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Medicine

जांच वॉन Willebrand फैक्टर वॉन Willebrand फैक्टर-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन के एक प्रवाह चैंबर मॉडल का उपयोग Pathophysiology

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/55917
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Department of Medicine, Queen's University

Summary

इस पत्र में, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए endothelial वॉन Willebrand फैक्टर जारी है और बाद में एक इन विट्रो फ्लो चैंबर प्रणाली का उपयोग भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में द्रव कतरनी तनाव के तहत प्लेटलेट पर कब्जा के आकलन के लिए ।

Abstract

वॉन Willebrand फैक्टर (VWF) एक multimeric ग्लाइकोप्रोटीन जमावट कारक है कि endothelial नुकसान की साइटों पर प्लेटलेट आसंजन और एकत्रीकरण मध्यस्थता और है कि संचलन में कारक अष्टम किया जाता है । VWF endothelial कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित है और या तो प्लाज्मा में constitutively जारी है या विशेष organelles में संग्रहित है, Weibel-Palade शव (WPBs) कहा जाता है, पर मांग के लिए hemostatic चुनौती के जवाब में रिलीज । Procoagulant और भड़काऊ उत्तेजनाओं तेजी से WPB exocytosis और VWF जारी प्रेरित कर सकते हैं । endothelial कोशिकाओं द्वारा जारी VWF के बहुमत प्लाज्मा में परिचालित; हालांकि, VWF के अनुपात endothelial सेल सतह के लिए लंगर डाला है । शारीरिक कतरनी की शर्तों के तहत, endothelial-लंगर VWF प्लेटलेट्स को बाइंड कर सकते हैं, एक VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग बनाने कि थक्का गठन के nidus का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । एक प्रवाह चैंबर प्रणाली नेत्रहीन endothelial कोशिकाओं और बाद में प्लेटलेट पर कब्जा से VWF की रिहाई का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रतिलिपि और VWF-मध्यस्थता थक्का गठन के pathophysiology के लिए प्रासंगिक है । इस पद्धति का प्रयोग, endothelial कोशिकाओं को एक प्रवाह कक्ष में संस्कृति और बाद में secretagogues के साथ उत्तेजित कर रहे है WPB exocytosis प्रेरित कर रहे हैं । धोकर प्लेटलेट्स फिर सक्रिय endothelium पर perfused हैं । प्लेटलेट्स सक्रिय हो जाते हैं और बाद में द्रव प्रवाह की दिशा में लम्बी VWF स्ट्रिंग्स को बाँध देते हैं. एक procoagulant और भड़काऊ उत्तेजना के रूप में extracellular histones का उपयोग करना, हम अनुपचारित citrullinated कोशिकाओं की तुलना में endothelial-इलाज endothelial कोशिकाओं पर VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन में वृद्धि मनाया । इस प्रोटोकॉल घनास्त्रता और रक्तस्तम्भन के मॉडलों में VWF-प्लेटलेट बातचीत के सक्रियकरण के एक मात्रात्मक, दृश्य, और वास्तविक समय मूल्यांकन का वर्णन करता है ।

Introduction

घनास्त्रता दुनिया भर में मृत्यु का एक प्रमुख कारण है1 और दोनों veinsand धमनियों में प्लेटलेट सक्रियण और thrombin उत्पादन में प्रतिक्रिया todysregulated विकसित कर सकते हैं । VWF के प्लाज्मा स्तर रक्त जमावट के एक प्रमुख नियामक हैं, जिससे निम्न स्तर (< 50%) वॉन Willebrand रोग (VWD) के रूप में जाना जाता है खून बह रहा विकार में परिणाम2 और उच्च स्तर (> 150%) शिरापरक3 का एक बढ़ा जोखिम के साथ जुड़े रहे हैं और धमनी४ घनास्त्रता.

VWF एक multimeric ग्लाइकोप्रोटीन megakaryocytes और endothelial कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित और प्लेटलेट α-granules और WPBs, क्रमशः में संग्रहित है । hemostatic चैलेंज पर, VWF endothelial WPBs से जारी किया जा सकता है प्लेटलेट्स घूम तार करने के लिए endothelial कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए5 या उजागर कोलेजन पोत दीवार6पर । endothelial कोशिकाओं को VWF के एंकरिंग को पी-selectin7 और integrin αvβ38द्वारा मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है । प्लेटलेट α-granules भंडार के बाद जारी प्लेटलेट प्लग गठन, जमावट झरना और फाइब्रिन के प्रचार प्रसार के लिए आवश्यक पाड़ के लिए और अधिक, प्लेटलेट प्लेटलेट बातचीत को स्थिर करने के लिए स्थानीयकृत VWF सांद्रता में वृद्धि कर सकते है साठा. VWF की प्लेटलेट बाध्यकारी गतिविधि अपने multimeric संरचना द्वारा विनियमित है, उच्च आणविक वजन multimers अधिक hemostatic गतिविधि9,10रखने के साथ । संचलन में, VWF भी जमावट कारक आठवीं के लिए एक वाहक के रूप में कार्य करता है ।

द्रव कतरनी तनाव VWF फिजियोलॉजी का एक आवश्यक नियामक है । कतरनी तनाव के अभाव में, VWF एक गोलाकार रूप में मौजूद है, प्लेटलेट ग्लाइकोप्रोटीन आईबी आसंजन11के लिए बाध्यकारी डोमेन छुपा । जब कतरनी तनाव मौजूद है, एक metalloprotease, एक disintegrin और thrombospondin आकृति (ADAMTS13) के साथ metalloprotease के लिए दरार साइट, उजागर है । ADAMTS13 नग्न और प्लेटलेट से सजाया VWF तार सट multimer आकार को विनियमित करने के लिए, जिससे इसके hemostatic गतिविधि को कम करने12।

VWF एक तीव्र चरण प्रोटीन है, और हाइपोक्सिया13, संक्रमण14, और भड़काऊ साइटोकिंस सहित कई उत्तेजनाओं, endothelial कोशिकाओं से VWF रिहाई मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है । अन्य भड़काऊ एजेंटों के समान, extracellular histones भी चूहों में प्रणालीगत VWF रिलीज के लिए प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है15,16 और इन विट्रो17,18 मेंप्लेटलेट्स की सक्रियण, 19. यह citrullinated उपप्रकार पर निर्भर होना दिखाया गया था, lysine और arginine सामग्री में अंतर के रूप में समारोह15प्रभावित हो सकता है । हमारे अध्ययन के लिए एक प्रवाह चैंबर मॉडल की स्थापना के प्रभाव की जांच करने के लिए lysine-अमीर (एच) और arginine अमीर (मानव संसाधन) citrullinated उपप्रकार और secretagogues पर endothelial VWF रिहाई और वास्तविक समय प्लेटलेट पर कब्जा, संभावित प्रारंभिक घटनाओं में सूजन प्रेरित घनास्त्रता ।

इस फ्लो चैंबर पद्धति vivo में subendothelial कोलेजन, endothelial कोशिकाओं, VWF, और प्लेटलेट्स के बीच बातचीत में recapitulates एक इन विट्रो प्रणाली है कि दृश्य है, प्रतिलिपि, और quantifiable. यह WPB स्राव, प्लेटलेट सक्रियण, और VWF प्रोटियोलिसिस सहित VWF-प्लेटलेट बातचीत को नियंत्रित करता है कि मार्ग के सभी पहलुओं का वास्तविक समय मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. नियंत्रित कतरनी तनाव की स्थिति के तहत VWF के अध्ययन के लिए VWD उत्परिवर्तनों कि VWF रिलीज और प्लेटलेट बाध्यकारी समारोह20, WPB फिजियोलॉजी21, और VWF दरार ADAMTS13 द्वारा5का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हम इस पद्धति का उपयोग करने के लिए एक भड़काऊ उत्तेजना का एक परिणाम के रूप में VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन यों तो: extracellular histones ।

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Protocol

इन अध्ययनों को महारानी की यूनिवर्सिटी, कनाडा के रिसर्च एथिक्स बोर्ड ने मंजूरी दी थी ।

1. Endothelial कोशिका उत्तेजना

  1. कोलेजन-कोट एक 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली ।
    1. अग्रिम में 24 एच, कोट एक 6-well टिशू कल्चर प्लेट ३७ ° c पर कोलेजन बफर के 1 मिलीलीटर के साथ (५० µ g/एमएल चूहे पूंछ कोलेजन प्रकार 1 ०.०२ एम हिमनदों एसिटिक एसिड के साथ) ।
    2. इस कुएं को दो बार हांक की 2 मिलीलीटर की संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ धोएं ।
      नोट: प्लेटें टिन पन्नी में लपेटा जा सकता है और 4 ° c पर एक वाटरप्रूफ प्लास्टिक बैग में संग्रहित है ।
  2. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त विकास माध्यम के 2 मिलीलीटर में अच्छी तरह से प्रति 1 x 106 कोशिकाओं के घनत्व पर endothelial कोशिकाओं बीज । ३७ डिग्री सेल्सियस (5% सह2) में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: यहां, रक्त वृद्धि endothelial कोशिकाओं (BOECs) 5 और 15 मार्ग के बीच इस्तेमाल किया गया । BOECs एक wildtype VWF अनुक्रम के साथ स्वस्थ स्वयंसेवकों से अलग किया गया था एक एट अल में संदर्भित विधि का उपयोग कर. 22 एक के समान तरीके से पहले जौव23द्वारा वर्णित एक ।
  3. 24 एच के बाद मध्यम निकालें और HBSS के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  4. सीरम मुक्त मध्यम (FBS बिना ंयूनतम आवश्यक विकास मध्यम) के 1 मिलीलीटर जोड़ें phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा; १०० एनएम), unfractionated citrullinated (उह), और एच या HR (सभी 25 µ जी/एमएल) में ३७ डिग्री सेल्सियस (5% सह2) पर 2 घंटे के लिए कोशिकाओं के लिए ।
    नोट: citrullinated के इस एकाग्रता पिछले पर आधारित था इन विट्रो cytotoxicity रिपोर्ट द्वारा Xu एट अल । 24 और अब्राम एट अल। 25 कि ५० µ g/एमएल का इस्तेमाल किया ।
  5. 2 घंटे के बाद मध्यम इकट्ठा और विश्लेषण जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।

2. VWF ठहराव एंजाइम से जुड़े Immunosorbent परख (एलिसा)

  1. कोट कोटिंग बफर के १०० µ एल के साथ एक microplate (10 मिमी dibasic सोडियम फॉस्फेट और १४५ मिमी सोडियम क्लोराइड, पीएच ७.२) युक्त 10 µ जी/एमएल polyclonal विरोधी VWF एंटीबॉडी 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ।
  2. धो बफर के २५० µ एल के साथ प्लेट तीन बार धो (10 मिमी dibasic सोडियम फॉस्फेट, ५०० mm सोडियम क्लोराइड, और ०.१% के बीच 20, पीएच ७.२) ।
  3. मध्यम नमूनों 1:2 और 1:4 धोने बफर के साथ पतला और एक मानक वक्र के लिए सामान्य संदर्भ प्लाज्मा का उपयोग करें, एक 1:10 कमजोर पड़ने पर शुरुआत.
  4. प्लेट १०० पतला नमूनों और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात मानकों के µ एल ।
  5. धो प्लेट धो बफर के २५० µ एल के साथ तीन बार ।
  6. पतला विरोधी VWF के १०० µ एल जोड़ें, एचआरपी-संयुग्मित डिटेक्शन एंटीबॉडी (१.१ µ जी/µ एल धोने बफर में) प्लेट और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन के लिए ।
  7. प्लेट धो लें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार ओ-Phenylenediamine dihydrochloride (ओपीडी) रिएजेंट के साथ 10 मिनट के लिए मशीन ।
  8. 1 एम एच2के १०० µ एल के साथ प्रतिक्रिया बंद करो तो4 और ४९२ एनएम पर प्लेट पढ़ें ।

3. ठोस चरण citrullinated-VWF बाध्यकारी परख

  1. कोट histones के साथ एक microplate ०.५% सोडियम deoxycholate ५० mM कार्बोनेट बफर (पीएच ९.६) में पतला 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में 10 µ g/
  2. प्लेट धो के २५० µ एल के साथ तीन बार ०.१% के बीच 20 के साथ पूरक, बहाकर के बीच 10 मिनट के लिए मशीन ।
  3. २०० µ एल के साथ थाली ब्लॉक ०.१% के बीच 20 और 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के साथ पूरक (BSA) 1 के लिए कमरे के तापमान पर एच ।
  4. चरण ३.२ दोहराएँ ।
  5. प्रश्नपत्र पतला २०० म्यू/एमएल से 25 म्यू/एमएल के लिए (10 मिमी dibasic सोडियम फॉस्फेट, ५०० mm सोडियम क्लोराइड, और ०.१% के बीच 20, पीएच ७.२) प्लाज्मा व्युत्पंन मानव VWF/ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए थाली के लिए १०० µ एल जोड़ें ।
  6. चरण ३.२ दोहराएँ ।
  7. पंजाबियों से युक्त समाधान के १०० µ l का उपयोग करने वाले मैटीरियल citrullinated को VWF के बंधन का पता लगाना-०.१% के बीच 20 और 1:1000 खरगोश polyclonal विरोधी VWF एंटीबॉडी संयुग्मित को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एचआरपी ।
  8. चरण ३.२ दोहराएँ ।
  9. ओपीडी रिएजेंट के १०० µ एल के साथ 30 मिनट के लिए थाली मशीन और 1 एम एच2तो4के १०० µ एल के साथ प्रतिक्रिया बंद करो । ४९२ एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने ।

4. प्रवाह कक्षों पर Endothelial कोशिकाओं सीडिंग

  1. कोलेजन के ०.५ मिलीलीटर-कोटिंग बफर लोड (२.१ चरण में वर्णित) में एक Luer-ताला 1-एमएल सिरिंज ।
  2. एक फ्लो चैंबर स्लाइड के जलाशय पर सिरिंज के Luer लॉक अंत ट्विस्ट.
  3. प्रेस सवार धीरे जब तक पूरे लेन लेपित है और प्रत्येक जलाशय भरा है । प्रत्येक लेन के लिए दोहराएँ और 24 घंटे के लिए ३७ ° c पर चैंबर मशीन.
  4. महाप्राण एक २०० μL पिपेट के साथ कोलेजन-कोटिंग बफर । 1 मिलीलीटर HBSS और प्रेस के साथ एक और सिरिंज लोड सवार धीरे प्रवाह चैंबर के प्रत्येक लेन धोने के लिए । महाप्राण एक २०० μL पिपेट के साथ धो प्रवाह चैंबर के विरोध अंत में । दोहराएं दो बार ।
  5. पिपेट लगभग १०० µ एल के एक 3 एक्स 106 कोशिकाओं/एमएल endothelial सेल (BOEC) विकास मध्यम में एक प्रवाह चैंबर के लेन में 10% FBS के साथ समाधान ।
    नोट: endothelial कोशिकाओं के बीज का घनत्व चैंबर की क्षमता से अधिक है । यह अधिक से अधिक चैनल कवरेज सुनिश्चित करने के लिए है; क्रमिक वाश चरण में गैर-अनुयाई कक्ष निकाल दिए जाते हैं ।
  6. 24 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर चैंबर मशीन (४.४ चरण में के रूप में) Luer लॉक सीरिंज का उपयोग हर 8-12 एच माध्यम बदलें । सुनिश्चित करें कि गलियों में कोई दिखाई नहीं बुलबुले हैं ।

5. मानव पूरे रक्त से प्लेटलेट्स अलग

  1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एक 30 जी सुई के साथ, जोड़ें ३०० µ एल एसिड-साइट्रेट डेक्सट्रोज बफर (८५ mm trisodium साइट्रेट, १११ mm D-ग्लूकोज, और ७१ mm साइट्रिक एसिड, पीएच ४.५) एक additive के लिए नि: शुल्क 3 मिलीलीटर रक्त संग्रह vacutainer ।
  2. स्वस्थ स्वयंसेवकों से पूरे रक्त ले लीजिए (विरोधी से मुक्त प्लेटलेट और गैर-स्टेरॉयड विरोधी भड़काऊ दवाओं सात दिनों के लिए) venipuncture द्वारा (3 मिलीलीटर प्रत्येक की तीन ट्यूबों), एक प्रोटोकॉल के बाद कि बर्नार्डो एट अलद्वारा प्रकाशित करने के लिए समान26.
  3. पहली ट्यूब त्यागें, प्रारंभिक ऊतक क्षति venipuncture के साथ जुड़े के रूप में सहज प्लेटलेट सक्रियण पैदा कर सकता है ।
  4. धीरे थक्कारोधी के साथ रक्त मिश्रण करने के लिए vacutainers तीन बार पलटना ।
  5. 15 मिनट के लिए 24 डिग्री सेल्सियस (कमरे के तापमान) में १५० x g पर vacutainers केंद्रापसारक ।
  6. धीरे से प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा (supernatant) एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एक पिपेट के साथ निकालें और ध्यान से यह एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । संभावित क्रॉस-सक्रियण से बचने के लिए प्रत्येक vacutainer के प्लेटलेट-रिच वॉल्यूम को एकल शंकु ट्यूब पर स्थानांतरित करें ।
    नोट: प्लेटलेट अलगाव बैक्टीरिया संदूषण और संभावित कृत्रिम प्लेटलेट और/या endothelial सक्रियण को रोकने के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए ।
  7. ९०० पर 10 मिनट के लिए एक्स जी में शंकु ट्यूबों के केंद्रापसारक 24 डिग्री सेल्सियस (कमरे के तापमान) के लिए प्लेटलेट्स गोली ।
  8. पिपेट और प्लेटलेट-गरीब supernatant को त्यागें ।
  9. साइट्रेट-ग्लूकोज सोडियम (सीजीएस) बफर (13 मिमी सोडियम साइट्रेट, 30 मिमी डी-ग्लूकोज, और १२० मिमी सोडियम क्लोराइड, पीएच ७.०) के 1 मिलीलीटर के साथ ध्यान से गोली धो ।
    नोट: सीजीएस बफर जोड़ दिया जाता है और गोली धीरे reसस्पैंड है जब प्लेटलेट्स wisp की तरह संरचनाओं में दिखाई देगा. प्लेटलेट सक्रियण द्वारा दूषित नमूनों में, प्लेटलेट्स आसानी से reसस्पेंड नहीं होगा और झुरमुट दिखाई देगा ।
  10. एक बार पूरी तरह से reसस्पैंड, 24 डिग्री सेल्सियस (कमरे के तापमान) में 10 मिनट के लिए ९०० x g पर नमूने केंद्रापसारक ।
  11. सीजीएस धो बफर निकालें और Tyrode के बफर के 3 मिलीलीटर (१३८ mm सोडियम क्लोराइड, ५.५ मिमी डी-ग्लूकोज, 12 मिमी सोडियम बिकारबोनिट, २.९ मिमी पोटेशियम क्लोराइड, और ०.३६ मिमी dibasic सोडियम फॉस्फेट, पीएच ७.४) में गोली पुनः स्थगित । प्लेटलेट्स का पूरा निलंबन सुनिश्चित करें और, यदि एकत्रीकरण मनाया जाता है, नमूना त्यागें ।
  12. एक 20 मिमी DiOC6 स्टॉक समाधान से १.५ µ l जोड़ें (भंग ५७.२५ मिलीग्राम मेथनॉल के 5 मिलीलीटर में) 1 µ एम के अंतिम एकाग्रता के लिए धोया प्लेटलेट्स की प्रत्येक 3 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए
    नोट: DIOC6 एक हरी फ्लोरोसेंट mitochondrial इस प्रयोग में इस्तेमाल के लिए प्लेटलेट्स लेबल डाई है ।
  13. Aliquot तीन १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूबों के लिए धोया प्लेटलेट समाधान की 1 मिलीलीटर ।
    नोट: इस प्रयोग के लिए आवश्यक प्लेटलेट की मात्रा प्रवाह चैंबर के आकार, वांछित कतरनी तनाव, और प्रयोग की लंबाई (चरण ६.५) के आधार पर गणना की जाती है । इस प्रोटोकॉल को स्थिति परिवर्तन के रूप में समायोजित किया जा सकता है सुनिश्चित करें कि द्रव प्रवाह के लिए पर्याप्त मात्रा में है ।
  14. अलगाव के 2 ज के भीतर धोया प्लेटलेट्स का उपयोग करें ।

6. प्रवाह तंत्र विधानसभा

  1. एक छोर पर एक पुरुष कोहनी Luer कनेक्टर करने के लिए बाँझ सिलिकॉन टयूबिंग (१.६ mm के इंटीरियर व्यास) के एक ७० सेमी टुकड़ा देते हैं और दूसरे पर एक महिला Luer ताला अनुकूलक ।
  2. एक 20 मिलीलीटर सिरिंज के लिए टयूबिंग से जुड़ी महिला Luer ताला अनुकूलक कनेक्ट ।
  3. दोहराएँ चरण ६.१ और ६.२ दो बार तीन समान सिरिंज-टयूबिंग कनेक्शन उत्पन्न करने के लिए.
  4. एक सिरिंज पंप का उपयोग करने के लिए द्रव प्रवाह उत्पंन । सिरिंज में निम्नलिखित सेटिंग्स इनपुट: सिरिंज और प्रवाह दर के इंटीरियर व्यास.
    नोट: एक 20 मिलीलीटर सिरिंज १९.५५ mm का एक इंटीरियर व्यास है । प्रवाह की दर वांछित कतरनी दर/कतरनी तनाव और प्रवाह चैंबर के आयामों के आधार पर गणना की है । प्रवाह वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया चैंबर के लिए, 1 dyn/मुख्यमंत्री2 प्राप्त करने के लिए (कम शिरापरक कतरनी में मनाया), ९.३७ µ एल के एक प्रवाह की दर/ histones शिरापरक घनास्त्रता को जोड़ने सबूत के कारण, ४.४५ dyn/cm2 का एक मध्यम शिरापरक कतरन चयनित है । यह भी इस धारणा है कि बफर पानी के लिए एक समान चिपचिपापन है पर आधारित है । प्रवाह दर तो ४१.७ µ l के बराबर है/विभिन्न प्रवाह चैंबर आयामों के लिए प्रवाह की दर की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया समीकरण में पाया जा सकता है:
    1. सिरिंज पंप पर बटन विकल्प का उपयोग कर तरल पदार्थ को वापस लेने के लिए पंप सेट ।
  5. सिरिंज के पंप और plungers के आसपास कसकर सुरक्षित कोष्ठक पर टयूबिंग से जुड़ी तीन सीरिंज लोड करें ।
  6. बाँझ सिलिकॉन टयूबिंग के एक दूसरे 20 सेमी टुकड़ा के दोनों सिरों को एक पुरुष कोहनी Luer देते हैं ।
  7. एक कोहनी Luer एक कुंद 18-गेज सुई से कनेक्ट करें ।
  8. दो बार दोहराएं, प्रवाह चैंबर के तीन लेन के लिए तीन समान सेवन प्रणालियों का निर्माण ।
    नोट: सिलिकॉन टयूबिंग और Luers 10% पुनः प्रयोग से पहले आसुत जल के बाद ब्लीच के साथ धोया जा सकता है । यह प्रवाह कक्षों का पुन: उपयोग करने के लिए अनुशंसित नहीं है ।

7. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स

  1. एक पूरी तरह से स्वचालित चरण से सुसज्जित एक कताई डिस्क माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें. ४०५, ४५८, ४९१, ५४३, और ६३३ एनएम लेजर लाइनों प्रदान करता है कि एक लेज़र प्रक्षेपण के साथ रोशनी प्रदर्शन करते हैं । एक 20X उद्देश्य के साथ सभी छवियों पर कब्जा । विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf) के साथ सभी पैरामीटर्स समायोजित करें ।
  2. अधिग्रहण के लिए चैनल सेटिंग्स (उत्सर्जन फ़िल्टर: 520/35), ४९१ एनएम पर उत्तेजना के साथ, का चयन करें । सेट इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस के लिए एक इलेक्ट्रॉन १५० के लाभ गुणा, २०० ms के एक जोखिम समय के साथ, पूर्ण गतिशील डेटा रेंज प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: प्लेटलेट्स एक हरे रंग की फ्लोरोसेंट डाई, DiOC6 के साथ, तरंग दैर्ध्य maxima (उत्तेजना, ४८२ एनएम; उत्सर्जन, ५०४ एनएम) के साथ लेबल कर रहे हैं ।
  3. ४९१ एनएम लेजर पावर को 20% तक एडजस्ट करें ।
  4. सभी तीन गलियों के केंद्र चिह्नित करें और जेड रेंज और चरण आकार के लिए ०.५ माइक्रोन के लिए 1 माइक्रोन का चयन । समय अंक (यानी, अवधि) और छवियों के बीच का समय (यानी, अंतराल) की संख्या का चयन एक छवि हर 10 एस पर कब्जा करने के लिए; "६० समय अंक" प्रति स्लाइड का चयन करें । तीन लेन से छवियों को पकड़ने और उन्हें एक निर्दिष्ट प्रयोग फ़ोल्डर को बचाने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें ।
    नोट: क्योंकि प्रवाह चैंबर तीन लेन है, माइक्रोस्कोप के लिए तीन स्थानों के बीच टॉगल करने के लिए छवियों पर कब्जा करने की आवश्यकता होगी ।

8. VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन

  1. संस्कृति मध्यम प्रवाह कक्ष से निकालें (से चरण 4) ४.४ चरण में के रूप में एक ही तकनीक का उपयोग कर ।
  2. या तो हिस्टामिन (25 µ m) के १०० µ l को जोड़ें, पमा (१०० एनएम), उह, एच, या मानव संसाधन (25 µ जी पर सभी/एमएल) सीरम मुक्त मध्यम में पतला (के रूप में १.४ कदम) कमरे के तापमान और परिवेश में 15 मिनट के लिए BOEC monolayer उत्तेजित करने के लिए2/CO2।
    नोट: हालांकि VWF रिहाई के लिए आवश्यक नहीं है, ३७ डिग्री सेल्सियस पर इस उत्तेजना प्रदर्शन में सुधार होगा VWF exocytosis27।
  3. सुनिश्चित करें कि प्रवाह कक्ष के तीन अलग लेन में से एक प्रयोगात्मक नियंत्रण के रूप में अनुपचारित रहते हैं ।
  4. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर मध्यम निकालें और यह १०० के साथ की जगह-२०० µ एल के secretagogues से धो करने के लिए endothelial monolayer के बंद.
  5. एक स्लाइड पर फ्लो चैंबर माउंट संवहनी क्लिप का उपयोग करने के लिए जगह में कक्ष सुरक्षित खड़े हो जाओ ।
  6. ७० सेमी टयूबिंग के अंत पर उपलब्ध पुरुष Luer संबंधक संलग्न (सिरिंज से जुड़ा) प्रवाह कक्ष के जलाशय के लिए । दो अंय प्रवाह चैंबर लेन के लिए दोहराएं ।
  7. ऐसे में पंजाबियों को वॉश निकालने के लिए सिरिंज पंप शुरू करें । पिपेट का विरोध प्रवाह चैंबर जलाशय में अतिरिक्त पंजाबियों को सुनिश्चित करना है कि गलियों सूखी नहीं चला है ।
  8. सभी तीन गलियों में बराबर प्रवाह के लिए प्रवाह प्रणाली का निरीक्षण करें और फिर सिरिंज पंप रोकें ।
  9. एक क्षेत्र का चयन करने के बारे में प्रत्येक लेन के बीच में छवियों को पकड़ने के लिए, प्रयोग के बीच लगभग एक ही क्षेत्र में ।
    नोट: माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग व्यक्ति प्रयोगात्मक शर्तों के लिए अंधा किया जा सकता है । इस कदम को सुनिश्चित करता है कि माइक्रोस्कोप प्लेटलेट प्रवाह से पहले ध्यान केंद्रित है (चरण 7 को देखें) ।
  10. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक महिला luer युग्मक संलग्न और फिर मुक्त पुरुष luer कनेक्टर (चरण ६.८) और धोया प्लेटलेट समाधान (चरण ५.१३) युक्त १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में कुंद सुई जलमग्न. धीरे प्रणाली के भीतर कोई हवा बुलबुले सुनिश्चित करने के लिए टयूबिंग के माध्यम से प्लेटलेट समाधान ड्रा ।
  11. 5 मिलीलीटर सिरिंज निकालें और पुरुष Luer प्रवाह चैंबर के खुले जलाशय के लिए संलग्न । तीन लेन के लिए दोहराएं ।
  12. सिरिंज पंप को पुनरारंभ करें और अंधेरे में 10 मिनट के लिए चरण 7 से माइक्रोस्कोप और प्रोटोकॉल सेटिंग्स का उपयोग कर प्लेटलेट प्रवाह के दौरान छवियों पर कब्जा ।
  13. 10 मिनट के बाद, प्रवाह चैंबर जलाशय पर सेवन टयूबिंग से Luer डिस्कनेक्ट और पंजाब के साथ जलाशय को भरने के लिए endothelial monolayer पर प्रवाह बनाए रखने के ।

9. VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग ठहराव

नोट: VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग बढ़ाव छवि विश्लेषण के लिए बनाए रखने के लिए पंजाब के निरंतर प्रवाह की आवश्यकता है । प्रवाह की समाप्ति गोलाकार बनने VWF में परिणाम होगा और VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग ठहराव ख़राब हो जाएगा । यह छवि पर कब्जा के दौरान पंजाबियों के साथ प्रत्येक जलाशय ऊपर शीर्ष करने के लिए आवश्यक है । HBSS की जगह ले सकते हैं अगर सेल सिकुड़ने या टुकड़ी इस कदम के दौरान मनाया जाता है ।

  1. पहले लेन के साथ शुरू, स्लाइड प्रति 10 छवियों पर कब्जा स्लाइड के बीच चारों ओर एक 20X उद्देश्य लेंस का उपयोग कर ओवरलैप के बिना । प्रत्येक लेन के लिए इस दोहराएं ।
    नोट: अशांत कतरन तनाव के कारण जलाशयों के आसपास के क्षेत्रों से बचना चाहिए ।
  2. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, "छवि," "समायोजित करें," और "चमक/कंट्रास्ट" क्लिक करके चमक समायोजित । स्क्रॉल पट्टी को तब तक खींचें, जब तक कि ठहराव के लिए पर्याप्त मात्रा में प्लेटलेट्स देखा नहीं जा सकता ।
  3. एक VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग रिकॉर्ड जब तीन या अधिक संरेखित प्लेटलेट्स छवि में स्वीकार्य हैं । एक छवि में सभी VWF-प्लेटलेट तार गिनती । सभी 10 छवियों और प्रयोग के लिए औसत के लिए दोहराएँ.
    नोट: ठहराव प्रदर्शन करने वाले व्यक्ति को प्रायोगिक परिस्थितियों में अंधा किया जा सकता है । यह VWF के लिए सह दाग आवश्यक नहीं है, क्योंकि यह स्वतंत्र अध्ययन8,28,29की पुष्टि की गई है ।
  4. प्रत्येक secretagogue का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग को न्यूनतम तीन बार दोहराएँ.

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Representative Results

endothelial कोशिकाओं से VWF जारी करने पर histones के प्रभाव का सीधे आकलन करने के लिए, हमने धाराप्रवाह BOECs को सीरम रहित माध्यम से अवगत कराया जिसमें पमा (धनात्मक नियंत्रण), उह, HR, और एच के लिए 2 ज. हमें पता चला कि एच एक 2-VWF प्रोटीन (VWF: एजी) में इलाज endothelial कोशिकाओं के माध्यम में गुना वृद्धि (चित्रा 1) प्रेरित किया । दिलचस्प है, जब BOECs उह और मानव संसाधन के साथ उत्तेजित थे, वहां कम VWF था: एजी इलाज की हालत में से मध्यम में पता चला । हम परिकल्पना की है कि क्योंकि histones सीधे30VWF करने के लिए बाइंड कर सकते हैं, वे VWF के साथ हस्तक्षेप हो सकता है: संस्कृति माध्यम में एजी का पता लगाने । VWF करने के लिए बाध्यकारी citrullinated का मूल्यांकन करने के लिए, हम एक ठोस चरण बाध्यकारी परख करते थे । हमें पता चला है कि उह और मानव संसाधन और अधिक दृढ़ता से VWF को एच (चित्रा 2) से बंधे, पता लगाने के हस्तक्षेप का समर्थन चित्रा 1में प्रदर्शन किया ।

Extracellular histones इन विट्रो19में प्लेटलेट्स सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है, और हमारे डेटा का सुझाव है कि histones मध्यस्थता VWF endothelial कोशिकाओं से जारी. VWF-प्लेटलेट बातचीत पर histones के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए, हम VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन के एक प्रवाह चैंबर मॉडल का इस्तेमाल किया जिसमें बला प्लेटलेट्स उत्तेजित endothelial कोशिकाओं पर perfused थे. प्रतिनिधि छवियों के पद पर कब्जा कर लिया गया प्रवाह, और VWF-प्लेटलेट तार की संख्या मात्रा थे ।

हमने देखा है कि, प्रवाह की स्थिति की दीक्षा के बाद, अनुपचारित कोशिकाओं को बहुत कुछ VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग्स था (< 1 स्ट्रिंग प्रति समीक्षा फ़ील्ड), जबकि हिस्टामिन और पमा-इलाज कक्षों में क्रमशः २.१० और ३.१० स्ट्रिंग्स का औसत था । काफी अधिक VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग्स का गठन किया गया जब कक्ष (३.५२ स्ट्रिंग्स, p = ०.०१९), HR (६.०० स्ट्रिंग्स, p = ०.००४), और उह (५.५१ स्ट्रिंग्स, p = ०.०१२) के साथ इलाज किया गया । VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गणना का ग्राफ़िकल प्रस्तुतिकरण चित्र 3gमें दिखाया गया है । वास्तविक समय VWF-अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में उह के जवाब में प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन वीडियो 1a और बीमें दिखाया गया है.

इन अध्ययनों के साथ अन्य समूहों द्वारा जांच के साथ, कि histones28 और अन्य भड़काऊ एजेंटों जैसे हिस्टामिन5 और साइटोकिंस31 endothelial कोशिकाओं से VWF स्राव को उत्तेजित, बाद में प्लेटलेट मध्यस्थता इन विट्रो मेंकैप्चर । हमने यह दर्शाया कि endothelial कोशिकाओं की स्थिर उत्तेजना को बाँधने और एकांत VWF को histones की क्षमता के कारण स्पष्ट VWF रिहाई के लिए पर्याप्त नहीं था. VWF रिहाई और प्लेटलेट आसंजन के एक प्रवाह चैंबर मॉडल के डिजाइन इसलिए और अधिक पूरी तरह से विशेषताएं और endothelium, VWF, और प्लेटलेट्स के बीच vivo बातचीत में मॉडल की आवश्यकता थी ।

Figure 1
चित्र 1: Lysine-रिच Histones कल्चर्ड Endothelial कक्षों से VWF रिलीज़ लाती है. BOECs unfractionated citrullinated (उह), lysine अमीर (एच), और arginine अमीर (मानव संसाधन) citrullinated भागों के साथ उत्तेजित थे । एचके संस्कृति माध्यम में VWF जारी उत्तेजित । उह और मानव संसाधन उपचार VWF का पता लगाने में कमी आई: endothelial कोशिका मध्यम अनुपचारित (Untr) नियंत्रण के सापेक्ष में एजी । एन ≥ 3 व्यक्तिगत प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया । डेटा माध्य मान ± SE के रूप में दिखाए जाते हैं. *p < 0.05, * *p < 0.01, और * * *p < 0.001, अनुपचारित स्थिति के सापेक्ष महत्व का संकेत देते हैं । यह आंकड़ा मिशेल एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: VWF-citrullinated बाइंडिंग विट्रो मेंVWF डिटेक्शन के साथ हस् तक्षेप करती है । प्लाज्मा-व्युत्पंन VWF और मानव संसाधन के लिए दृढ़ता से बांधता है और एक खुराक में उह-निर्भर फैशन lysine-रिच (एच) histones की तुलना में एक ठोस चरण बाध्यकारी परख में । डेटा मतलब मान के रूप में दिखाया गया है ± एसई. N ≥ 3 व्यक्तिगत प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया । यह आंकड़ा मिशेल एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Histones मध्यस्थता VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन. फ्लो चैंबर स्लाइड पर Endothelial कोशिकाओं unfractionated citrullinated (उह), lysine अमीर (एच), या arginine-रिच (HR) citrullinated अंशों या हिस्टामिन/पमा (सकारात्मक नियंत्रण) के साथ इलाज किया गया और 10 मिनट के लिए ४.४५ perfused/cm2 के एक कतरनी तनाव में dyn थे धोया के साथ, फ्लोरोसेंट लेबल प्लेटलेट्स । प्रतिनिधि छवियों अनुपचारित नियंत्रण (ए) और हिस्टामिन (बी) के साथ इलाज कोशिकाओं से प्लेटलेट प्रवाह के बाद प्राप्त किया गया, Phorbol १२-myristate १३-एसीटेट (पमा) (ग), डलर (घ), HR (E), व उह (च) । पमा उपचार दृष्टिकोण के प्रति क्षेत्र ३.१ तार के एक औसत के परिणामस्वरूप, हिस्टामिन के लिए तुलनीय । VWF-प्लेटलेट तार 10 लगातार समीक्षा क्षेत्रों से मात्रा थे और n ≥ 3 व्यक्तिगत प्रयोगों (G) के लिए औसत । डेटा माध्य मान ± SE के रूप में दिखाए जाते हैं. * p < 0.05 और * * p < 0.01, अनुपचारित स्थिति के सापेक्ष महत्व का संकेत देते हैं । यह आंकड़ा मिशेल एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक वीडियो । VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन के जवाब में Unfractionated citrullinated (2) कोई उपचार की तुलना में (1): इस वीडियो को मिशेल एट अल15से संशोधित किया गया है। कृपया इन वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

जबकि VWF-प्लेटलेट तार की शारीरिक प्रासंगिकता VWF की उपस्थिति में उनके तेजी से विघटन के कारण विवादास्पद रहता है-सट चिढ़ा ADAMTS13, वे एक quantifiable के रूप में सेवा इन विट्रो में एक साइट के लिए VWF द्वारा प्लेटलेट भर्ती के मॉडल जो एक थक्का citrullinated स्तर5में स्थानीयकृत वृद्धि की उपस्थिति में प्रपत्र हो सकता है । इसके अलावा, ADAMTS13 गतिविधि की कमी विकृतियों में-जैसे थ्रोम्बोटिक थ्रोम्बोसाइटोपेनिक purpura (टीटीपी)-या भड़काऊ microenvironments में-जहां ADAMTS13 गतिविधि बाधित है-VWF-प्लेटलेट तार vivo३२ में देखा जा सकता है और मई प्लेटलेट microaggregation और ल्युकोसैट extravasation में योगदान, VWF३३के hemostatic और भड़काऊ कार्यों को जोड़ने. अंत में, यह परिकल्पना की गई है कि VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन शिरापरक और/या धमनी घनास्त्रता में एक प्रारंभिक घटना हो सकता है, जो चारों ओर एक रोग थक्का बनाया गया है nidus बनाने ।

प्रवाह चैंबर प्रणाली में VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन WPB exocytosis, ADAMTS13 दरार, और VWF की प्लेटलेट बाइंडिंग क्षमता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन प्रयोगों को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए कई महत्वपूर्ण चरण हैं. हालांकि, मॉडल के आवेदन पर निर्भर करता है, संशोधनों के प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है ।

विशिष्ट संवहनी बिस्तरों से Endothelial कोशिकाओं यांत्रिक और जैव रासायनिक संकेतों को३४के लिए अपनी प्रतिक्रिया में विषम हैं । इसलिए यह इस पद्धति के आवेदन के लिए उपयुक्त एक सेल प्रकार का चयन करने के लिए उपयोगी हो सकता है । BOECs उनकी प्रफलन क्षमता की वजह से वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया गया; कई (10 +) मार्ग के पार phenotype का रखरखाव; और मजबूत VWF अभिव्यक्ति, VWF exocytosis के ठहराव की सुविधा । अंय जांचकर्ताओं मानव गर्भनाल नस endothelial कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है (HUVECs)5,8,28 और गैर endothelial कोशिकाओं (मानव भ्रूण गुर्दे २९३ कोशिकाओं) VWF cDNAs एक्सप्रेस VWD उत्परिवर्तनों के साथ transfected३५ . यह प्रदर्शित किया गया है कि VWF अभिव्यक्ति काफी ऊतक और पोत फिजियोलॉजी३६के बीच बदलता है । विभिंन सूक्ष्म और macrovasculature से उत्पंन होने वाले कल्चरित endothelial कोशिकाओं में VWF प्रोटीन बेसल स्राव३७में अंतर है, और इस बात का सबूत है कि endothelial सेल उपप्रकार के बीच कैल्शियम चैनल मतभेद प्रभाव WPB exocytosis के जवाब में secretagogues३८

Histones इस अध्ययन में एक उपंयास secretagogue के रूप में इस्तेमाल किया गया । वे सकारात्मक नियंत्रण, हिस्टामिन, VWF रिहाई के एक बार वर्णित शारीरिक उत्तेजक की तुलना में थे । एक VWF: एजी एलिसा स्थैतिक शर्तों के तहत endothelial कोशिकाओं से VWF जारी सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । intracellular कैल्शियम३९ या पीएफ चक्रीय AMP के स्तर४०के उन्नयन: VWF की रिहाई को ट्रिगर कि दो intracellular तंत्र हैं. इन रास्ते के विभेदक सक्रियण secretagogues द्वारा ऐसे thrombin/हिस्टामिन या एड्रेनालाईन/vasopressin के रूप में प्रेरित किया जा सकता है (या, VWD के लिए प्रासंगिक, desmopressin), क्रमशः, और यह इन दो इस प्रवाह चैंबर का उपयोग रास्ते की तुलना दिलचस्प हो सकता है VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन के मॉडल । thrombo-भड़काऊ रोग के संदर्भ में, और अधिक भड़काऊ elucidation, जैसे साइटोकिंस४१ या क्षति/रोगज़नक़-संबंधित आणविक पैटर्न (स्पंज/PAMPS), और VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन में उनकी भूमिकाओं को प्रोत्साहित किया जाता है ।

द्रव कतरनी तनाव महत्वपूर्ण है जब गोलाकार VWF प्लेटलेट्स पर ग्लाइकोप्रोटीन आईबी के लिए A1 डोमेन बाइंडिंग साइट का पर्दाफाश करने के लिए करेंगी11। यह प्रदर्शित किया गया है कि लगभग ०.७३ dyn/cm2 के एक ंयूनतम द्रव कतरनी तनाव VWF तार४२करने के लिए प्लेटलेट बाइंडिंग के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, इन तार endothelial कोशिकाओं पर अपेक्षाकृत कम कतरनी तनाव पर फार्म (२.५ dyn/cm2) पर 20 dyn/cm2 या8से ऊपर के कतरनी तनाव पर उखाड़ फेंका जा सकता है । वर्तमान जांच में, हम एक 10 मिनट के प्रयोग के लिए छिड़काव बफर संरक्षण जबकि endothelium, VWF, और प्लेटलेट्स के बीच बातचीत के लिए अनुमति दी है कि एक शिरापरक कतरनी तनाव (४.४५ dyn/

VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग्स के ADAMTS13 दरार का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रवाह चैंबर प्रणाली का उपयोग इस प्रयोग में इस्तेमाल उन पर द्रव कतरनी तनाव में वृद्धि की आवश्यकता है । VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग्स के अधिक से अधिक ADAMTS13 दरार 10 और 30 dyn/cm212, मध्यम धमनी कतरनी तनाव४३के लिए उच्च शिरापरक शामिल है कि एक सीमा के बीच होता है । इस प्रणाली में कतरनी दर को संशोधित करने VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन और विघटन की तुलना के लिए उपयोगी हो सकता है, शिरापरक, धमनी, या microvascular घनास्त्रता के विकास में कारकों का योगदान ।

इस तकनीक के अतिरिक्त संशोधनों को छिड़काव सामग्री और प्रवाह कक्ष में बनाया जा सकता है. Secretagogues vivo वातावरण में समान करने के लिए प्रवाह की स्थिति के तहत प्रशासित किया जा सकता है । एगोनिस्ट के साथ प्लेटलेट्स भड़काना उनकी जेट या ल्युकोसैट आबादी सहित मूल्यांकन करने के लिए इस तकनीक का विस्तार कर रहे हैं । इसके अलावा, चिकित्सीय VWF multimer लंबाई लक्ष्यीकरण एजेंटों, प्लेटलेट बाध्यकारी क्षमता, या प्लेटलेट प्रतिक्रिया सहित महत्वपूर्ण तंत्र है कि थक्का विकास की दीक्षा को विनियमित स्पष्ट सकता है । अंय जांचकर्ताओं का इस्तेमाल किया है या तो घर में४४ या ग्लास coverslip प्रवाह मंडलों४५खरीदा है, के रूप में बहुलक के खिलाफ इस अध्ययन में इस्तेमाल किया स्लाइड आधारित है, और तुलनीय परिणाम प्राप्त करने लगते हैं ।

VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण विचार धोया प्लेटलेट्स की तैयारी है । यह ADAMTS13 की उपस्थिति के कारण इस प्रोटोकॉल में पूरे रक्त का उपयोग करने के लिए अनुशंसित नहीं है । इस तरह prostacyclin या apyrase के रूप में प्लेटलेट सक्रियण को रोकने के एजेंटों, से बचना चाहिए, के रूप में इस बाद में प्रतिकूल VWF को प्लेटलेट आसंजन को प्रभावित कर सकते हैं । सुनिश्चित करना है कि बफर कमरे के तापमान से पहले प्लेटलेट अलगाव के लिए लाया और सावधान पिपेट तकनीक का उपयोग कर (यानी, बुलबुले और कठोर कतरनी तनाव से परहेज) उनके निष्क्रिय राज्य में प्लेटलेट्स बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, एक mitochondrial दाग के साथ प्लेटलेट्स लेबलिंग, DIOC6 या rhodamine 6G के रूप में, extracellular के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है कि डोमेन के साथ हस्तक्षेप पर पसंद किया जाता है बाध्यकारी VWF. हालांकि, जैसा कि DIOC6 एक झिल्ली-पारगंय डाई है, यह भी प्रयोग के पाठ्यक्रम पर endothelial कोशिकाओं द्वारा छोटी मात्रा में लिया जा सकता है । एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के अभाव में, अन्य अध्ययनों VWF-प्लेटलेट उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी४६का उपयोग कर तार मनाया है.

अंत में, VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन के इस प्रवाह चैंबर पद्धति यंत्रवत, रीयल-टाइम डेटा को घनास्त्रता के रोगजनन में vivo टिप्पणियों में समर्थन प्रदान कर सकते हैं । कतरनी के लिए जोखिम के रूप में दृढ़ता से pathophysiological भूमिका है कि VWF thrombo-भड़काऊ रोग में खेलता है, प्रवाह चैंबर मॉडल किसी भी endothelial सेल-इस में प्लेटलेट बातचीत को समझने में रुचि प्रयोगशाला के लिए एक महत्वपूर्ण खोजी उपकरण है प्रभावित संदर्भ.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

एलिसन मिशेल स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) के कनाडाई संस्थानों से एक फ्रेडरिक बंटिंग और चार्ल्स सर्वश्रेष्ठ कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति के एक प्राप्तकर्ता है । लौरा एल Swystun प्राप्तकर्ता एक CIHR फैलोशिप है । डेविड Lillicrap आणविक रक्तस्तम्भन में कनाडा के एक शोध कुर्सी के प्राप्तकर्ता है । इस अध्ययन के हिस्से में एक CIHR ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया (९७८४९) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calf-thymus unfractionated histones (UH) Worthington Biochemical HLY Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK) Sigma-Aldrich H5505 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR) Sigma-Aldrich H4830 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine Sigma-Aldrich H7125-1G Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) Invitrogen D273 Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating Antibody DAKO A0082 For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated DAKO P0026 For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates eBioscience 44-2404-21 For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates Thermo Scientific 3855 For VWF ELISA
Humate-P CSL Behring N/A Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference Plasma Precision BioLogic CCNRP-05 For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent Sigma-Aldrich P8287 Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092
Rat-tail Collagen Type 1 Corning 354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher Scientific 31985070 For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software Molecular Devices N/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive BD Biosciences 366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers) Ibidi This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized Ibidi 10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized Ibidi 10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized Ibidi 10802
Blunted 18G Needle BD Biosciences 305180
20 mL syringes BD Biosciences 302830
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope Quorum Technologies N/A
Image Processing Software ImageJ N/A

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References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, aB., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

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मेडिसिन इश्यू १२६ वॉन Willebrand फैक्टर प्लेटलेट्स endothelial सेल फ्लो चैंबर histones Weibel-Palade बॉडीज कतरनी ताण घनास्त्रता.
जांच वॉन Willebrand फैक्टर वॉन Willebrand फैक्टर-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन के एक प्रवाह चैंबर मॉडल का उपयोग Pathophysiology
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Michels, A., Swystun, L. L.,… More

Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. J. Vis. Exp. (126), e55917, doi:10.3791/55917 (2017).

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