Summary
이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.
Abstract
MRNA 번역 조절 메커니즘 여러 질병에서 뿐만 아니라 세균 선 개발, 세포 분화, organogenesis, 등 다양 한 생물학 과정에서 포함 된다. 다 수의 출판물에서는 특정 메커니즘 단단히 mRNA 번역 규제 설득 나타났습니다. 단백질 식의 번역 유도 규칙에 대 한 관심 증가 연구 하 고 de novo 단백질 합성에서 cellulo에따라 새로운 방법의 개발을 주도하 고 있다. 그러나, 이러한 방법의 대부분은 복잡 한, 그들이 비용이 많이 드는 고 공부 될 수 있다 mRNA 대상의 수를 제한 하는 자주. 이 원고만 기본적인 시 약 및 측정 하 고 다양 한 조건에서 어떤 셀 라인에서 발생 하는 mRNA 번역에 변화를 시각화 confocal 형광 이미징 시스템을 필요로 하는 방법을 제안 합니다. 이 메서드는 최근 시간, 따라서 생물 다양 한 동안 짧은 기간에 대 한 드 노 보 번역 시각화의 가능성을 제공 하는 짧은 기간 동안 부착 셀의 subcellular 구조에서 지역화 된 번역을 표시 하는 데 사용 됩니다. 프로세스 또는 특정 자극에 응답에서 변환 활동에 변화를 확인.
Introduction
다른 세포질 기능에 의해 번역의 규칙 새로운 도구와 mRNA 번역 및 규제 단백질 합성1,2 의 subcellular 지 방화를 결정 하는 방법을 개발 하기 위해 많은 연구 팀을 묻는 메시지가 있다 ,34. 이러한 최근의 기술 진보에 대 한 번역 upregulation 또는 신경 개발, 약물 반응 및 전이5 같은 생물 학적 과정 동안 특정 mRNAs의 억압 메커니즘의 향상 된 이해 허용 ,6,,78. 그러나, 이러한 방법의 대부분 비싼 또는 유해 시 약 및 특정 장비를 대부분 실험실을 사용할 수 없는 필요 합니다. 따라서, 번역 이벤트의 급속 한 평가 대 한 허용 하는 비용 효율적인 방법은 구체적으로 이러한 잠재적인 문제를 회피 하 개발 되었다. 이 방법은 특정 세포 프로세스 동안 발생 하는 급성 변환 변조 감지 및 또한 번역 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 지역화에 대 한.
여기에 설명 된 방법은 확산 개시 센터 (SIC)5라는 subcellular 구획 내에서 지역화 된 번역을 모니터링 하는 데 사용 되었다. SICs 과도 구조 초기 접착 단지 위에 지역화 된 시드 셀에 있습니다. SICs 및 접착 단지 가지는, 비록 그들의 운명은 밀접 하 게 연결 됩니다. 실제로, SICs 접착의 초기 단계 동안 접착 사이트에 초점 접착 복잡 한 성숙에 점차적으로 사라질 알려져 있습니다. 우리는 발견 특히 mRNA 번역 (예를 들어, Sam68, FMRP, 및 G3BP1)을 제어 하려면 알려진 RNA 의무적인 단백질 및 RNAs 이러한 내에서 농축 된 polyadenylated 구조5. 여기 설명 된 방법을 사용 하 여, 우리는 SIC 관련 mRNA 번역 검사점 수 역할의 규칙 세포 세포 접착을 통합 시드 보였다. Puromycin 설립에 따라이 메서드는 적응된 버전의 번역 분석 결과 (일몰) 표면 감지의 간주 될 수 있습니다. 원래는 비 방사성 레이블이 아미노산을 사용 하 여 글로벌 단백질 합성 속도 측정을 개발, 단백질 puromycilation de novo 단백질 합성9를 시각화 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 방법은 puromycin, 번역 리보솜10조 체인 종료를 차단 하는 항생제의 고유 동작에 의존 합니다. 실제로, puromycin tyrosyl-tRNA, 펩 티 드 사슬 펩 티 드 결합의 형성을 통해 elongating으로 수 있는 구조적으로 유사한 이다. 그러나, 성장 펩 티 드 사슬에 puromycin 바인딩 puromycin tRNAs에서 발견 hydrolysable 에스테 르 결합 대신 비 hydrolysable 아 미드 유대를가지고 있기 때문에 다음 aminoacyl-tRNA와 함께 형성 되 고에서 새로운 펩 티 드 결합을 방지 합니다. 따라서, polypeptides를 elongating에 puromycin의 설립 적극적으로 번역 mRNA9,11,12에 해당 하는 수많은 잘린된 puromycilated polypeptides의 조기 출시에 결과 .
짧은 시간과 부 내에서 활성 번역 평가 가능 했다이 메서드를 사용 하 여 (예를 들어, 5 분) 동안 puromycin 항생제 5 분 동안 보충 된 셀에 대 한 지시는 특정 항 체를 사용 하 여 세포 접착 세포 접착 하는 동안 다른 시간 지점에서5를 처리 합니다. 이 분석 결과의 정밀도 높은 특정 항 체에 대하여 puromycilated moiety 지시에 의존 합니다. Puromycilated polypeptide의 immunofluorescent 감지 또한 confocal 이미징 시스템을 사용 하 여 좋은 정확성과 계량 수 새로 번역 된 mRNA의 일반적인 subcellular 재분할을 제공 합니다.
이 방법은 신경 알갱이 만듦6,,1314, 등의 프로세스에 관련 된 변환 규제 메커니즘을 공부 하는 실험실의 많은 수에 대 한 관련 옵션을 제공 하는 15, morphogen mRNA 지역화, 그리고 개발16,17동안 번역. 그것은 또한 급속 한 생물 학적 이벤트, 셀 이동, 접착, 또는 침략, 또는 단순히 변환 변경5, 를 일으킬 수 있는 약물 치료를 평가 하기 위해 동안 지역화 된 또는 compartmentalized 번역을 공부 하는 데 적합 7 , 18. 전반적으로,이 메서드를 사용 하면 지역화 된 또는 제어 번역 이벤트의 시각화를 위한, 정확, 신속 하 고 비용 효율적인 방식으로.
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Protocol
1. 결정의 Puromycilation 조건
참고:이 기술은 MRC 5 세포 접착 과정 5 동안 지역화 된 번역을 평가 하는 데 사용 하는 방법에 설명 합니다. Puromycilation 셀에 행 해질 수 있다, 그것은 치료 조건 puromycin 농도 및 원하는 각 셀 라인에 대 한 동일 하지 않기 때문에 사용 될 특정 셀 라인에 대 한 puromycilation 조건을 최적화 하는 것이 중요 보육 시간입니다. 이러한 조건이 정의 되는 방법 표시, 3 예제 셀 라인 (즉, 헬러, MRC-5, 그리고 허-7) 다른 보육 시간 puromycin의 농도 증가 함께 취급 했다 ( 그림 1).
- 성장 동일한 숫자의 적절 한 0.5 mL에 24-잘 접시의 세포의 배양 시험 전에 16 h 완료합니다. 시드 30000 MRC-5 셀, 50000 HeLa 세포, 또는 잘 당 50000 허 7 셀. 60-70% 합류 (그림 1A)를 초과 하지 않도록 하는 것을 확인 하십시오.
- 준비 6 튜브 1.5 mL puromycin (0, 5, 10, 15, 20, 및 30 µ g/mL)의 농도 증가 함께 완전 한 세포 배양 매체의와 함께 합니다. 37 ° c.에 미리 따뜻한
- 는 Puromycin 매체 (1.2에서 준비 단계)의 각 농도에서 0.5 mL 전송 각각 6 새로운 튜브로 튜브 및 모든 6 새로운 튜브를 50 µ g/mL의 최종 농도에 cycloheximide를 추가. 37 ° c.에 미리 따뜻한
- 완전 한 문화 매체 (행 1 및 2)의 0.5 mL와 매체를 변경합니다. 세 번째 행에 대 한 추가 cycloheximide ( 그림 1B)의 50 µ g/mL로 보완 하는 완전 한 문화 매체의 0.5 mL.
참고: Cycloheximide 치료 단백질 puromycilation 번역 신장 차단 하는 기능 때문에 대 한 가장 부정적인 제어로 설립 되었습니다. Cycloheximide 치료 puromycilated 단백질 신호 5 , 18의 손실에 이르게 puromycin 설립 필요 번역 신장, 때문에. - 37 ° C (5% CO 2)에서 15 분 동안 품 어.
- 추가 단계 1.2 두 번째 행에서에서 열 A, B, C, D, E 및 f.에에서 각각 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 및 15 µ g/mL의 최종 농도 얻기 위해 준비 puromycin 매체의 0.5 mL 동시에 세 번째 행 ( 그림 1C) cycloheximide-보충 매체 (1.3 단계)에 puromycin의 0.5 mL을 추가.
- 37 ° C (5% CO 2)에서 5 분 동안 품 어.
- 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 µ g/mL ( 그림 1C)의 최종 농도를 단계 1.2 첫 번째 행에서에서 준비 puromycin 매체의 0.5 mL을 추가.
- 37 ° C (5% CO 2)에서 5 분 동안 품 어.
- 씻어 각 행 1 ~ 3 1 mL와 함께 차가운 1 X의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 분 추가 후의 첫 번째 행 (워시에 두 번)의 우물에 puromycin에서 잘. 1 X Laemmli 버퍼의 75 µ L를 추가 (4% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 4 %2-mercaptoethanol 0.120 M Tris HCl pH 6.8, 0.004 %bromophenol 블루, 그리고 10% 글리세롤)를 각 상태에 대 한 전체-세포 lysates.
- 실행 10% SDS polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) puromycin 법인을 평가 하기 위해 준비 된 샘플의 1/3을 사용 하 여.
- Puromycin 설립 방지 puromycin 항 체 (12 D 10) 1:25,000 1 차적인 항 체 외피 버퍼 (2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4, 및 0.01%의 비율로 희석을 사용 하 여 서쪽 오 점 분석의 수준 결정 나트륨 아 지 드).
참고: 단계 1에서에서 설명한 대로 만든 다른 셀 선 추출 물에 해당 하는 대표적인 이미지는 그림 2에서 예제로 표시 됩니다.
- Puromycin 설립 방지 puromycin 항 체 (12 D 10) 1:25,000 1 차적인 항 체 외피 버퍼 (2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4, 및 0.01%의 비율로 희석을 사용 하 여 서쪽 오 점 분석의 수준 결정 나트륨 아 지 드).
2. Cellulo에서 지역화 된 번역 시각화
참고: 여기에 설명 된 기술은 접착 과정 5 동안 SICs MRC-5 셀에서 내에서 지역화 된 번역을 평가 하기 위해 사용 되었다. MRC 5 셀 여기에서 사용 된다, 비록 다른 셀 라인 단계 2.1에에서 설명 된 동일한 방법론으로 사용할 수 있습니다.
- 준비 셀.
행 크에 0.25 %trypsin / 2.21 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 사용 하 여
- 분리 MRC-5 셀 ' s 균형 소금 솔루션 (HBSS). 원심 분리 (200g x 5 분) 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 의해 셀 펠 렛 및 Dulbecco에서 그들을 중단 ' s 수정이 글 매체 (DMEM) 세 챔버와 계산 후 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 40, 000 셀/mL에서 보충.
- 품 어에 그들을 유지 하기 위해 20 분에 대 한 튜브 회전자를 사용 하 여 부드러운 회전에서 37 ° C에서 일시 중단 된 셀.
참고:이 단계는 초점 접착 단지의 완전 한 분리에 대 한 있도록 중요. - 정지 MRC-5 셀 (40, 000 셀/mL) 두 35 m m 유리 하단 요리 접시 2 mL. Puromycilation 분석 결과 대 한 첫 번째 35 m m 유리 하단 접시를 사용 하 여 (단계 2.1.5 참조) 부정적인 제어로 두 번째를 사용 하 여 (단계 2.1.6 참조).
- 세포 접착 및 SIC 형성 있도록 55 분 37 ° C (5% CO 2)에서 세포를 유지.
- 이전 제 1 정의 농도 사용 하 여 35 m m 유리 하단 요리 (시험) 매체에 추가 puromycin. MRC 5 셀을 치료 하려면 10 µ g/mL puromycin 37 ° C (5% CO 2)에서 5 분.
- 부정적인 컨트롤 추가 cycloheximide 두 번째 35 m m 유리 하단 접시 40 분 미리 50 µ g/mL cycloheximide ( 그림 2B)와 그들을 치료 하는 세포를 뿌리기 후. 다음, cycloheximide 또한, 후 15 분 추가 단계 2.1.5 (예: 사용 10 µ g/mL puromycin MRC-5 (5% CO 2) 37 ° C에서 5 분)에서 같은 농도 및 부 화 시간을 사용 하 여 매체에 puromycin.
- 씻어 얼음의 2 mL로 두 번 각 플레이트 1 X PBS 및 실 온 (RT)에서 15 분 동안 4% 포름알데히드 (1 X PBS에 희석)의 1 mL와 함께 셀을 수정.
주의: Paraformaldehyde 사용 해야 합니다 엄격 하 게 화학 후드.
- Immunostaining.
- Paraformaldehyde 고정, 1 X PBS의 2 mL로 세 번 세척 하 고 세포를 permeabilize를 RT 20 분에 대 한 PBS-TritonX-100 (0.5%)의 500 µ L에서 품 어.
- 특이 항 체 바인딩 방지 하기 위해, 500 µ L PBS와 샘플을 차단 – 실시간에서 20 분 (1%) BSA
- PBS-Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 세 번 세척 하 고 실시간에 1 시간에 대 한 1 X PBS에 안티 puromycin 항 체 (12 D 10) 희석 1:12,500의 300 µ L로 품 어
- PBS Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 3 번 세척 하 고 반대로 마우스 IgG는 fluorophore를 활용의 300 µ L로 품 어 (여기, 488 nm) 희석 puromycilated polypeptides를 시각화 하는 PBS와 phalloidin 활용 된 다른 fluorophore를 (여기, 555 nm) 에 F-말라 시각화. 실시간에서 1 시간에 대 한 품 어
- PBS Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 세 번 세척 하 고 다음 5 분 동안 RT에서 300 µ L에 PBS Tween20 (0.1%)의 1 µ g/mL 4 보충 품 어 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- 는 PBS Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 세 번 세척 하 고 1 X PBS의 2 mL로 씻어. 이미지 수집 동안 1 X PBS의 2 ml에서 샘플을 유지 하 여 건조에서 세포를 방지.
3. Immunofluorescent 이미지 수집
참고: 다음 방법론 어떤 상용 confocal 이미징 시스템 함께 사용할 수 있습니다.
정량화에 대 한 동적 범위를 극대화 하기 위해 각 fluorophore- 결정 적절 한 설정을.
참고: 대표적인 정량화만 얻을 수 있습니다 픽셀 채도 피할 경우 신호 임계값 제대로 조정 됩니다. 이러한 설정은 수 얻을 레이저 전력, 높은 전압 (HV), 신중 하 게 조정 하 여 달성 그리고 오프셋.- 조정 확대/축소 계수 (X 5) 및 픽셀 (512 x 512) 픽셀 크기를 최적화할 수.
참고:이 이상 2.3 번 보다 작아야 광학 해상도, Nyquist 법칙에 따라. - 스캔 속도 (12.5-20 µs/픽셀)을 감소 하 고 위에서 언급 한 설정 신호 대 잡음 비율 개선 (2-3 시간) 평균 사용.
- 조정 확대/축소 계수 (X 5) 및 픽셀 (512 x 512) 픽셀 크기를 최적화할 수.
- 수동으로 적절 한 정상을 결정 하 고 최적의 스텝 크기 (0.4 µ m/슬라이스)와 z 축 따라 초점 비행기 아래쪽.
참고: 단계 크기 비행기 Nyquist 법칙에 따라 2.3을 나눈 축 해상도 의해 결정 됩니다. 일반적으로 20-25 레이어는 부착 세포의 전체 셀 깊이 커버 하는 데 필요한. - 60 X 계획 Apo 기름 침수 목적 (1.42 숫자 조리개)으로 전체 단일 셀의 공초점 이미지 획득.
4. Immunofluorescent 이미지 정량화
- 농축의 결정.
- 관심의 z-평면 레이어 ImageJ 소프트웨어 (http://fiji.sc에서 사용할 수 있는 프리웨어)을 사용 하 여 인수 셀 데이터 파일에서 해당 이미지를 엽니다.
- 선 그리기 도구를 사용 하 여 선 그리기 (도구 모음 → 직선) 정량화 원하는 셀의 영역을 통해. 두 번 클릭 하 여 선 두께 수정 " 직선; " 강도 값 ( 그림 3에 8에서 설정) 라인의 폭을 통해 평균 됩니다.
참고: 얇은 라인을 다른 구조에서 신호 중복을 피하기 위해 선호 된다. - 라인을 제대로 설정 프로필 결정된 축 따라 신호 밀도 (메뉴 모음 → 분석 → 플롯 프로필).
참고: 새 창이 열립니다 선택한 z-평면 섹션에 대 한 라인을 따라 (특정 fluorophore) 선택 된 채널의 각 픽셀에 대 한 신호 강도에 해당 하는 프로필을 보여줍니다. - 반복 (즉, 488, 568, 및 405에 대 한 하나에 대 한 정량화) 해당 fluorophore 사용 하는 각 채널에 대 한 프로세스
- .
참고: 신호 강도 값은 항상 주문할 수 그린된 라인의 방향을 따라.
- 선택한 z-평면 계층의 quantifications에 해당 프로 파일의 각 픽셀에 대 한 숫자 회색 배율 조정 값을 얻기 위해 프로 파일 데이터를 복사 (이미지 창에서 메뉴 모음 → 복사) 모든 스프레드시트 소프트웨어에 붙여 넣습니다.
- 반복 단계 취득된 공초점 이미지의 각 z-평면 섹션 및 정량화 원하는 각 채널에 대 한 4.1.1-4.1.4.
참고: 다른 z-평면 레이어의 정량화 각 z-평면 계층에 대 한 라인을 따라 각 픽셀의 합계 값을 계산 하 여 신호의 특별 한 우라늄 농축의 일반적인 평가 얻기 위해 풀링된 수 있습니다. 이러한 유형의 풀링 그린 선 평균 값에 포함 된 각 z-평면 계층에 대 한 동일한 경우 달성 될 수 있다만. - 층의 다 수 다른 채널의 전체 셀 정량화에 대 한 대체 방법으로 StackprofileData 라는 매크로 사용 하 여 (추가 파일 참조).
참고:이 매크로 https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt에 자유롭게 액세스할 수 있으며 다음과 같이 사용할 수 있습니다:- 매크로 텍스트 파일에 붙여 및 저장 합니다 .
- 모든 셀의 confocal 레이어가 포함 된 이미지 파일을 엽니다.
- 선 그리기, 단계 4.1.2에에서 설명 된 대로 매크로 가져올 새로운 창을 열고 (메뉴 모음 → 플러그인 → 매크로 → 실행)에 해당 하는 StackprofileData 매크로 이전에 저장 된 텍스트 파일을 선택 하 고 클릭 " 오픈. "
참고: 다음 매크로 수입, 새 창 라는 " 결과 " 열리고 모든 결정된 축 따라 정량화의 각 z-평면 레이어 나열 됩니다 및 이미지 파일에 채널. - 각 채널에 대 한 데이터를 복사 (메뉴 모음 → 편집 → 복사) 그래픽 프로 파일 표현에 해당 하는 신호 quantifications를. 스프레드시트 소프트웨어에 그것을 붙여 넣습니다. 각 z-평면 계층에 대 한 라인을 따라 각 픽셀에 대 한 각 채널의 합계 값을 계산 합니다. 이러한 값을 사용 하 여 그림 3에 제시 하는 것과 유사한 그래픽 표현을 만들.
- ImageJ 소프트웨어 이미지 파일을 엽니다.
- 기하학적 양식 기능을 사용 하 여 관심 영역을 표시 하는 영역 그리기 (도구 모음 → " 사각형, " " 타원형, " 또는 " 다각형 ").
참고: 정량화 값 그려진된 형태에 해당 하는 영역에 대 한 결정 됩니다. - 조정 임계값을 피하기 위해 어떤 배경 신호 (메뉴 모음 → 이미지 조정 → 임계값); 픽셀 농도 막대 그래프 형태로 표현 하기 위해 새 창이 나타납니다. 슬라이더를 사용 하 여 정량화에 픽셀을 포함 하거나 제외할 값을 변경 합니다. 픽셀을 빨간색으로 강조 표시는 정량화에 포함 될 셀을 밖에 서 빨간색 픽셀을 제거 하는 임계값을 선택.
- 배경 신호 없이 선택 된 영역 내에서 픽셀 신호 척도를 측정 매개 변수 정의 (메뉴 모음 → 분석 → 측정 설정), 확인 하 고 있는지는 " 임계값 제한 "와 " 통합 밀도 " 상자.
- 측정 선택 된 영역에 대 한 정량적 값 (메뉴 모음 → 분석 → 측정).
참고: 새 창 아래에 표시 됩니다 신호 강도 정량화는 " IntDen " 평균 회색 값과 선택된 영역 내의 픽셀 수의 제품을 나타내는 식별. - 기하학적 형태를 사용 하 여 전체 셀을 포함 하는 영역 그리기 (도구 모음 → " 사각형, " " 타원형, " 또는 " 다각형 ") 총 신호에 해당 값을 가져오는 단계 4.2.3-4.2.5와 함께 진행. 관심의 영역 내에서 신호 비율을 얻기 위해 전체 신호 선택 된 영역 내에서 신호 비율 계산.
- 각 z-비행기에 대 한 셀 볼륨의 정량화를 반복 단계 4.2.2-4.2.6. 필요에 따라 기하학적 형태를 적응.
- 복사/붙여넣기에서 얻은 데이터는 " 결과 " 그래픽 묘사 및 평균 값을 찾기 위해 스프레드시트에 각 z-평면 계층에 대 한 윈도우.
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Representative Results
관찰 하기 위해 정확 하 게 번역 이벤트 puromycin 관을 사용 하 여, 그것은 각각 다른 puromycin 법인 활동 (그림 1)9,11 보여주기 때문에 각 셀 라인에 대 한 최적의 조건을 결정 하는 중요 한 ,,1218. 따라서, puromycin 설립의 유효성을 검사, 그것은 puromycin의 농도 증가의 표준된 스펙트럼과 원하는 셀 라인을 치료 하는 데 필요한 (1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 및 15.0 µ g/mL) 다른 기간 (5, 10 분)에 대 한. 지역화 된 번역 또는 약물 치료에 대 한 초기 응답 평가, 부 화 시간 단축이 선호 (예를 들어, 보다 작음 5 분), 직접 특정 치료를 다음과 변환 이벤트의 직접 평가 대 한 수 있습니다. 이상적으로, puromycin 신호 쉽게 감지 해야 하지만 또한 포화 지점 (그림 2)을 피해 야 한다. 그림 2 (왼쪽된 패널)에 묘사 된 반면 5.0-7.5 µ g/mL puromycin 허-7에 대 한 제안 허용 puromycin 농도 MRC-5와 헬러, 7.5-10.0 µ g/mL 이다. 이 방법의 목표는 완전히 개시의 순간에 모든 변환 신장 억제 하지만 급성 감지를 번역 하는 동안 synthetized polypeptide 사슬을 새로 태그 때문에 실험적인 매개 변수 최적화는 결정적 이다. 번역에 유사입니다. 프로토콜에이 초기 단계는 무시,으로 과도 한 puromycin 가용성 해서는 안 하 고 확장 된 처리 시간 주요 원치 않는 결과 가져올 것입니다. 그림 2 (오른쪽 패널)에서 관찰, 높은 puromycin 농도와 10 분에 대 한 치료는 세포 주로 작은 puromycilated polypeptides (예를 들어, 허-7, 7.5 µ g/mL 이상 10 분)를 생성 합니다. 이러한 작은 polypeptides subcellular 지 방화를 정확 하 게 평가 방해할 수도 셀에 더 빠르게 확산 것입니다 한다. 또 다른 문제는 그 증가 베이스 과도 한 puromycin 치료19때 발생 합니다. 이 결과 10 또는 15 µ g/mL puromycin의 면 전에 서 감소 신호 강도 보여 10 분에 대 한 치료 MRC-5와 HeLa 세포에서 관찰 되었다. 이러한 현상은 모두 오해 만약 puromycin 합동은 평가 면역 형광에 의해 증가 확산 방지의 번역 지역화, 정확한 시각화 때문에 puromycin 유발 저하는 크게 감소 하는 반면 검출 감도입니다. 이 원치 않는 결과 제대로 정의 하는 최적의 실험 조건에 의해 쉽게 피할 프로토콜의 섹션 1에서에서 설명한 대로.
Puromycin 설립을 시각화 하는 동안 그것은 또한 적절 한 컨트롤을 수행 하는 것이 중요입니다. 그림 3A같이 puromycin 설립 50 µ g/mL cycloheximide, 번역 신장20 및 따라서 puromycin 설립을 억제 하기 위해 알려진 화합물의 추가 의해 효율적으로 차단할 수 있습니다. 이 동작은 그림 3B, cycloheximide 처리 효율적으로 대부분의 부착 MRC-5 셀에 puromycin 법인에 해당 하는 신호 방해를 보여주는 표시 됩니다. 실제로, puromycilated 펩 티 드 셀 puromycin만 치료에 구상 될 수 있다, 그러나 또한 동일한 착 색 조건 하에서 cycloheximide로 치료 했다 셀에 약한 신호 감지 됩니다. 또는, 다른 항생제 (anisomycin)도 사용할 수 있습니다 부정적인 컨트롤로 peptidyl 전이 효소 활동5 를 차단할 수 있으며 차단 puromycin 법인5에서 cycloheximide로 효율적으로 표시 되었습니다. ,18
Immunofluorescent 이미지 수집, 다음 새로 synthetized 단백질 (그림 4)에 해당 하는 puromycilated polypeptides의 일반적인 지역화를 평가할 수 있다. 이미지 레이어는 다른 셀 비행기에 평가 될 subcellular 구획의 신호 강도 수 있도록 부착 세포 내에서 다른 깊이에 선택 됩니다. 따라서, 셀 (그림 4A), 셀 (그림 4B)의 중간 또는 셀 (그림 4C) 위쪽의 하단에서 지역화 된 puromycilation 반응 비교 가능 하다. 위치 하 고 있으며 약간 초기 및 maturating 접착 구조, SICs 셀 중간에 주로 관찰 된다. 예상 했던 대로, 강렬한 puromycilation SICs, mRNA 번역은 이러한 subcellular 구조 분리 제안에서 감지 됩니다. 앞에서 설명 했 듯이, 그것은 원하는 축 따라 신호 강도 비교할 수입니다. 이 비교는 가능 이미지 획득 포화 픽셀, 회색 음영 이미지에 빨간색 표시 되는 포함 되지 않은 경우 (위에서 두 번째 패널) 소프트웨어를 운영 하는 현미경을 사용 하 여 얻은. ImageJ 소프트웨어 정량화 및 지정 된 축 따라 픽셀 강도의 분석으로 이러한 이미지를 가져올 수 있습니다. 픽셀 정량화는 그래픽으로 나타낼 수 있습니다 (중간 패널) 축 따라 지정 된 위치에 상대적인 픽셀 강도 설명 하기 위해. 면밀 한 상위 패널에 삽입 (빨간색)으로 SIC 말라 경계와 이러한 구조 (하단 부분) 내에서 농축 매우 활성 번역 이벤트에 해당 하는 구조 내에서 녹색 신호를 보여줍니다. 이 정량화 방법은 이러한 구조에서 발생 하는 총 번역의 정확한 비율을 결정 하는 가장 좋은 방법은 아니지만, 그것은 시각적으로 유익 신호 강렬의 급속 한 평가 함으로써 하 고의 좋은 근사 이다는 셀에 걸쳐 분배 신호.
전체 셀에 걸쳐 신호의 양적 분포를 얻기 위해 다른 방법을 사용 해야 합니다. 그림 5에서 보듯이 주요 단계 중 하나 모든 z-비행기 confocal 이미지 파일 작성에 대 한 계량 하는 관심의 영역을 나타내는 것입니다. ImageJ에서 발견 다른 그리기 도구를 사용 하 여이 구현할 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 단일 영역 또는 여러 영역을 수 있습니다 다음 비교, 공제, 또는 심지어 컴파일 계량 가능 하다. 주요 문제는: (i) 찾아 최적의 이미징 조건 방지 픽셀 채도 배경 신호를 얻은 신호의 정량적 값을 잘못 설명 하 고 (ii) ImageJ에 임계값의 최적의 보정 설정 수 있습니다. 가정 하는 두이 조건이 최적,이 정량화 방법은 높은 재현 하면서 아직 실행 하기 쉬운입니다. 이미지 수집, 이전 그것은 또한 신중 하 게 정량화에 대 한 선택 하는 셀의 z 비행기의 하위 및 상위 한계를 결정 하는 것이 중요. 그림 4에 제시 하는 경우, 아래 섹션 종종 SIC/셀 몸 신호 비율을 줄일 수 있습니다 사라져 형광 오염 포함 하는 목표의 해상도 제한에 해당 합니다. 앞서 언급 했 듯이, SICs 접착 사이트 형성과 성숙;에 관여 따라서, SIC 구조 약간 위에 새로 접착 단지 형성 맨 층에서 사라져 형광을 제외 하 고 있습니다. 따라서, SIC 바인딩된 puromycilation 신호는 하단 섹션에 겨우 보이는 obs 명확 하 게 할 수 있는 반면erve SIC/세포 체의 증가 비율을 설명 하는 중간 부분에 그것은 낮은 또는 위 비행기에 비해 중간 지역에 신호.
그림 1입니다. 섹션 1에서에서 설명한 puromycin 치료 최적화의 실험적인 표현입니다.
(A) (단계 1.1) 실험에 대 한 시드 되 고 셀의 24-잘 표현. (B) 단계 행 1 및 2 24-잘 접시의 50 µ g/mL의 최종 농도 대 한 세 번째 행의 각 음에 cycloheximide (CHX)의 추가에 중간 변화를 보여주는 1.4의 도식 적인 표현입니다. (C) 두 번째 및 세 번째 행 (1.6 단계)에 puromycin 치료의 도식 표현 단계 1.4 후 15 분. (D) 의 첫 번째 행 (단계 1.8) puromycin 치료 도식 표현 단계 1.6 후 5 분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. Puromycin 설립에 대 한 최적의 조건의 결정입니다.
전체 셀의 서쪽 오 점 분석 (A)MRC-5에서 추출 (B) 허-7, 그리고 (C) 헬러 세포 incubated puromycin의 농도 증가 함께 (0, 2.5, 5, 7.5, 10, 및 15 µ g/mL) 10 분 (오른쪽 또는 5 분 (왼쪽된 패널)의 기간에 대 한 패널)입니다. Puromycilated 펩 티 드 puromycin에 대 한 항 체를 사용 하 여 발견 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. Puromycilation cycloheximide를 사용 하 여 억제
(A) 서쪽 오 점 분석 결과 5 분 puromycilation에 cycloheximide의 영향을 보여주는. MRC-5, 법인 효율성 허-7, 그리고 HeLa 세포 다음 모의 (PBS 1 X) 또는 cycloheximide 치료. (B) 공초점 이미지 puromycin 설립에 cycloheximide의 영향을 보여주는. MRC 5 셀 했다 PBS (모의) 또는 15 분 cycloheximide로 미리 치료 후 10 µ g/mL puromycin + PBS 1 X (왼쪽된 패널) 보충 또는 puromycin의 10 µ g/mL + 50 µ g/mL 5 분 Puromycilated 단백질에 대 한 cycloheximide (오른쪽 패널)의 검색 된 puromycin (녹색)에 대 한 항 체를 사용 하 여. F 걸 phalloidin (레드)를 사용 하 여 검색 하 고 핵 DAPI (파란색)으로 물 했다. 오른쪽에 삽입 흰색 상자의 2.5 배 확대에 해당합니다. 바 = 10 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 부착 MRC-5 셀에 SICs에서 변환 활동 부 량이 고
(A-C) 5 분 동안 10 µ g/mL puromycin 부착 MRC-5 셀의 대표 confocal 이미지 처리. 제시 하는 이미지는 아래 (A), 중간 (B), 그리고 셀의 위쪽 (C) 부분에 해당 합니다. 상위 패널 puromycin (녹색)에 대 한 항 체를 사용 하 여 검색 하는 puromycilated 단백질을 보여줍니다. F 걸 phalloidin (레드)를 사용 하 여 검색 하 고 핵 DAPI (파란색)으로 물 했다. 오른쪽에 삽입의 흰 상자 2 배 확대에 해당합니다. 바 = 10 μ m. 중간 패널 표시 빨간색으로 강조 되었다 포화 픽셀의 부재. 낮은 패널 puromycilated 단백질 농축의 그래픽 표현에에서 표시 부착 MRC-5 셀 puromycin (녹색), F 걸 대 한 신호 강도 비교 하 여 (빨간색), 그리고 셀 축 (파란색) DAPI 흰색 화살표로 표시. (D-F) 제시 하는 이미지에 해당 하는 (A-c) 제시 SICs의 확대 삽입 x 4.4. 정량화 SIC 테두리 표시 (빨간 봉우리: 말라)는 SICs 내에서 지역화 된 번역 뿐만 아니라 (녹색 봉우리: puromycin) 최저 (D), (E), 중간에에서 와 셀의 위쪽 (F) 지역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 전체 셀 신호 부착 MRC-5 셀에 puromycilated 단백질의 정량화.
(A) 부착 MRC-5 셀의 아래쪽 z-평면 층의 서로 다른 영역 내에서 신호의 결정. (왼쪽된 패널) 양적 값이 z-평면 계층에 대 한 총 세포질 신호에 해당 셀의 취재 영역 (I)의 선택. (중간 패널) 핵 및 세포질 부분을 원문 (II)를 포함 하지 않는 해당 하 세포질 영역의 선택. (오른쪽 패널) 모든 셀에 대 한 얻은 값에서 지역 II에서에서 가져온 값을 빼서 SICs (III)에 해당 하는 영역의 시각화 (영역 I). 바 = 10 μ m. (B) 각 영역에 대 한 양적 픽셀 값 신호 SICs. 발견의 비율 (%)를 보여주는 그래프 다음 (a) 영역 선택을 묘사 하는 이미지에 대 한 테이블에 나열 된 (C) 의 부착 MRC-5 셀 중반 z-평면 층의 서로 다른 영역 내에서 신호의 결정. (왼쪽된 패널) 양적 값이 z-평면 계층에 대 한 총 세포질 신호에 해당 셀의 취재 영역 (I)의 선택. (중간 패널) 핵 및 세포질 부분을 원문 (II)를 포함 하지 않는 해당 하는 셀 영역을 선택 합니다. (오른쪽 패널) 시각화 영역 II 전체 셀에 대 한 얻은 값에서 얻은 값을 빼서 SICs (III)에 해당 하는 영역 (영역 I). (D) 각 영역에 대 한 양적 픽셀 값 신호 SICs. 발견의 비율 (%)를 보여주는 그래프 뒤 지역 선택 (c)를 묘사 하는 이미지에 대 한 표에 나열 된 (E) 의 부착 MRC-5 셀 상단 z-평면 층의 서로 다른 영역 내에서 신호의 결정. (왼쪽된 패널) 양적 값이 z-평면 계층에 대 한 총 세포 신호에 해당 셀의 취재 영역 (I)의 선택. (중간 패널) SICs (II)를 포함 하는 셀 영역에 해당 하는 핵과 세포질 부분을 하지 않는의 선택. (오른쪽 패널) 시각화 영역 II 전체 셀에 대 한 얻은 값에서 얻은 값을 빼서 SICs (III)에 해당 하는 영역 (영역 I). (F) 각 영역에 대 한 양적 픽셀 값 신호 SICs. 발견의 비율 (%)를 보여주는 그래프 다음 지역 선택 (E)에 묘사 하는 이미지에 대 한 테이블에 나열 된 (G) z-평면 레이어 위의 셀에서의 모든 부 량 값, z-비행기 A에 대 한 계산 포함 (z = 1), C (z = 9), e (z = 19)는 테이블에 빨간색으로 강조 표시 됩니다. (H) 신호 SICs 전체 셀 볼륨에 걸쳐 있는 백분율의 그래픽 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
최근의 기술 진보는 변환 upregulation에 관련 된 메커니즘의 이해 또는 신경 개발, 약물 반응 및 전이 등의 생물학적 프로세스에서 특정 한 mRNAs의 억압에 대 한 수 있다. 여기에 설명 된 비용 효율적인 방법론 번역 이벤트를 RNA 의무적인 단백질 세포 접착, 마이그레이션, 및 침략 등의 전이성 프로세스를 규제 하는 방법을 공부 하는 셀에 구상 될 수 있습니다.
수많은 방법은 de novo 단백질 번역을 평가 하기 위해 개발 되었습니다, 하지만 그들은 모두 같은 전략, 늘이는 polypeptide 감지 moiety 태그로 수정 된 아미노산을 통합 공유. 이 메서드의 첫 번째 35S 방사선 아르기닌 법인 새로 번역 된 단백질에 의존합니다. 비록 그것은 특정 조건 하에서 번역의 일반적인 속도 비교 하기 위한 효율적인, 방사선된 아미노산의 사용 게이 방법을 대부분 연구 팀 거죠. 따라서, 소설의 개발 방법, 석양 등 비 방사성 레이블을 사용 하 여 클릭-그것은, 또는 트릭 접근 제공 새로운 기회를 평가 하 고 번역 이벤트 vivo에서 관찰. 독창적인, 비록 이러한 메서드의 대부분 허용 번역 이벤트 다음의 평가 대 한 약물 치료 또는 특정 exogenous cDNA를 사용 하 여 특정 세포 이벤트 이미 식별 된 대상에 실험을 제한 하는 구체적인 목표의 구성 . 이 대 한 트릭 접근4, 하나의 것 표현된 mRNA 대상의 변환 규칙에 대 한 평가 될 수 있는 사실이. 생 mRNAs의 변환 활성화의 유효성 검사에 대 한 수 있습니다, 비록 AHA 법인의 "클릭-그것은" 방법 최소한의 부 화 시간은 1 h13, 가장 심각한 번역 메커니즘에 대 한 너무 오래 간주 됩니다입니다.
매우 다양 하 고 쉽게 설정, 여기 설명 하는 방법을 중요 한 단계는 프로토콜의 초기 단계에 따라야 합니다. 대표 결과 같이 다른 셀 라인 각 셀 라인, MRC-5 셀5,21의 경우 것으로 보인다의 신진 대사 속도 때문일 단순히 다른 puromycin 법인 활동을 해야한다. 실제로, 비 변형 세포는 헬러,으로 증식 되며 따라서, 단백질 대량 갱신 보다 덜 강력한 변환 된 셀에 있습니다. 프로토콜을 사용 하 여 때이 계정으로 촬영 한다. 따라서, 프로토콜의 첫 번째 부분이 방법의 나머지 부분에 대 한 중요 합니다. 신중 하 게 결정 puromycin의 농도 및 외피의 길이 실험 중에 발생 하는 번역의 더 나은 평가 대 한 허용할 것 이다. 위에서 설명 했 듯이, 치료 과도 한 양의 puromycin 작은 puromycilated polypeptides의 비율을 증가 하 고 자극 베이스, 일반적으로 발생의 오 역으로 쉽게 이어질 수 있는 것 변환 이벤트19 . 엄지손가락의 규칙으로 서 더 이상 보육 시간, 적은 puromycin 필요, 하지만 짧은 부 화 시간 더 높은 puromycin 집중 해야 합니다. 농도/시간 특정 실험적인 제한을 적용할 수 있습니다.
여기에 제시 된 방법을 매우 적응할 수 있다 하 고 적용 하는 치료 또는 생물학에 따라 쉽게 수정할 수 있습니다 공부 하는 과정. Puromycin 법인 정량화 방법 제공 하는 셀룰러 이벤트의 매우 유익한 이미지 동안 짧은 기간 동안 번역 활동에 있는 변화의 급속 한 평가 대 한 수 있습니다. 강력한, 하지만 이러한 방법은 제한이 고려해 야 합니다. Puromycin 번역 적극적으로 모든 mRNAs에서 새로 합성 하는 단백질에 포함 될 것입니다. 이러한 이유로, 여기 설명 하는 puromycilation 방법을 구체적인 목표 (즉, 단일 mRNAs), 연구에 적합 하지 않을 수 있습니다 하지만 그것은 이상적인 단일 셀 또는 셀 인구 내에서 변환 활동의 일반적인 개요를 얻을. 위에서 설명 했 듯이, 과도 한 puromycin 단점이 주요, 그리고 puromycin 투약 및 치료 시간 신중 하 게 정의 되어야 합니다, 프로토콜에서 제안. 실제로, 그림 2에서처럼 과도 한 puromycin 가용성 부정확 한 subcellular 현지화 데이터를 선도 하는 셀을 더 급속 하 게 확산 작은 puromycilated polypeptides의 형성 발생 합니다. 또한, 증가 베이스 과도 한 puromycin 치료19, 효과 신호의 완전 한 손실 될 수 있습니다 후 발생 알려져 있다.
클릭 it 또는 트릭 방법으로 특정 하지 비록 여기 제안 하는 접근 방식을 매우 액세스할 수 이며 번역 활동에 일반적인 변화의 급속 한 평가 대 한 수 있습니다. 경우에 다른 방법 더 나은 특정 응용 프로그램에 대 한 적응, puromycin 합동 분석 실험 보조 컨트롤로 수행할 수 있습니다. 사실, 실험 특정 mRNA 목표는 유일 하 게 특정 상태에 영향을 하는 경우, 그것은이 번역에 있는 일반적인 증가 의해 발생 하지 않습니다 표시 하는 데 필요한. 따라서, 부정적인 puromycin 설립이이 사건에 대 한 증거를 제공할 수 있습니다. 또한,이 방식은 번역 비율에 있는 일반적인 변화를 관찰 하는 데 적합 합니다. 따라서, 그것은 스트레스과 립 형성9의 경우 번역 억압 메커니즘을 표시 하거나 변환 복잡 한 분류의 초기 단계에서 사용 하는 cycloheximide 치료를 효율적으로 차단 하는 경우 유효성 검사 사용할 수 있습니다. 신장22. 그것은 또한, 2.3 및 2.4 섹션에 설명 된 정량화 방법 관련 실험 puromycin 얼룩에 초점을 맞추고, 하지만 그들은 수에 적용할 compartmentalized fluorophores의 다양 한 종류를 사용 하 여 얼룩의 모든 종류를 언급 하는 것이 중요. 사실, 이러한 정량화 방법 분자 또는 단백질의 세포 분포를 정량화 하는 데 사용할 수 고 특정 subcellular 격실에 대상의 지역화에도 유효성을 검사할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
원고의 중요 한 읽기에 감사 박사 Rachid Mazroui (라 발 대학교, 퀘벡, 캐나다) 하 고. 우리는 그들의 기술 지원에 대 한 연구 센터의 세포 이미징 단위 감사. M. É. Huot는 Fonds 드의 주니어 1 연구 학자 검색 뒤 퀘벡-건강 (FRQ-S). 이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회 (번호 CIHR, 걸 레-286437 M. É를 부여에 의해 지원 되었다 합니다. Huot)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
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