (freeware disponible à http://fiji.sc).
- Tracer une ligne à l’aide de l’outil de ligne de démarcation (barre d’outils → droites) à travers les régions de la cellule où la quantification est souhaitée. Modifier la largeur de la ligne en double-cliquant sur " droite ; " les valeurs d’intensité seront en moyenne à travers la largeur de la ligne (fixé à 8 dans la Figure 3).
Remarque : Une ligne plus fine est préférable pour éviter les chevauchements de signal de différentes structures.
Profil de - après que la ligne est correctement réglée, la densité du signal le long de l’axe déterminé (barre de menu → Analyze → tracer le profil).
Remarque : Une nouvelle fenêtre s’ouvre qui affiche un profil correspondant à l’intensité du signal pour chaque pixel du canal sélectionné (fluorophore spécifique) le long de la ligne de la section sélectionnée du plan z.- Répéter le processus pour chaque canal correspondant à la molécule utilisée (c'est-à-dire, une quantification pour 488, une pour 568 et 405).
Remarque : La valeur d’intensité de signal sera toujours ordonnée suivant l’orientation de la ligne tracée.
- Répéter le processus pour chaque canal correspondant à la molécule utilisée (c'est-à-dire, une quantification pour 488, une pour 568 et 405).
- Pour obtenir les valeurs de gris-mise à l’échelle numériques de chaque pixel du profil correspondant à des analyses quantitatives du calque sélectionné plan z, copiez les données de profil (barre de menu dans la fenêtre d’image → copie) et collez-le dans n’importe quel tableur. 4.1.1-4.1.4
- répéter les étapes pour chaque section de z-plane de l’image confocale acquise et chaque canal où la quantification est souhaitée.
Remarque : La quantification des différentes couches de z-plane peut être mis en commun afin d’obtenir une évaluation générale de l’enrichissement spécial du signal en calculant la valeur de la somme de chaque pixel le long de la ligne pour chaque couche de plan z. Ce type de regroupement ne peut être atteint que si le tracé est identique pour chaque couche de plan z inclus dans les valeurs moyennes relevées. - Comme une méthode alternative pour la quantification des cellules entières de canaux différents, avec un grand nombre de couches, utilisez la macro appelée StackprofileData (voir le Fichier supplémentaire).
Remarque : Cette macro est accessible librement à https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt et peut être utilisée comme suit :- coller la macro dans un fichier texte et enregistrez it.
- Ouvrir le fichier image qui comprend l’ensemble des couches de la cellule confocale.
- Tracer une ligne, comme indiqué au point 4.1.2, ouvrez une nouvelle fenêtre pour importer la macro (barre de menu → Plugins → Macros → Run), choisissez le fichier texte enregistré précédemment correspondant à la macro StackprofileData, puis cliquez sur " ouvert. "
Remarque : Après l’importation de macro, une nouvelle fenêtre nommée " résultats " s’ouvrira et toutes la quantification sur l’axe déterminé seront affiché pour chaque couche de plan z et canal présents dans les fichiers image. - Copier les données pour chaque canal (barre de menu → modifier → copie) pour obtenir la représentation graphique profil correspondant à des analyses quantitatives de signal. Collez-le dans n’importe quel tableur. Calculer la valeur de la somme de chaque canal pour chaque pixel le long de la ligne pour chaque couche de plan z. Utilisez ces valeurs pour créer une représentation graphique similaire à celle présentée dans la Figure 3.
- Quantification du signal dans une zone désignée de cellulaire ou volume.
- Ouvrir le fichier image avec logiciel ImageJ.
- Tracer une zone pour indiquer la zone d’intérêt en utilisant la fonction de la forme géométrique (barre d’outils → " rectangle, " " ovale, " ou " polygone ").
Remarque : La valeur de quantification sera déterminée pour la zone correspondant à la forme dessinée. - Régler le niveau de seuil afin d’éviter tout signal de fond (barre de menu → ajustement d’Image → seuil) ; une nouvelle fenêtre s’affiche pour représenter les intensités de pixels sous forme d’histogramme. Modifiez les valeurs pour inclure/exclure des pixels dans la quantification à l’aide du curseur. Sélectionnez un seuil qui élimine les pixels rouges à l’extérieur de la cellule, comme pixels surlignés en rouge seront incluses dans la quantification.
- Définir les paramètres de mesure pour quantifier le signal de pixels dans la zone sélectionnée, sans signal de fond (barre de menu → Analyze → définir des mesures) et assurez-vous de vérifier la " jusqu’au seuil de " et le " densité intégrée " boîtes.
- Mesurer les valeurs quantitatives pour la zone sélectionnée (barre de menu → Analyze → mesure).
NOTE : Quantification intensité de Signal sera présentée dans une nouvelle fenêtre sous le " IntDen " identification, ce qui représente le produit des valeurs de gris moyens et le nombre de pixels dans la zone sélectionnée. - Tracer une zone qui comprend toute la cellule à l’aide d’une forme géométrique (barre d’outils → " rectangle, " " ovale, " ou " polygone ") et de procéder à des mesures 4.2.3-4.2.5 afin d’obtenir une valeur correspondant au signal total. Calculer le rapport du signal au sein de la zone sélectionnée sur le signal entier pour obtenir le pourcentage du niveau du signal dans la zone d’intérêt.
- 4.2.2-4.2.6 mesures répétées pour obtenir la quantification du volume des cellules pour chaque plan z. S’adapter à la forme géométrique suff.
- Copier/coller les données obtenues de la " des résultats " windows pour chaque couche de z-plane dans un tableur pour schéma explicatif et de trouver une valeur moyenne.
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Representative Results
Pour précisément observer les événements de traduction à l’aide d’incorporation de la puromycine, il est essentiel de déterminer les conditions optimales pour chaque lignée cellulaire car chacun montre différents puromycine incorporation cinétique (Figure 1)9,11 ,12,18. Par conséquent, afin de valider l’incorporation de la puromycine, il est nécessaire de traiter la ligne de la cellule souhaitée avec une gamme standardisée de concentrations croissantes de puromycine (1,0, 2,5, 5,0, 7.5, 10.0 et 15,0 µg/mL) pour différentes périodes de temps (5 et 10 min). Pour évaluer la traduction localisée ou un début de réponse aux traitements médicamenteux, un temps d’incubation plus court est préféré (par exemple, moins de 5 min), car il permet l’évaluation directe des événements translationnelles directement après un traitement spécifique. Idéalement, le signal de puromycine devrait être facilement détectable, mais doit aussi éviter le point de saturation (Figure 2). Comme illustré à la Figure 2 (panneaux de gauche), une concentration de puromycine acceptable est 7,5-10,0 µg/mL pour le MRC-5 et HeLa, tandis que 5,0 à 7,5 µg/mL de puromycine est suggérée pour Huh-7. Optimisation des paramètres expérimentaux est cruciale parce que le but de cette méthode n’est ne pas à inhiber complètement toute élongation translationnelle au moment de l’initiation mais tag nouvellement chaînes polypeptidiques synthétisée lors de la traduction pour détecter aiguë variations dans la traduction. Cette phase initiale dans le protocole ne doit pas être négligé, comme excessif puromycine disponibilité et durée de traitement prolongée entraînera des conséquences indésirables majeurs. Comme indiqué dans la Figure 2 (panneaux de droite), les cellules traitées pendant 10 min avec une concentration élevée de puromycine générera plus souvent plus petits polypeptides puromycilated (p. ex., Huh-7, 7,5 µg/mL ou plus pendant 10 min). Ces plus petits polypeptides diffusera plus rapidement dans la cellule, ce qui pourrait interférer avec l’évaluer avec précision la localisation subcellulaire. Un autre problème est cette protéolyse accrue se produit en cas de traitement de puromycine excessif19. Ce résultat a été observé dans les cellules MRC-5 et HeLa traitées pendant 10 min, ce qui montre l’intensité du signal diminuée en présence de 10 à 15 µg/mL de puromycine. Deux de ces phénomènes sont trompeuses si incorporation puromycine est évaluée par immunofluorescence car diffusion accrue empêche la visualisation précise de traduction, localisation, alors que la dégradation puromycine diminue considérablement sensibilité de détection. Ces conséquences fâcheuses sont facilement contournées en définissant correctement les conditions expérimentales optimales, tel que décrit à l’article 1 du protocole.
Tout en visualisant l’incorporation de la puromycine, il est également important d’effectuer les contrôles appropriés. Tel qu’illustré à la Figure 3 a, incorporation de puromycine peut être efficacement bloquée par l’ajout de 50 cycloheximide µg/mL, un composé connu pour inhiber la translation élongation20 et donc l’incorporation de la puromycine. Ce comportement est illustré dans la Figure 3 b, qui montre que le traitement de cycloheximide empêche efficacement la plupart du signal correspondant à l’incorporation de la puromycine dans les cellules adhérentes de MRC-5. En effet, alors que les peptides puromycilated peuvent être visualisées dans les cellules traitées avec seulement la puromycine, un signal faible est détecté dans les cellules qui ont été également traitées avec le cycloheximide dans des conditions identiques de coloration. Sinon, un autre antibiotique (anisomycine) également utilisable comme contrôle négatif, car il possède la capacité de bloquer la peptidyl transférase activité5 et s’est avéré aussi efficace que la cycloheximide à blocage incorporation puromycine5 ,18
Suite à une acquisition d’images par immunofluorescence, il est possible d’évaluer la localisation générale de polypeptides puromycilated correspondant à nouvellement synthétisée de protéines (Figure 4). Calques de l’image sont sélectionnées à différentes profondeurs dans les cellules adhérentes, ce qui permet de l’intensité du signal dans les compartiments subcellulaires à évaluer dans différentes cellules planes. Par conséquent, il est possible de comparer la réaction de puromycilation localisée au bas de la cellule (Figure 4 a), au milieu de la cellule (Figure 4 b), ou la partie supérieure de la cellule (Figure 4). Situé légèrement au-dessus naissante et les plaques d’adhérence, SICs sont principalement observés dans le milieu de la cellule. Comme prévu, puromycilation intense est détectée au SICs, suggérant qu’il s’agit d’une traduction de l’ARNm isolée de ces structures subcellulaires. Tel que mentionné précédemment, il est possible de comparer l’intensité du signal le long d’un axe désirée. Cette comparaison n’est possible que si les images acquises ne comprennent pas saturés pixels qui apparaissent en rouges dans l’image en niveaux de gris (second panneaux du haut) obtenues à l’aide de la loupe, logiciel d’exploitation. Ces images peuvent être importés dans le logiciel ImageJ pour la quantification et l’analyse de l’intensité du pixel suivant un axe désigné. La quantification de pixel peut être représentée graphiquement (panneau central) pour illustrer l’intensité relative de pixels à des postes désignés le long de l’axe. Regarder de plus près l’insert dans les panneaux supérieurs montre les limites de SIC-actine (en rouge) et un signal vert au sein de la structure qui correspond aux événements de traduction très active, qui se sont enrichis au sein de ces structures (partie inférieure). Bien que cette méthode de quantification n’est pas la meilleure façon de déterminer le pourcentage exact de la traduction totale survenant dans ces structures, il est visuellement informatif en permettant une évaluation rapide de l’intensité du signal et est une bonne approximation de la distribution des signaux tout au long de la cellule.
Pour obtenir une répartition quantitative du signal dans la cellule entière, une autre méthode doit être utilisée. Comme illustré à la Figure 5, est une des étapes clés pour désigner les domaines d’intérêt qui doivent être quantifiées pour chaque plan z composer les fichiers image confocale. Cette affectation peut être réalisée à l’aide d’un outil de dessin différent trouvé dans ImageJ. En utilisant cette méthode, il est possible de quantifier un espace unique ou plusieurs zones, qui peuvent alors être comparés, soustrait ou même compilés. Les principales difficultés sont à : (i) trouver l’imagerie optimale des conditions éviter saturation pixel et le signal de fond, qui peut dénaturer la valeur quantitative du signal obtenu et (ii) établir une calibration optimale du seuil dans ImageJ. En supposant que ces deux conditions sont optimales, cette méthode de quantification est très reproductible, tout en restant facile à exécuter. Avant l’acquisition de l’image, il est également important de déterminer avec soin les limites inférieures et supérieures des plans-z de la cellule sélectionnée pour la quantification. Dans le cas présenté dans la Figure 4, la partie inférieure correspond à la limite de résolution de l’objectif, qui inclut souvent la contaminer fluorescence évanescente, qui permet de réduire le ratio de signal corps SIC/cellule. Tel que mentionné plus haut, SICs sont impliqués dans la formation d’adhérences site et maturation ; par conséquent, des structures SIC sont situés légèrement au-dessus nouvellement formant des complexes de l’adhérence, qui exclut la fluorescence évanescent des couches plus basses. Ainsi, le signal de puromycilation SIC-limite est à peine visible dans les sections inférieures, alors que nous pouvons clairement obsErve dans la section médiane, expliquant l’augmentation du rapport corps SIC/cellulaire signal dans la région médiane par rapport aux plans du supérieurs ou inférieurs.
La figure 1. Représentation sous forme expérimentale de l’optimisation du traitement puromycine décrite à l’article 1.
(A) une représentation de 24 puits de cellules étant ensemencées pour l’expérimentation (étape 1.1). (B) représentation schématique de l’étape 1.4 montrant le changement moyen dans les rangées 1 et 2 de la plaque 24 puits et l’ajout de cycloheximide (CHX) dans chaque puits de la troisième rangée pour une concentration finale de 50 µg/mL. (C) représentation schématique du traitement puromycine dans les deuxième et troisième rangées (étape 1.6) 15 min après l’étape 1.4. (D) représentation schématique du traitement puromycine dans la première rangée (étape 1.8) 5 min après l’étape 1.6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. Détermination des conditions optimales pour l’incorporation de la puromycine.
Analyse par Western blot de la cellule entière extrait de (A)MRC-5, (B) Huh-7 et (C) les cellules HeLa, incubées avec des concentrations croissantes de puromycine (0, 2.5, 5, 7.5, 10 et 15 µg/mL) pendant une période de 5 min (panneaux de gauche) ou 10 min (à droite panneaux). Peptides de Puromycilated ont été détectés à l’aide d’un anticorps dirigé contre la puromycine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Inhibition de la puromycilation à l’aide de cycloheximide.
(A) la tache occidentale illustrant l’effet de cycloheximide sur un essai de 5 min puromycilation. Efficacité de l’incorporation dans la MRC-5, Huh-7 et les cellules HeLa suite mock (PBS 1 X) ou traitement de cycloheximide. (B) image confocale montrant l’effet de cycloheximide sur l’incorporation de la puromycine. MRC-5 cellules ont été pré-traitées avec PBS (fictifs) ou de cycloheximide pendant 15 min et puis additionnés de 10 µg/mL de puromycine + PBS 1 X (panneau de gauche) ou 10 µg/mL de puromycine + 50 µg/mL de cycloheximide (panneau de droite) pour 5 min. Puromycilated protéines ont été détectés à l’aide d’un anticorps dirigé contre la puromycine (vert). Actine F a été détectée à l’aide de la phalloïdine (rouge), et le noyau était Taché au DAPI (bleu). Encarts à droite correspondant à un grossissement 2,5 x de la case blanche. Barres = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 4. Quantification de l’activité traductionnelle dans CSI dans les cellules adhérentes de MRC-5.
(A-C) Image confocale représentative des cellules adhérentes de MRC-5 traités avec la puromycine 10 µg/mL pendant 5 min. Les images présentées correspondent à la bas (A), moyen (B)et supérieure (C) certaines parties de la cellule. Les panneaux supérieurs montrent les protéines puromycilated détectés à l’aide d’un anticorps dirigé contre la puromycine (vert). Actine F a été détectée à l’aide de la phalloïdine (rouge), et le noyau était Taché au DAPI (bleu). Encarts à droite correspondant à un grossissement de 2 x de la boîte blanche. Barres = 10 μm. Les panneaux milieu montrent l’absence de pixels saturés, ce qui aurait été souligné en rouge. Les panneaux inférieurs montrent une représentation graphique de l’enrichissement en protéines puromycilated dans une cellule de MRC-5 adhérente en comparant l’intensité du signal pour la puromycine (vert), actine F (rouge), et au DAPI (bleu) le long de l’axe de la cellule indiquée par la flèche blanche. (D-F) Les images présentées correspondent à la 4.4 x insert de grossissement de la SIC présentée en (A-C). La quantification montre la frontière SIC (pics rouges : actine), ainsi que de traduction localisée dans les SICs (vert pics : puromycine) le plus bas (D), le milieu (E), et les régions supérieures de (F) de la cellule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 5. Quantification de signal de cellules entières de puromycilated des protéines dans les cellules adhérentes de MRC-5.
(A) détermination du niveau du signal dans différents domaines de la couche inférieure de z-plan d’une cellule adhérente de la MRC-5. (Panneau de gauche) Sélection de zone (I) couvrant la totalité de la cellule pour obtenir une valeur quantitative correspondant au signal cellulaire total pour cette couche plan z. (Panneau de milieu) Sélection de la zone cellulaire correspondant pour le noyau et la partie cytoplasmique qui ne comprend pas de SIC (II). (Panneau de droite) Visualisation de la zone correspondant à la SIC (III) en soustrayant la valeur obtenue par zone II de la valeur obtenue pour la cellule entière (zone I). Barres = 10 μm. (B) valeurs quantitatives pixel pour chaque zone sont répertoriés dans le tableau pour l’image illustrant la zone de sélection (a), suivie d’un graphique montrant la proportion (%) du signal trouvé dans SIC. (C) détermination du signal dans différents domaines de la couche de milieu plan z d’une cellule adhérente de la MRC-5. (Panneau de gauche) Sélection de la zone (I) couvrant la totalité de la cellule pour obtenir une valeur quantitative correspondant au signal cellulaire total pour cette couche plan z. (Panneau de milieu) Sélection de la zone de cellules correspondant pour le noyau et la partie cytoplasmique qui ne comprend pas de SIC (II). (Panneau de droite) Visualisation de la zone correspondant à la SIC (III) en soustrayant la valeur obtenue pour la zone II de la valeur obtenue pour la cellule entière (zone I). (D) les valeurs quantitatives pixel pour chacune des zones sont répertoriées dans le tableau pour l’image illustrant la zone de sélection (c), suivie d’un graphique montrant la proportion (%) du signal trouvé dans SIC. (E) détermination du signal dans différents domaines de la couche supérieure du plan z d’une cellule adhérente de la MRC-5. (Panneau de gauche) Sélection de la zone (I) couvrant la totalité de la cellule pour obtenir une valeur quantitative correspondant au signal cellulaire totale pour cette couche plan z. (Panneau du milieu) sélection de la zone de cellules correspondant pour le noyau et la partie cytoplasmique qui n’est pas inclut SICs (II). (Panneau de droite) Visualisation de la zone correspondant à la SIC (III) en soustrayant la valeur obtenue pour la zone II de la valeur obtenue pour la cellule entière (zone I). (F) valeurs quantitatives pixel pour chaque zone sont répertoriés dans le tableau pour l’image illustrant la zone de sélection (e), suivie d’un graphique montrant la proportion (%) du signal trouvé dans SIC. (G) valeurs de Quantification pour toutes les couches de z-plane de la cellule présentées ci-dessus, dont un calculé pour z-avions présentés dans A (z = 1), C (z = 9) et E (z = 19), qui sont surlignées en rouge sur la table. (H) une représentation graphique du pourcentage de signal trouvé dans SICs dans tout le volume de la cellule entière. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les progrès technologiques récents ont permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’upregulation translationnelle ou la répression d’ARNm spécifiques dans des processus biologiques, tels que le développement neuronal, la réaction aux médicaments et la métastase. La méthodologie économique décrite ici permet aux événements de traduction à visualiser dans les cellules afin d’étudier comment les protéines de liaison à l’ARN régulent les processus métastatiques, tels que l’adhésion cellulaire, la migration et invasion.
Bien que de nombreuses méthodes pour évaluer la traduction des protéines de novo ont été développés, ils partagent tous la même stratégie, dans lequel le polypeptide en élongation incorpore des acides aminés modifiés taggés une portion détectable. La première de ces méthodes dépend de 35S-radiomarqué arginine incorporation les protéines nouvellement traduit. Bien qu’il soit efficace pour comparer les taux généraux de traduction dans des conditions particulières, l’utilisation des acides aminés radioactifs rend cette méthode peu attrayant pour la plupart des équipes de recherche. Donc, le développement de nouvelles méthodes à l’aide d’étiquettes non radioactive, comme le coucher du soleil, Click-it, ou l’approche de la tour, offert de nouvelles possibilités d’évaluer et d’observer in vivo les événements de la traduction. Bien qu’ingénieux, la plupart de ces méthodes ne permettre pour l’évaluation des événements de traduction après traitement médicamenteux ou des événements cellulaires spécifiques à l’aide d’un ADNc spécifique exogène construire des objectifs spécifiques, en limitant les expériences aux cibles déjà identifiées . Cela est vrai pour le truc approche4, qui permet la régulation traductionnelle d’une cible unique des ARNm exogène exprimée à évaluer. Même si elle admet la validation de l’activation translationnelle des ARNm endogènes, le temps d’incubation minimale de méthode « Click-IT » pour l’incorporation de l’AHA est au moins 1 h13, qui est considéré comme trop long pour des mécanismes de traduction plus pénétrant.
Bien que très souple et facile à mettre en place, la méthode décrite ici requiert que suivre les étapes cruciales dans la phase initiale du protocole. Comme le montre les résultats représentatifs, différentes lignées cellulaires aura cinétique d’incorporation puromycine différent, qui pourrait être tout simplement en raison du taux métabolique de chaque lignée cellulaire, comme cela semble être le cas pour les MRC-5 cellules5,21. En effet, les cellules non transformées ne sont pas aussi prolifératives comme HeLa, et donc, renouvellement de masse de protéine est moins robuste que dans les cellules transformées. Il devrait être tenu compte lors de l’utilisation du protocole. En conséquence, la première partie du protocole est critique pour le reste de la méthode. Déterminer avec soin la concentration de puromycine et la durée d’incubation permettra une meilleure évaluation de la traduction qui se produisent pendant l’expérience. Comme mentionné ci-dessus, un traitement avec une quantité excessive de puromycine augmente le ratio de puromycilated petits polypeptides et semble stimuler la protéolyse, qui pourrait facilement conduire à une interprétation erronée du normalement se produisant translationnelles événements19 . En règle générale, plus le temps d’incubation, moins la puromycine est nécessaire, alors qu’un temps d’incubation plus court nécessite une concentration plus élevée de la puromycine. La concentration/temps peuvent être adapté aux limitations expérimentales particulières.
Les méthodes présentées ici sont très adaptables et peuvent facilement être modifiés selon le traitement appliqué ou biologique processus étudié. Incorporation de puromycine permet l’évaluation rapide de l’évolution cinétique de translation sur une courte période de temps, tandis que la méthode de quantification fournit des images très instructives des événements cellulaires. Bien que puissant, ces méthodes ont des limites qui doivent être considérés. La puromycine est incorporée dans les protéines nouvellement synthétisées à partir de tous les ARNm est traduits activement. Pour cette raison, la méthode puromycilation décrite ici n’est peut-être pas adaptée à l’étude des cibles spécifiques (p. ex., seul ARNm), mais elle est idéale pour obtenir un aperçu général de l’activité traductionnelle au sein d’une cellule unique ou une population de cellules. Comme mentionné ci-dessus, la puromycine excessive a des inconvénients majeurs et dosages de puromycine et les temps de traitement doivent être soigneusement définis, sous la forme proposée dans le protocole. En effet, comme illustré à la Figure 2, disponibilité de puromycine excessive se traduira par la formation de plus petits polypeptides puromycilated qui diffuse plus rapidement dans la cellule, conduisant à des données de localisation sous-cellulaire inexactes. En outre, protéolyse accrue est connue pour se produire après la puromycine excessive traitement19, un effet qui pourrait entraîner une perte complète du signal.
Bien que pas aussi précis que la méthode Click-it ou truc, l’approche proposée ici est très accessible et permet une évaluation rapide de l’évolution générale de la cinétique de translation. Tests d’incorporation de puromycine peuvent s’effectuer même si autres méthodes sont mieux adaptés pour des applications spécifiques, comme un contrôle supplémentaire. En effet, si l’expérience a besoin de montrer qu’une cible spécifique de l’ARNm est le seul touché dans une condition particulière, il est nécessaire de montrer que ce n’est pas causé par une augmentation générale de la traduction. À ce titre, incorporation de puromycine négatif pouvait apporter la preuve dans cette affaire. En outre, cette méthode est bien adaptée à l’observation des changements généraux dans les tarifs de traduction. Par conséquent, il peut être utilisé pour montrer un mécanisme de répression de traduction, comme dans le cas de contrainte granule formation9, ou pour valider si traitement de cycloheximide utilisé dans la phase initiale de fractionnement complexe translationnelle bloque efficacement élongation22. Il est également important de mentionner que, bien que les méthodes de quantification décrites dans les sections 2.3 et 2.4 se rapportent à des expériences en se concentrant sur la coloration de la puromycine, elles pourraient être appliquées à n’importe quel type de coloration compartimentée en utilisant divers types de fluorophores. En effet, ces méthodes de quantification pourraient être utilisées pour quantifier la distribution cellulaire d’une molécule ou de protéines et peuvent même valider la localisation d’une cible dans un compartiment subcellulaire spécifique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canada) pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions l’unité d’imagerie cellulaire du centre de recherche pour leur assistance technique. M.-é. Huot est chercheur Junior 1 du Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Ce travail a été soutenu par les instituts de recherche en santé (accorder le nombre des IRSC, MOP-286437 de m-É. Huot).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
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