Summary
本稿では、可視化し、細胞内コンパートメントのローカライズされた翻訳イベントを定量化する方法について説明します。本稿で提案する手法は基本的な共焦点イメージング システムと試薬が必要です、迅速かつ費用対効果。
Abstract
MRNA の翻訳を規定しているメカニズムは、複数の疾患だけでなく生殖細胞形成、細胞分化と器官形成などの様々 な生物学的過程に関与しています。多数の出版物は説得力のある特定のメカニズムがしっかりと mRNA の翻訳を調節する示されています。蛋白質の表現の翻訳による規制の高められた興味は調査し次のde novoタンパク質合成cellulo の新規手法の開発につながっています。ただし、これらのメソッドのほとんどは複雑で、高価なそれらを作ると、よく学ぶことができます mRNA ターゲット数の制限します。この原稿は、のみ基本的な試薬とを測定し、様々 な条件の下で任意のセルの行で発生する mRNA の翻訳の変化を可視化する共焦点蛍光イメージング システム必要とする手法を提案します。このメソッドはさまざまな生物の中に短い期間のde novo翻訳を可視化する可能性を提供しています、時間の短い期間で付着性のセルの細胞内の構造にローカライズした訳語を表示する最近使用されました。プロセスまたは特定の刺激への応答の橋渡し活動の変更を検証します。
Introduction
翻訳さまざまな細胞機能の調節は、新しいツールや mRNA の翻訳と規制タンパク質合成1,2 の細胞レベル下の局在を決定する方法を開発する多くの研究チームを求めています。、3,4。これらの最近の技術の進歩により翻訳アップレギュレーションや神経の開発、薬剤応答、5 転移などの生物学的プロセスの間に特定の Mrna の抑圧のメカニズムの理解の改善 ,6,7,8。ただし、これらのメソッドのほとんどは、高価なまたは危険な試薬およびほとんどの実験室にできない可能性があります特定の機器を必要。など、翻訳イベントの迅速な評価を可能にするコスト効果の高い方法は、具体的には、これらの潜在的な問題を回避するために開発されました。このメソッドは、特定の細胞プロセス中に発生する急性の並進変調を検出し、共焦点顕微鏡を用いた翻訳の局在化のためことができます。
ここで説明した方法は、拡散開始センター (SIC)5と呼ばれる細胞レベル下コンパートメント内にあるローカライズされた翻訳を監視する使用されました。Sic は、シード細胞初期接着複合体の上にローカライズされる一時的な構造です。Sic および接着複合体が異なるが、彼らの運命は密接に関連します。確かに、接着の初期段階で密着サイトへと焦点接着の複雑な成熟化に徐々 に消えてしまう Sic が知られています。分かった mRNA 翻訳 (例えばSam68、FMRP、および G3BP1) を具体的に制御する知られている RNA 結合蛋白質と Rna は、これらの濃縮した polyadenylated 構造5。ここで説明する方法を使用して、細胞接着の統合セルを SIC 関連 mRNA の翻訳ができるようにチェックポイントとして行為の規制にシードを紹介しました。翻訳の試金 (日没) の表面検出の適応バージョン ピューロマイシン定款に基づいて、このメソッドが考えられます。もともと非放射能標識アミノ酸を使用した世界のタンパク質合成速度を測定するために開発され、蛋白質 puromycilation はde novoタンパク質合成9を可視化する効率的な方法を提供しています。このメソッドは、ピューロマイシン、リボソーム10で時期尚早鎖終結経由で翻訳をブロックする抗生物質の固有の動作に依存します。確かに、ピューロマイシンはペプチド結合の形成によるペプチド鎖の伸長に混入の可能チロシル tRNA に構造的に似ています。しかし、成長しているペプチド鎖にピューロマイシン結合は、ピューロマイシン Trna の加水分解性エステル結合ではなく非加水分解性アミド結合を持っているので、次のアミノアシル tRNA が形成されてから新しいペプチド結合を防ぎます。したがって、ポリペプチド鎖の伸長にピューロマイシン定款の9,mRNA 積極的に翻訳された11,12 に対応する多数の切り捨てられた puromycilated ポリペプチドの早期リリースで結果します。.
このメソッドを使用すると、短時間未亡人内でアクティブな翻訳を評価することが可能だった (など5 分) 5 分期間の抗生物質と補われた細胞ピューロマイシンに対して指示される抗体を用いた細胞接着中細胞接着中に異なる時点で5を処理します。本法の精度は puromycilated 部位に対する特異性の高い抗体に依存しています。Puromycilated ポリペプチドの蛍光検出では、共焦点イメージング システムを使用して非常に正確に定量化することができますも新たに翻訳された mRNA の一般的な細胞レベル下の再パーティション化を提供します。
したがって、このメソッドは、神経肉芽6,13,14,などのプロセスに関与する並進運動の調節機構を調査する実験室の多数の関連するオプションを提供しています15、モルフォゲン mRNA の局在、および開発16,17時に翻訳。それはまた急速な生命現象、細胞遊走、接着、浸潤などまたは単に並進変更5,を誘導するかもしれない薬物治療を評価するために中にローカライズ済みまたは区分の翻訳の勉強にも適しています7,18. 全体的にみて、この方法は迅速かつ正確でコスト効果の高い方法でローカライズ済みまたは制御された翻訳イベントの可視化すること。
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Protocol
1 です。 Puromycilation 条件の定量
注: この手法 MRC 5 セル接着プロセス 5 中にローカライズされた翻訳を評価する方法について説明します。Puromycilation は、任意のセルで行うことができます、処理条件が各セルライン ピューロマイシン濃度と目的の面で同一ではないので、使用する特定のセル行の puromycilation 条件を最適化することが重要です。インキュベーション時間。ピューロマイシン濃度の異なるインキュベーション時間の増加で処理した 3 例のセル行 (すなわち、 hela 細胞、MRC-5、およびホ-7)、これらの条件を定義する方法を表示する ( 図 1).
- 成長の適切な 0.5 mL で 24 ウェル プレート内のセルの同じ数字を培 16 h テストの前に完了します。種 30,000 MRC 5 セル、50,000 の HeLa 細胞あるいはウェルあたり 50,000 の許 7 セル。60-70% 合流点 (図 1 a) を超えないようにすることを確認します 。
- 準備 6 ピューロマイシン (0、5、10、15、20、および 30 μ g/mL) の濃度の増加との完全な細胞培養液 1.5 ml チューブします。37 ° C であらかじめ暖かい
- は、ピューロマイシン媒体 (の準備ステップ 1.2) の各濃度転送から 0.5 mL のそれぞれは 6 の新しいチューブにチューブ、最終 50 μ G/ml の濃度ですべて 6 新しいチューブ シクロヘキシミドを追加します。37 ° C であらかじめ暖かい
- は、0.5 ml の完全培地 (行 1 および 2) の媒体を変更します。3 行目、シクロヘキシミド ( 図 1 b) の 50 μ g/mL を添加した完全な培養液 0.5 mL を追加します
。 注: シクロヘキシミド治療法は、翻訳伸長をブロックする機能のための蛋白質の puromycilation の最高のネガティブ コントロールとして確立されています。シクロヘキシミド処理が puromycilated 蛋白質信号 5 , 18 の損失につながるピューロマイシン定款翻訳伸長する必要があるためです 。
- 37 ° c (5% CO 2) 15 分間インキュベートします 。
- は、それぞれ列 A、B、C、D、E、および F の最終濃度 0、2.5、5、7.5、10、15 μ G/ml を取得する 2 番目の行に手順 1.2 で調製したピューロマイシン培地の 0.5 mL を追加します。同時にシクロヘキシミド添加培地に (手順 1.3) ( 図 1) の 3 番目の行の後 0.5 mL を追加します 。
- 37 ° C (5% CO 2) で 5 分間インキュベートします 。
- 0.0、2.5、5、7.5、10、15 μ G/ml ( 図 1) の最終濃度を取得する最初の行にステップ 1.2 で調製したピューロマイシン培地の 0.5 mL 追加します 。
- 37 ° C (5% CO 2) で 5 分間インキュベートします 。
- は、それぞれ洗ってリン酸緩衝の冷たい 1 X ml の 1 行 1 に 3 生理食塩水 (PBS) 添加後 5 分 (二度洗い) の最初の行の井戸を後からも。1 X Laemmli バッファーを 75 μ l 添加 (4% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、4 %2-メルカプトエタノール、0.120 M トリス塩酸 pH 6.8, 0.004% ブロモフェノールの青、および 10% グリセロール) 条件ごとに全体セル lysates を取得する 。
- 実行 10 %sds ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) ピューロマイシン定款を評価するために作製した試料の 1/3 を使用しています。
- 1:25,000、一次抗体の孵化のバッファー (2% ウシ血清アルブミン (BSA))、430 mM の NaCl、10 mM Tris pH 7.4 では、0.01% の比率で希釈した反ピューロマイシン抗体 (12 D 10) を用いたウェスタンブロッティング ピューロマイシン定款のレベルを決定します。アジ化ナトリウム).
注: 手順 1 で説明した別のセル行の抽出に対応する代表的なイメージは、 図 2 の例として表示されます 。
- 1:25,000、一次抗体の孵化のバッファー (2% ウシ血清アルブミン (BSA))、430 mM の NaCl、10 mM Tris pH 7.4 では、0.01% の比率で希釈した反ピューロマイシン抗体 (12 D 10) を用いたウェスタンブロッティング ピューロマイシン定款のレベルを決定します。アジ化ナトリウム).
2。Cellulo でローカライズ翻訳可視化
注: ここで説明する手法は、接着プロセス 5 中に Sic MRC 5 細胞内のローカライズされた翻訳を評価するために使用されました。手順 2.1 で説明したのと同じ方法で他のセルの行を使用できます MRC 5 細胞はここで使われますが、.
- セル準備。
ハンクの 0.25% トリプシン/2.21 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を使用して
- デタッチ MRC 5 セル ' s バランスの取れた塩ソリューション (HBSS)。15 mL コニカル遠心管中 (200 x g で 5 分) 遠心分離によって細胞をペレットし、ダルベッコのそれらを停止 ' s 修正イーグル培 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) 40,000 セル/ml でカウントを納めたカウント後 。
- 孵化緩やかな回転の懸濁液でそれらを維持するために 20 分間チューブ回転子を使用して下の 37 ° C で浮遊細胞
。 注: この手順は焦点接着複合体の完全な分離を可能にするために重要です 。
- 中断された MRC 5 細胞 (40,000 セル/mL) 2 つの 35 mm ガラス底料理のプレート 2 mL。Puromycilation 試金のための最初の 35 mm ガラス底皿を使用 (手順 2.1.5 参照)、陰性対照として 2 番目を使用 (手順 2.1.6 参照).
- の細胞接着と SIC の形成を許可する 55 分の 37 ° c (5% CO 2) 細胞を維持します 。
- 以前セクション 1 で定義された濃度を使用して 35 mm ガラス底培養皿 (法) におけるメディア追加ピューロマイシン。MRC 5 細胞を治療するために 37 ° C (5% CO 2) で 5 分間 10 μ G/ml ピューロマイシンを使用します 。
- ネガティブ コントロールとしてシクロヘキシミドを 2 番目の 35 mm ガラス底皿 40 分に 50 μ G/ml シクロヘキシミド ( 図 2 b) とそれらを扱う前に細胞を播種後追加。シクロヘキシミド添加後 15 分でピューロマイシンをステップ 2.1.5 (例えば、 使用 10 μ G/ml MRC 5 の 37 ° c (5% CO 2) 5 分後) のように同じ濃度と潜伏期間を使用してメディアに追加します 。
- 洗って冷たい 2 mL 2 回、各プレート 1 X の PBS と 1 ml 室温 (RT) で 15 分の 4% のホルムアルデヒド (1 × PBS で希釈) のセルを修復する
。 注意: パラホルムアルデヒドされる必要があります厳密に化学フード 。
- 染色。
- パラホルムアルデヒドの固定、次 3 回 2 mL の 1x PBS で洗浄し、500 μ L の PBS-TritonX-100 (0.5%) でセルを permeabilize RT で 20 分間インキュベートします 。
- 非特異的な抗体の結合を防ぐためには、500 μ L の PBS でサンプルをブロック – 室温に 20 分間 BSA (1%)
- 2 ml の PBS Tween20 (0.1%) の 3 倍を洗って室温 1 時間 1x PBS で希釈反ピューロマイシン抗体 (12 D 10) 1:12,500 の 300 μ L でインキュベート
- 2 ml の PBS Tween20 (0.1%) の 3 倍を洗浄し、抗マウス IgG、fluorophore に共役の 300 μ L と孵化 (ここ、488 nm) 電子共役系と puromycilated ポリペプチドを視覚化する PBS で希釈別 fluorophore に (ここ、555 nm)F-アクチンを視覚化します。室温 1 時間孵化させなさい
- PBS Tween20 (0.1%) 2 mL で 3 回洗浄し、5 分間インキュベーション RT で 300 μ L の PBS Tween20 (0.1%) の 1 μ g/mL 4 を添加した '、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- は、PBS Tween20 (0.1%) 2 mL で 3 回洗浄し、2 mL の 1x PBS で洗浄します。セルのイメージ取得中に 2 ml の 1x PBS のサンプルを維持することで乾燥を防止します 。
3。蛍光画像の取得
注: 次の方法は、市販の共焦点イメージング システムで使用できます
。 定量化のダイナミック レンジを最大化する各 fluorophore の- を決定する適切な設定します
。 注: 代表的な定量化は、ピクセルの彩度は避け、信号しきい値を正しく調整する場合にだけ取得することができます。これらの設定は、慎重に高電圧 (HV) のレーザー出力を調整することによって達成を得るため、オフセット。- 調整、ズーム ファクター (5 X) とピクセル サイズを最適化する (512 x 512) ピクセル数
。 注: これがナイキスト定理によると、少なくとも 2.3 倍未満の光学解像度をする必要があります 。
- スキャン スピード (12.5 20 μ s/ピクセル) が低下して上記の設定によると信号対雑音比を改善するために (2-3 回) の平均を使用します 。
- 調整、ズーム ファクター (5 X) とピクセル サイズを最適化する (512 x 512) ピクセル数
- 手動で適切なトップを決定し、最適なステップ サイズ (0.4 μ m/スライス) の z 軸に沿って焦点面を下します
。 注: ステップ サイズ面は、ナイキスト定理によると、2.3 で割った値軸の解像度によって決定されます。通常、20-25 層、付着性のセルのセル全体の深さをカバーするために必要な 。
- 、60 X Plan Apo 油浸対物レンズ (1.42 開口) と全体の単一細胞の共焦点画像を取得します 。
4。蛍光画像の定量化
- の濃縮定量。
- ImageJ ソフトウェア (フリーウェア http://fiji.sc で利用可能) を使用して取得したセル データ ファイルから興味を持つ z 平面層に対応するイメージを開きます 。
- は、線の描画ツールを使用して線を描く (ツール バー → ストレート) 定量化が必要なセルの領域を。ダブルクリックすると線幅を変更 " ストレート; " ( 図 3 の 8 で設定) の行の幅を平均照度値がなります
。 注: 薄くラインが異なる構造から信号の重なりを避けるために好ましいです 。
行を正しく設定すると後の - プロファイル決定の軸に沿って信号密度 (メニュー バー → 分析 → プロファイルのプロット).
注: 新しいウィンドウが開きます選択した z 平面断面の線に沿って選択したチャネル (特定 fluorophore) の各ピクセルの輝度に対応するプロファイルを示しています。- 使用蛍光に対応する各チャンネル (488 568、405 の 1 つ 1 つの すなわち、 1 つ数量) の処理を繰り返します
。 注: 信号強度の値は、常に並べ替えられます次の描画の線の向き.
- 使用蛍光に対応する各チャンネル (488 568、405 の 1 つ 1 つの すなわち、 1 つ数量) の処理を繰り返します
- 選択 z 平面レイヤーの数量に対応するプロファイルの各ピクセルの数値のグレースケール値を得るためには、プロファイル データをコピー (イメージ ウィンドウのメニュー バー → コピー) し、表計算ソフトに貼り付けます 。 取得した共焦点画像各 z 平面断面と定量化が必要な各チャネルのための
- 繰り返し手順 4.1.1-4.1.4.
注: 各 z 平面レイヤーの線に沿って各ピクセルの合計値を計算することによって信号の特別な濃縮活動の一般的な評価を取得する別の z 平面レイヤーの定量化をプールできます。描画される線の平均値に含まれる z 平面レイヤーごとに同一である場合、このタイプのプールを達成のみことができます 。
- 、層の大規模な数と異なるチャンネルの全細胞の定量化のための代替方法として StackprofileData に呼び出されるマクロを使用して、(補足ファイル を参照してください).
注: このマクロは https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt で自由にアクセスできる、次のように使用することができます:- のテキスト ファイルにマクロを貼り付け、それを保存
- のすべてのセルの共焦点のレイヤーが含まれているイメージ ファイルを開きます 。
- は、線を描画、4.1.2 の手順に従って、マクロをインポートする新しいウィンドウが開きます (メニュー バー → プラグイン → マクロ → を実行)、StackprofileData マクロに対応する以前に保存したテキスト ファイルを選択し、クリックして、" 開く "
。 注: 次のマクロ輸入新しいウィンドウという " 結果 " が開き、すべて決定の軸に沿って定量化の z 平面レイヤーごとに表示され、チャネルの画像ファイル内に存在します 。
- は、各チャンネルのデータをコピー (メニュー バー → 編集 → コピー) 信号の数量に対応するプロファイルのグラフィカルな表現を取得します。任意の表計算ソフトに貼り付けること。各 z 平面レイヤーの線に沿って各ピクセルの各チャンネルの合計値を計算します。 図 3 のようなグラフィカルな表現を作成するこれらの値を使用します 。
- 指定携帯電話エリアまたはボリュームで信号の定量化。
- ImageJ ソフトウェアで画像ファイルを開きます 。
- は、幾何学的なフォーム機能を使用して関心のある領域を示す領域を描画 (ツール バー → " 四角形、" " オーバル、" または " ポリゴン ").
注: 定量化値がフォームに描画に対応する領域の決定されます 。
- は、任意のバック グラウンド信号を避けるためにしきい値レベルを調整 (メニュー バー → イメージ調整 → のしきい値); ヒストグラム形式でピクセル強度を表す新しいウィンドウが表示されます。スライダーを使用して定量化のピクセルを除外する値を変更します。定量化にピクセルが赤で強調表示されますが表示されます赤いピクセルが細胞外に排除するしきい値を選択します 。
- バック グラウンド信号なしの選択した領域内の画素信号を定量化する測定パラメーターを定義 (メニュー バー → 分析 → 設定測定)、確認してくださいと、" のしきい値の制限 " と " 集積密度" ボックス 。
- は、選択した領域の定量的な値を測定 (メニュー バー → 分析 → メジャー).
注: 信号強度の定量化がの下で新しいウィンドウで表示されます、" IntDen " id は、製品の平均グレー値の選択した領域内のピクセルの数を表します 。
- は、幾何学的なフォームを使用してセル全体を含む領域を描画 (ツール バー → " 四角形、" " オーバル、" または " ポリゴン ")、全信号に対応する値を取得する 4.2.3-4.2.5 を手順に進みます。関心のある領域内の信号の割合を取得する全体の信号の選択した領域内の信号の比を計算します 。
- 繰り返しの手順 4.2.2-4.2.6 各 z 平面の細胞容積の定量化を取得します。必要に応じて、幾何学的形態を適応します 。
- コピー/貼り付けデータから取得、" 結果 " スプレッドシートをグラフィカルに表示、平均値を検索するに z 平面レイヤーごとに windows 。
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Representative Results
ピューロマイシン定款を使用して翻訳イベントを正確に観察するには、それぞれは異なるピューロマイシン定款動態 (図 1)9,11 を示していますので、各セルラインの最適条件を決めることが大事です。 ,12,18。したがって、ピューロマイシン定款を検証するため、ピューロマイシン濃度の増加の標準化されたスペクトルを持つ目的のセルの行を処理すべきだ (1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、および 15.0 μ G/ml) 時間 (5 〜 10 分) 期間が異なる。ローカライズされた翻訳または薬物治療への早期の対応を評価するために短い培養時間が優先 (例えば、 5 分未満)、ことができます特定の治療の直後並進イベントの直接の評価のため。理想的には、ピューロマイシン信号は簡単に検出する必要がありますが、飽和点 (図 2) を避ける必要があります。図 2 (左のパネル) に描かれている、許容ピューロマイシン濃度が許 7 ピューロマイシンの 5.0 7.5 μ G/ml を示唆に対し 7.5 10.0 μ g/mL MRC 5 と hela 細胞です。この方法の目標は完全に開始の瞬間にすべて翻訳伸長を阻害ではなく急性を検出する翻訳中に新しく synthetized ポリペプチド鎖をタグ付けするための実験的パラメーターの最適化が重要です。翻訳のバリエーション。プロトコルのこの最初の段階に、無視されていると過剰なピューロマイシン可用性べきではないと拡張治療時間は主要な望ましくない影響を引き起こします。図 2 (右側のパネル) で観測された高ピューロマイシン濃度と 10 分のため細胞は大抵小さい puromycilated ポリペプチド (例えば許 7、7.5 μ g/mL 以上 10 分間) を生成します。これらの小さいポリペプチドは、内局の的確な把握を阻害する細胞でより急速に拡散します。別の問題はその増加タンパク質が過剰なピューロマイシン治療19時に発生します。この結果は、10 または 15 μ g/mL ピューロマイシンの存在下で減らされた信号強度を示した 10 分 MRC 5 と HeLa 細胞で観察されました。これらの現象の両方が誤解を招く場合ピューロマイシン定款は評価抗体法による拡散化翻訳ローカリゼーションの正確な可視化を防止するためピューロマイシン劣化が減るに対し検出感度。これらの不要な結果は、プロトコルのセクション 1 で説明したように簡単に最適な実験条件を正しく定義することによって回避されます。
ピューロマイシン定款を可視化しながら、適切なコントロールを行うことが重要ですも。図 3 aに示すように、50 μ g/mL シクロヘキシミド、翻訳伸長20そしてこうしてピューロマイシン設立を抑制する知られている化合物の添加によるピューロマイシン定款を効率的にブロックできます。この現象は、図 3 b、シクロヘキシミド処理が効率的に付着性の MRC 5 セルでピューロマイシン定款に対応する信号のほとんどを防止を示すに表示されます。確かに、puromycilated ペプチドは、ピューロマイシンだけ細胞で視覚化すること中も同じ染色条件シクロヘキシミドと扱われた細胞で弱い信号が検出されます。また、別の抗生物質 (アニソミシン) も使えますネガティブ コントロールとしてペプチジル転移酵素活動5をブロックする機能があり、シクロヘキシミド ピューロマイシン設立5 をブロックとして効率に示されているよう ,18
次の蛍光画像取り込み、新しく synthetized 蛋白質 (図 4) に対応する puromycilated ポリペプチドの一般的なローカリゼーションを評価することが可能です。別のセルの面で評価される細胞内コンパートメントに信号強度を許可する付着性の細胞内で異なる深さで画像のレイヤーが選択されます。そのため、(図 4 a)、細胞 (図 4 b) の中間または先頭のセル (図 4) のセルの下部にローカライズされた puromycilation 反応を比較することが可能です。新生と maturating の接着構造上わずかに位置し、Sic は主にセルの途中で観察します。予想通り、Sic、mRNA の翻訳はこれらの細胞内の構造体に分離を示唆で強烈な puromycilation が検出されました。前述のように、必要な軸に沿って信号強度を比較することが可能です。この比較は、撮影画像にグレースケール画像に赤で表示されます飽和ピクセルが含まれていない場合のみ可能 (上から 2 番目のパネル) を用いてオペレーティング ソフトウェア顕微鏡。これらの画像は、指定した軸に沿ってピクセル強度の定量化と解析の ImageJ ソフトウェアにインポートできます。ピクセルの定量化をグラフィカルに表示することができます軸に沿って指定された位置の相対ピクセル強度を示すために (中央のパネル)。ぜひ、パネル上部の挿入 (赤) で SIC アクチン境界とこれらの構造 (下部) の中で濃縮されて非常にアクティブな翻訳のイベントに対応する構造内の緑色の信号を示しています。この数量化はこれらの構造で発生する合計の翻訳の正確な割合を決定するための最良の方法が、それは信号強度の迅速な評価を可能にする、視覚的に有益ではないとの良い近似値である、細胞全体の信号の分布。
セル全体を通して信号の量的分布を得るためには、別の方法を使用してください。図 5に示すように、すべて z 平面のコンフォーカル画像ファイルを作成するを数値化する必要があります興味の領域を示すために重要な手順の 1 つです。この割り当ては、ImageJ で見つかった別の描画ツールを使用して実現できます。このメソッドを使用して、1 つの領域またはことができますし、比較、減算、やもコンパイル、複数の分野を定量化することが可能です。主な問題は、: (i) 最適なイメージングの条件検索を避けるピクセルの彩度とバック グラウンド信号、得られた信号の定量的な値を偽ること、(ii) ImageJ で閾値の最適キャリブレーションを確立可能性があります。仮定すると、両方の条件が最適化されてこの数量化はまだ容易に実行しながら再現性の高いです。撮影前にまた定量化のため選択セルの z 平面の上下限値を慎重に判断することが重要としてます。図4 の場合、下部のセクションは、しばしば汚染エバネッ セント蛍光、SIC/細胞体信号比を減少させることができますが含まれて目的の解像度の制限に対応します。前述したとおり、Sic 接着形成と成熟に関与しています。したがって、SIC の構造接着複合体を一番下のレイヤーからエバネッ セント蛍光を除く新しく形成上わずかに位置しています。したがって、SIC バインド puromycilation 信号は一番下のセクションでかろうじて見える我々 が明らかに obs に対しerve SIC/細胞体の増加率を説明する中央セクションでそれはより低いまたは上部の平面と比較して中間領域で信号します。
図 1。セクション 1 で説明したピューロマイシン治療最適化の実験的表現。
(A)実験 (ステップ 1.1) のシードされている細胞の 24 も表現。(B)の手順 1.4 行 1 および 24 ウェル プレートの 2、シクロヘキシミド (CHX) 50 μ G/ml の最終的な集中の 3 番目の行の各ウェルに添加で中型の変更を示す模式図。2 番目と 3 番目の行 (ステップ 1.6) ピューロマイシンの模式図(C)手順 1.4 後 15 分。最初の行 (ステップ 1.8) ピューロマイシンの模式図(D)ステップ 1.6 後 5 分。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。ピューロマイシン定款の最適条件の決定。
全細胞の西部のしみの分析は(A)MRC-5 から抽出ピューロマイシン濃度の増加と許-7 (B)と(C)の HeLa 細胞培養 (0、2.5、5、7.5、10、および 15 μ g/mL) 5 min (左のパネル)、または (右 10 分の期間のパネル)。Puromycilated ペプチドは、ピューロマイシン抗体を使用して検出されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。シクロヘキシミドを使用して puromycilation の抑制。
(A) 5 分 puromycilation のアッセイのシクロヘキシミドの影響を示す西部のしみ。MRC-5 設立効率許-7 とモック (PBS 1 X) またはシクロヘキシミド処理 HeLa 細胞。(B)共焦点画像ピューロマイシン定款に及ぼすシクロヘキシミドの影響を示します。MRC 5 細胞 PBS (モック) または 15 分間シクロヘキシミド処理, 10 μ G/ml ピューロマイシン + 1 × PBS (左側のパネル) を添加した、またはピューロマイシンの 10 μ g/mL + シクロヘキシミド (右側のパネル) 5 分 Puromycilated 蛋白質のための 50 μ g/mL 検出されました。ピューロマイシン (緑) に対して抗体を使用しています。F-アクチンのファロイジン (赤) を使用してが検出され、核を DAPI (青) で染まっていた。右側の挿入は、白いボックスの 2.5 倍の倍率に対応します。バー = 10 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。付着性の MRC 5 セルで Sic の橋渡し活動の定量化。
(A ~ C)5 分間 10 μ G/ml ピューロマイシンと付着性の MRC 5 セルの代表的な共焦点画像が扱われます。提示画像は、下の(A)、中間(B)、およびセルの上部の(C)部分に対応します。上部のパネルは、ピューロマイシン (緑) に対する抗体を使用して検出された puromycilated タンパク質を表示します。F-アクチンのファロイジン (赤) を使用してが検出され、核を DAPI (青) で染まっていた。右側の挿入は、白いボックスの 2 倍の倍率に対応します。バー = 10 μ m。中央のパネルは、赤で強調されていますが、飽和状態のピクセルの不在を示します。下のパネル puromycilated タンパク質濃縮のグラフィカルな表現に表示付着性の MRC 5 セル ピューロマイシン (緑)、F アクチンの信号の強さを比較することによって (赤)、白い矢印で示されたセル軸に沿って DAPI (ブルー)。(D-F)提示画像に対応、 (A ~ C) で Sic の倍率挿入 x 4.4。定量化が SIC の境界線を示しています (赤いピーク: アクチン)、Sic 内のローカライズされた翻訳だけでなく、(緑のピーク: ピューロマイシン) 最も低いの(D)、 (E)、中間・ セルの上部(F)地域。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。付着性の MRC 5 セルの puromycilated 蛋白質の細胞信号定量化。
(A) z 平面の最下層の付着性の MRC 5 セルのさまざまな領域で信号の決定。(左側のパネル)(I) 地域の選択は、この z 平面レイヤーの全携帯電話の信号に対応する定量的な値を取得するセルの全体をカバーします。(中間パネル)核は細胞質の部分に対応する携帯電話のエリアの選択には、SIC (II) が含まれています。(右側のパネル)セルを全体として得られた値からエリア II から得られた値を減算して Sic (III) を対応する領域の可視化 (領域私)。バー = 10 μ m。各領域の定量的なピクセル値は、Sic。は、信号の割合 (%) を示すグラフが続く (a)、領域の選択を描いた画像の表に記載されて(B) (C)付着性の MRC 5 セルの半ばの z 平面レイヤーのさまざまな領域で信号の決定。(左側のパネル)(I) 地域の選択は、この z 平面レイヤーの全携帯電話の信号に対応する定量的な値を取得するセルの全体をカバーします。(中間パネル)核は細胞質の部分に対応するセル領域の選択には、SIC (II) が含まれています。(右側のパネル)領域 II セル全体として得られた値から得られた値を減算して Sic (III) を対応する領域の可視化 (領域私)。各領域の定量的なピクセル値は、Sic。は、信号の割合 (%) を示すグラフが続く (c) 領域の選択を描いた画像の表に記載されて(D)(E)付着性の MRC 5 セルの上側の z 平面レイヤーのさまざまな領域で信号の決定。(左側のパネル)(I) 地域の選択は、この z 平面レイヤーの [集計] セルの信号に対応する定量的な値を取得するセルの全体をカバーします。(中間パネル) 核は細胞質の部分に対応するセル領域の選択には、Sic (II) が含まれています。(右側のパネル)領域 II セル全体として得られた値から得られた値を減算して Sic (III) を対応する領域の可視化 (領域私)。各領域の定量的なピクセル値は、Sic。は、信号の割合 (%) を示すグラフが続く (e) 領域の選択を描いた画像の表に記載されて(F)(G)上記のセルの z 平面レイヤーのすべての値を定量化、1 つを含む z 平面で提示の計算 (z = 1)、C (z = 9)、e (z = 19)、これはテーブルの上の赤色でハイライトされます。(H)セル全体のボリューム全体 Sic は、信号の比率のグラフィカル表現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
最近の技術の進歩は、並進運動の発現に関与するメカニズムの理解または神経の開発、薬剤応答、転移などの生物学的プロセスの特定の Mrna の抑圧の許可しています。ここで説明したコスト効果の高い方法により、翻訳イベント RNA 結合蛋白質が細胞接着、移行、侵略などの転移プロセスを調節する方法を研究する細胞で可視化することです。
De novoタンパク質翻訳を評価するために多くの方法が開発されているはすべて検出部位が付いた変更されたアミノ酸が伸長のポリペプチドに組み込まれています、同じ戦略を共有しています。これらのメソッドの最初は、 35S, アルギニン混入新たに翻訳されたタンパク質に依存します。特定の条件下で翻訳率を比較するため効率的ですが、標識アミノ酸の使用はほとんどの研究チームに魅力のないメソッドをなります。したがって、小説の開発、夕日などの非放射性ラベルを使用してメソッドをクリックして-それは、またはトリック アプローチ評価し、生体内で翻訳イベントを観察する新たな機会を提供します。とはいえ、独創的なこれらのメソッドのほとんどだけ認めて次の翻訳の評価薬物治療または外因性 cDNA を用いた細胞の特定のイベントを既に特定されたターゲットに実験を制限する特定のターゲットの構築.これは評価外発現 mRNA ターゲットは 1 つの翻訳の制御を可能に、トリックのアプローチ4です。それは内在性 Mrna の翻訳活性化の検証できますが、AHA 体用「をクリックして-それは」メソッド最小限インキュベーション時間は少なくとも 1 h13、最も急性翻訳メカニズムにとって長すぎると見なされますです。
高い汎用性と設定しやすく、重要なプロトコルの最初のフェーズの手順に問題がありますここで説明した方法が必要です。代表の結果に示すように、異なる細胞株は MRC 5 セル5,21のケースのようにようであるので各セルラインの代謝率に起因する可能性がありますだけ異なるピューロマイシン定款動態があります。確かに、未変換の細胞として hela 細胞の増殖には、したがって、タンパク質大量更新がトランス ホーム細胞内よりも堅牢。プロトコルを使用する場合、これはアカウントに取られるべきです。したがって、プロトコルの最初の部分は、メソッドの残りの部分のため重要です。ピューロマイシンの濃度と潜伏の長さを慎重に決定するに実験中に発生した翻訳のより良い評価のためなります。ピューロマイシンの過剰な量で治療小 puromycilated ポリペプチドの比率を増加し、簡単に通常発生する誤解につながることができる、タンパク質分解を刺激するために思える前述のように、直線移動イベント19.親指のルールとしてインキュベーション時間が長くなります以下のピューロマイシンが必要ですが短い培養時間高いピューロマイシン濃度が必要です。濃度/時間は実験の特定の制限に適応することができます。
ここで示される方法は小回り、適用治療や生物学によると簡単に変更することができますプロセスを研究します。ピューロマイシンに組み込むこと、時間の短い期間で翻訳速度の変化の迅速な評価で数量化携帯電話イベントの非常に有益な画像を提供します。強力は、考慮しなければならない制限があるこれらのメソッド。ピューロマイシンは新たに積極的に翻訳すべての Mrna から蛋白質に組み込まれます。このため、ここで説明した puromycilation メソッドは特定のターゲット (すなわち、単一の Mrna) の研究に適しているかもしれないが、単一のセルまたはセルの人口内の並進のアクティビティの概要を取得するが理想的。過剰なピューロマイシンが主な欠点は、前述のように、およびピューロマイシン用量および投与回数は慎重に定義する必要があります、プロトコルで提案。確かに、図 2のように、過剰なピューロマイシン可用性は内局在不正確なデータにつながる、セルでより急速に拡散させるより小さい puromycilated ポリペプチドの形成になります。さらに、過剰なピューロマイシン治療19信号の完全な損失の発生可能性があります効果後に発生する増加タンパク質分解が知られています。
クリック it またはトリックの方法として、固有ではない、ここで提案されたアプローチがしやすい、翻訳速度の一般的な変更を迅速に評価できます。その他のメソッドは、特定のアプリケーションに適しています、たとえピューロマイシン取り込みアッセイは補助コントロールとして実行できます。確かに、実験は特定の mRNA ターゲットは 1 つだけ特定の条件で影響を受けることを必要とする場合、これが翻訳の一般的な増加によって原因はないことを示すために必要です。など、負ピューロマイシン定款はこの場合のための証拠を提供できます。また、このメソッドは、翻訳料金の一般的な変化を観察することに適しています。したがって、それストレス顆粒形成9の場合のように、翻訳の抑制機構を表示するまたはシクロヘキシミド治療並進複雑な分別の初期段階で使用される効率的にブロックしている場合、検証に使用することができます。伸長22。また、セクション 2.3 と 2.4 で説明する定量化方法は、ピューロマイシン染色に焦点を当てて実験関連が、仕切られた染色 fluorophores の様々 なタイプを使用しての任意の型に適用でしたを言及することが重要です。確かに、これらの数量化分子や蛋白質の細胞分布を定量化に使用できるし、も特定の細胞内コンパートメントにターゲットのローカリゼーションを検証できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
原稿の批判的読解ありがとう博士ラシッド Mazroui (ラヴァル大学、ケベック、カナダ)。その技術支援研究センター細胞イメージング ユニットに感謝いたします。M. é Huot はフォン ・ デ ・ ジュニア 1 研究学者 Recherche du ケベック州健康 (周波数 S)。この作品は、(許可番号機構、M. É とモップ 286437 健康研究のカナダの協会によって支えられました。Huot)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
