Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Utreda von Willebrand faktor patofysiologi använder en modell för flödet av avdelningen av von Willebrands faktor-trombocyter sträng bildandet

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/55917
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Department of Medicine, Queen's University

Summary

I detta papper, vi beskriver en metod för att bedöma endothelial von Willebrands faktor release och det efterföljande trombocytantalet fånga under vätska skjuvspänningen svar på inflammatoriska stimuli med en in vitro- flöde kammaresystem.

Abstract

Von Willebrand-faktor (VWF) är en multimeric glykoprotein koagulationsfaktor som förmedlar trombocytantal adhesion och aggregering på platser av endoteliala skador och som bär faktor VIII i cirkulationen. VWF är syntetiseras av endotelceller och släpps antingen konstitutivt i plasma eller lagras i specialiserade organeller, kallas Weibel-Palade organ (WPBs), på begäran släpps i svar hemostatiska utmaningen. Prokoagulanta och proinflammatoriska stimuli kan snabbt framkalla WPB exocytos och VWF release. Majoriteten av VWF släpptes av endotelceller cirkulerar i plasma; dock är en del av VWF förankrad till endotelceller ytan. Under förhållanden av fysiologiska skjuvning, kan endotel-förankrade VWF binda till trombocyter, bildar en VWF-trombocyt-sträng som kan representera nidus tromb bildas. Ett flöde kammaresystem kan användas för att visuellt följa frisläppandet av VWF från endotelceller och det efterföljande trombocytantalet fånga på ett sätt som är reproducerbara och relevant för patofysiologin av VWF-medierad tromb bildas. Användningen av denna metod, endotelceller är odlade i en kammare som flödet och därefter stimuleras med secretagogues att framkalla WPB exocytos. Tvättade trombocyter är sedan perfusion över aktiverade endotelet. Trombocyter aktiveras och därefter binda till avlånga VWF strängar i riktning mot vätskeflöde. Med hjälp av extracellulära histoner som prokoagulanta och proinflammatoriska stimulans, observerat vi ökad VWF-trombocyter sträng bildning på Histon-behandlade endotelceller jämfört med obehandlade endotelceller. Det här protokollet beskriver en kvantitativ, visuell och realtid bedömning av aktiveringen av VWF-trombocyter interaktioner i modeller för trombos och hemostas.

Introduction

Trombos är en ledande orsak till dödlighet i världen1 och kan utvecklas i svar todysregulated trombocyter aktivering och trombin generation i båda veinsand artärer. Plasmanivåerna av VWF är en nyckelroll i regulering av koagulation, whereby låga nivåer (< 50%) resultera i en blödningssjukdom som kallas von Willebrands sjukdom (VWD)2 och höga nivåer (> 150%) är associerade med en ökad risk för venös3 och arteriell4 trombos.

VWF är ett multimeric glykoprotein syntetiseras av megakaryocyter och endotelceller och lagras i trombocytantal α-granulat och WPBs, respektive. Vid hemostatiska utmaning, kan VWF frigöras från endotelceller WPBs att tjudra cirkulerande trombocyter till aktiverade endotelceller5 eller exponerade kollagen på fartyget vägg6. Förankring av VWF att endotelceller har visat sig vara medierade av P-selektin7 och integrin αvβ38. Den påföljande frisättningen av trombocyter α-granule butiker kan ytterligare öka lokaliserade VWF koncentrationer för att stabilisera trombocyt-trombocyter interaktioner för trombocyter plug bildandet, ställningen behövs för förökning av koagulationskaskaden och fibrin nedfall. VWF trombocyter-bindande verksamhet regleras av dess multimeric struktur, med hög-molekylär vikt multimers besitter större hemostatiska aktivitet9,10. I omlopp fungerar VWF också som bärare för den koagulationsfaktor VIII.

Vätska skjuvspänningen är en viktig regulator av VWF fysiologi. I avsaknad av skjuvspänning finns VWF i klotformiga form, dölja bindande domäner för trombocyter glykoprotein Ib vidhäftning11. När skjuvspänning är närvarande, är klyvning platsen för en metalloprotease, en disintegrin och metalloprotease med thrombospondin motiv (ADAMTS13), exponerad. ADAMTS13 klyver naken och trombocyt-inredda VWF strängar för att reglera multimer storlek, vilket minskar dess hemostatiska aktivitet12.

VWF är ett akut-fas protein, och många stimuli, inklusive hypoxi13, infektion14och proinflammatoriska cytokiner, har visat att medla VWF release från endotelceller. Liknar andra inflammatoriska agenter, extracellulär histoner har också visats inducera systemisk VWF release i möss15,16 och aktiveringen av trombocyter in vitro-17,18, 19. Detta visade sig vara beroende av Histon subtyp, som skillnader i lysin och arginin innehåll kan påverka funktion15. Vår studie syftar till att upprätta en flöde kammare modell för att undersöka påverkan av lysin-rika (HK) och arginin-rika (HR) Histon subtyper och secretagogues på endotelceller VWF release och realtid trombocytantal fånga, potentiella tidiga händelser i inflammation-inducerad trombos.

Detta flöde kammare metodik recapitulates i vivo interaktioner mellan subendothelial kollagen, endotelceller, VWF och trombocyter i ett in vitro- system som är visuell, reproducerbar och kvantifierbara. Det möjliggör realtid bedömning av alla aspekter av den väg som reglerar VWF-blodplättar interaktion, inklusive WPB sekretion, trombocytaktivering och VWF proteolys. Studier av VWF under kontrollerade skjuvspänning har använts för att utvärdera VWD mutationer som försämrar VWF release och trombocyt-bindande funktion20, WPB fysiologi21och VWF klyvning av ADAMTS135. Vi använder denna metod för att kvantifiera VWF-trombocyter sträng bildas till följd av ett inflammatoriskt stimulus: extracellulära histoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dessa studier har godkänts av forskning etik styrelsen av Queen's University, Kanada.

1. endotelceller stimulering

  1. Kollagen-coat en 6-väl vävnadsodling tallrik.
    1. 24 timmar i förväg, coat en 6-väl vävnadsodling tallrik vid 37 ° C med 1 mL av kollagen buffert (50 µg/mL rat tail kollagen typ 1 med 0,02 M isättika).
    2. Tvätta brunnarna två gånger med 2 mL av Hank's Balanced Salt lösning (HBSS).
      Obs: Plattor kan vara insvept i aluminiumfolie och förvaras i en lufttät plastpåse vid 4 ° C.
  2. Utsäde endotelceller vid en densitet av 1 x 106 celler per brunn i 2 mL tillväxt medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS). Inkubera cellerna för 24 h vid 37 ° C (5% CO2).
    Obs: Här, blod utväxt endothelial celler (BOECs) mellan passager 5 och 15 användes. BOECs var isolerade från friska frivilliga med en vildtyp VWF sekvens med en metod som refereras i Starke o.a. 22 på ett sätt som liknar en tidigare beskrivits av JoVE23.
  3. Ta bort mediet efter 24 h och tvätta cellerna med HBSS.
  4. Tillsätt 1 mL serumfritt medium (minimal väsentliga odlingsmedium utan FBS) innehållande phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA; 100 nM), ofraktionerat Histon (UH), och HK eller HR (alla på 25 µg/mL) till cellerna för 2 h vid 37 ° C (5% CO2).
    Obs: Denna koncentration av Histon baserades på tidigare i vitro cytotoxicitet rapporter av Xu et al. 24 och Abrams et al. 25 som används 50 µg/mL.
  5. Samla in mediet efter 2 h och lagra den på-20 ° C fram till analys.

2. VWF kvantifiering av Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

  1. Coat en mikroplattan med 100 µL av beläggning buffert (10 mM dibasiskt natriumfosfat och 145 mM natriumklorid, pH 7,2) innehållande 10 µg/mL polyklonala anti-VWF antikropp över natten vid 4 ° C.
  2. Tvätta plattan tre gånger med 250 µL tvättlösning (10 mM dibasiskt natriumfosfat, 500 mM natriumklorid och 0,1% Tween-20, pH 7,2).
  3. Späd de medelstora proverna 1:2 och 1:4 med tvättbuffert och använda normala referens plasma för en standardkurva, början på en 1:10 utspädning.
  4. Plåt 100 µL utspädda prover och standarder över natten vid 4 ° C.
  5. Tvätta plattan tre gånger med 250 µL tvättlösning.
  6. Tillsätt 100 µL utspätt anti-VWF, identifiering av HRP-konjugerad antikropp (1,1 µg/µL i tvättbuffert) till plattan och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
  7. Tvätta plattan och inkubera i 10 min med O-fenylendiamin dihydroklorid (OPD) reagens, enligt tillverkarens instruktioner.
  8. Stoppa reaktionen med 100 µL av 1 M H2så4 och Läs plattan på 492 nm.

3. fasta fasen Histon-VWF bindande Assay

  1. Coat en mikroplattan med histoner utspätt i 0,5% natrium deoxicholat 50 mM karbonat buffert (pH 9,6) till 10 µg/mL över natten vid 4 ° C.
  2. Tvätta plattan tre gånger med 250 µL av PBS kompletteras med 0,1% Tween-20, inkubation för 10 min mellan tvättarna.
  3. Blockera plattan med 200 µL av PBS kompletteras med 0,1% Tween-20 och 1% bovint serumalbumin (BSA) för 1 h i rumstemperatur.
  4. Upprepa steg 3,2.
  5. Seriellt späd plasmaderiverade mänskliga VWF/faktor VIII komplexa från 200 me/mL 25 ME/ml i saltlösning buffert (10 mM dibasiskt natriumfosfat, 500 mM natriumklorid och 0,1% Tween-20, pH 7,2). Tillsätt 100 µL till plattan för 2 h i rumstemperatur.
  6. Upprepa steg 3,2.
  7. Upptäcka bindningen av VWF till immobiliserade Histon använder 100 µL av en lösning innehållande PBS-0.1% Tween 20 och 1:1,000 kanin polyklonala anti-VWF-antikropp konjugerat till HRP för 1 h i rumstemperatur.
  8. Upprepa steg 3,2.
  9. Inkubera plattan för 30 min med 100 µL av OPD reagens och stoppa reaktionen med 100 µL av 1 M H2så4. Mät den optiska densiteten vid 492 nm.

4. sådd endotelceller på flöde Chambers

  1. Fyll på 0,5 mL av kollagen-beläggning buffert (som beskrivs i steg 2.1) i en spruta med Luer-lock i 1 mL.
  2. Twist Luer-lock slutet av sprutan på reservoaren av en bild med flödet i kammaren.
  3. Tryck kolven långsamt tills hela körfältet är belagda och varje reservoaren är full. Upprepa för varje lane och inkubera i kammaren vid 37 ° C under 24 h.
  4. Aspirera kollagen-beläggning bufferten med 200 μL pipett. Lägg en annan spruta med 1 mL HBSS och tryck kolven långsamt att tvätta varje lane flow avdelning. Aspirera tvätten med 200 μL pipett i motsatta slutet av flödet kammaren. Upprepa två gånger.
  5. Pipettera cirka 100 µL av en 3 x 106 celler/mL endotelceller (BOEC) lösning i odlingsmedium med 10% FBS i körfältet av en flöde kammare.
    Obs: Sådd tätheten av endotelceller överskrider kapaciteten för kammaren. Detta är att säkerställa maximal kanal täckning; icke-anhängare celler avlägsnas i efterföljande tvättningen.
  6. Inkubera i kammaren vid 37 ° C under 24 h. ändra mediet varje 8-12 h med Luer-lock sprutor (som i steg 4.4). Se till att det finns inga synliga bubblor i körfält.

5. isolera trombocyter från humant helblod

  1. I biologiska säkerhetsdragskåp med 30 G nål, tillsätt 300 µL av syra-citrat dextros buffert (85 mM Trinatriumcitrat, 111 mM D-glukos och 71 mM citronsyra, pH 4.5) till en tillsats-fri 3 mL blod samling vacutainer.
  2. Samla in helblod från friska frivilliga (gratis från anti blodplättar och icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel för sju dagar) genom venpunktion (tre rör med 3 mL vardera), efter ett protokoll som liknar den som publicerats av Bernardo et al26.
  3. Kassera det första röret, eftersom den ursprungliga vävnadsskada i samband med venpunktion kan orsaka spontan trombocytaktivering.
  4. Vänd försiktigt i vacutainers tre gånger för att blanda blodet med antikoagulantia.
  5. Centrifugera i vacutainers vid 150 x g i 15 min vid 24 ° C (rumstemperatur).
  6. Ta långsamt bort trombocyt-rich plasma (supernatanten) med en pipett i biologiska säkerhetsdragskåp och noggrant överföra det till en 15 mL koniska rör. Överföra trombocyt-rika volymen av varje vacutainer till ett enda koniska rör för att undvika potentiella cross-aktivering.
    Obs: Trombocyter isolering bör utföras i biologiska säkerhetsdragskåp att förhindra bakteriell kontaminering och potentiella konstgjorda trombocyter och/eller endotelceller aktivering.
  7. Centrifugera koniska rören vid 900 x g i 10 min vid 24 ° C (rumstemperatur) till pellet blodplättarna.
  8. Pipettera och kasta bort supernatanten trombocyt-fattiga.
  9. Tvätta pelleten försiktigt med 1 mL av citrat-glukos-natrium (CGS) buffert (13 mM natriumcitrat, 30 mM D-glukos och 120 mM natriumklorid, pH 7,0).
    Obs: Trombocyter kommer att visas i wisp-liknande formationer när CGS bufferten läggs och pelleten är försiktigt resuspended. I prover som förorenats av trombocytaktivering, blodplättarna kommer inte enkelt Omsuspendera och visas klumpiga.
  10. När fullt resuspended, Centrifugera proverna vid 900 x g i 10 min vid 24 ° C (rumstemperatur).
  11. Ta bort CGS tvättbufferten och återsuspendera pelleten i 3 mL Tyrodes buffert (138 mM natriumklorid, 5,5 mM D-glukos, 12 mM natriumbikarbonat, 2,9 mM kaliumklorid och 0,36 mM dibasiskt natriumfosfat, pH 7,4). Säkerställa komplett resuspension av trombocyter och, om aggregeringar observeras, Ignorera provet.
  12. Tillsätt 1,5 µL från en 20 mM DiOC6 stamlösning (lös 57,25 mg i 5 mL metanol) till varje 3 mL koniska rör av tvättade blodplättar för en slutlig koncentration på 1 µM.
    Obs: DIOC6 är en grön fluorescerande mitokondriell dye används i detta experiment till etikett trombocyter.
  13. Alikvotens 1 mL av den tvättade trombocytantal lösningen som tre 1,5 mL mikrocentrifugrör.
    Obs: Den trombocyt-volymen som krävs för detta experiment beräknas baserat på storleken på flöde kammaren, önskad skjuvspänningen och längden på experimentet (steg 6,5). Detta protokoll kan justeras eftersom förutsättningarna ändras för att säkerställa att det finns tillräckligt med volym för vätskeflöde.
  14. Använd de tvättade trombocyterna inom 2 h av isolering.

6. flöde apparater församling

  1. Fäst en 70 cm bit av sterila silikon slangar (invändig diameter 1,6 mm) till en manlig armbåge Luer connecter i ena änden och en kvinnlig Luer lock adapter i den andra.
  2. Anslut kvinnliga Luer lock adapter kopplad till slangen till en 20 mL-spruta.
  3. Upprepa steg 6.1 och 6.2 två gånger för att generera tre identiska spruta-slangkopplingarna.
  4. Använd en sprutpump för att generera vätskeflöde. Mata in följande inställningar i sprutpumpen: invändig diameter av sprutan och flödet klassar.
    Obs: En 20 mL spruta har 19.55 mm invändig diameter. Flödet beräknas baserat på önskad shear rate/skjuvspänningen och dimensioner på flöde kammaren. För flöde kammaren används i den aktuella studien, för att uppnå 1 dyn/cm2 (observerade i låg venös skjuvning), krävs en flödeshastighet 9.37 µL/min. På grund av bevis för sambandet mellan histoner till venös trombos, väljs en måttlig venös skjuvning 4.45 dyn/cm2 . Detta är också baserat på antagandet att bufferten har en liknande viskositet till vatten. Flödet är då lika med 41,7 µL/min. ekvationer används för att beräkna flödet för olika flöde kammare dimensioner kan hittas på:
    1. Ställ pumpen att återkalla vätska med alternativet knappen på sprutpumpen.
  5. Ladda de tre sprutor som bifogas slangen på sprutpumpen och tätt säkra parentes runt sprutor och kolvar.
  6. Bifoga en manlig armbågar Luer i båda ändar av ett andra 20 cm steril silikon slangar.
  7. Anslut ena armbågen Luer till en avtrubbad 18 gauge nål.
  8. Upprepa två gånger, att skapa tre identiska intagsystem för de tre körfält på flow avdelningen.
    Obs: Den silicon slangar och Luers kan tvättas med 10% blekmedel följt av destillerat vatten innan återanvändning. Det rekommenderas inte att återanvända flöde kamrarna.

7. mikroskopet inställningar

  1. Använda en snurrande bricka Mikroskop utrustad med helautomatiska steg. Utföra belysning med en laser-lansering som ger 405, 458, 491, 543 och 633 nm laserlinjer. Ta alla bilder med ett 20 X-objektiv. Justera alla parametrar med programvaran analys (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
  2. Välj kanalinställningar (utsläpp filter: 520/35), med magnetiseringen på 491 nm, för förvärvet. Ställ in elektronen att multiplicera kostnad – tillsammans enhet till en elektron-multiplicera vinst om 150, med en exponeringstid på 200 ms, för att få det fulla dynamiska dataområdet.
    Obs: Trombocyter är märkta med ett grönt fluorescerande färgämne, DiOC6, med våglängd maxima (excitation, 482 nm, emission, 504 nm).
  3. Justera 491 nm laser kraften till 20%.
  4. Markera den av alla tre körfält och välj 1 μm för z utbud och 0,5 μm för stegstorlek. Välj antalet tidpunkter (dvs, varaktighet) och tiden mellan bilder (dvs intervall) att ta en bild varje 10 s; Välj ”60 tidpunkter” per bild. Ställ mikroskopet att fånga bilder från de tre köer och spara dem till en utsedda experiment-mapp.
    Obs: Eftersom flödet kammaren har tre körfält, mikroskopet kommer att behöva växla mellan tre positioner att fånga bilder.

8. VWF-trombocyter sträng bildandet

  1. Ta bort odlingssubstratet från flödet kammaren (från steg 4) använder samma teknik som i steg 4,4.
  2. Tillsätt 100 µL av antingen histamin (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK eller HR (alla på 25 µg/mL) spädd i serumfritt medium (som i steg 1.4) för att stimulera den BOEC enskiktslager under 15 minuter vid rumstemperatur och omgivande O2tillpass2.
    Obs: Även om inte nödvändigt för VWF release, utför denna stimulering vid 37 ° C kommer att förbättra VWF exocytos27.
  3. Se till att en av tre separata körfält på flow avdelningen förbli obehandlade som en experimentell kontroll.
  4. Ta bort medlet med en 1 mL spruta och ersätta det med 100-200 µL av PBS att tvätta secretagogues bort av den endothelial enskiktslager.
  5. Montera flöde kammaren på en bild står använder vaskulär klipp för att säkra kammaren på plats.
  6. Fäst i tillgängliga manliga luerfattningen på slutet av 70 cm slangen (ansluten till sprutan) reservoaren av flöde kammaren. Upprepa för de två andra flöde kammare köer.
  7. Starta sprutpumpen för att ta bort den PBS-tvätten. Pipett ytterligare PBS i reservoaren kammaren motsatta flöde att säkerställa att köer som inte kör torrt.
  8. Observera systemets flöde för motsvarande flöde över alla tre körfält och sedan Pausa sprutpumpen.
  9. Välj ett område att fånga bilder i ungefär i mitten av varje lane, i ungefär samma område mellan experiment.
    Obs: Den person som driver mikroskopet kan förblindas experimentella villkor. Det här steget säkerställer att mikroskopet är fokuserad före trombocytantal flöde (se steg 7).
  10. Bifoga en kvinnlig luer coupler till en 5 mL spruta och sedan i gratis manliga luerfattningen (steg 6,8) och dränka trubbiga nålen i 1,5 mL mikrocentrifug röret som innehåller tvättade trombocytantal lösningen (steg 5.13). Långsamt dra trombocytantal lösningen genom slangen att se till att inga luftbubblor inom systemet.
  11. Ta bort 5 mL sprutan och fäst hanluer öppna behållaren flöde avdelning. Upprepa för de tre körfält.
  12. Starta sprutpumpen och ta bilder under trombocytantal flöde med hjälp av Mikroskop och protokoll inställningarna från steg 7 i 10 min i mörker.
  13. Efter 10 min, koppla bort Luer från intaget slangen på reservoaren kammaren flöde och fyll behållaren med PBS att upprätthålla flödet över den endothelial enskiktslager.

9. VWF-trombocyter sträng kvantifiering

Obs: Det kontinuerliga flödet av PBS är skyldig att upprätthålla VWF-trombocyter sträng förlängningen för bildanalys. Upphörande av flödet kommer att resultera i den VWF blir klotformig och kommer att försämra VWF-trombocyter sträng kvantifiering. Det är viktigt att fylla på varje behållare med PBS under Bildinsamling. HBSS kan ersätta PBS om cellen krymper eller lossnar observeras under detta steg.

  1. Börjar med den första lanen, ta 10 bilder per bild utan överlappning med en 20 X objektiv runt mitten av bilden. Upprepa detta för varje lane.
    Obs: De områden som omger reservoarerna bör undvikas på grund av turbulenta skjuvspänning.
  2. Använda programvara bildbehandling, justera ljusstyrkan genom att klicka på ”bild”, ”justera” och ”ljusstyrka/kontrast”. Dra rullningslisten tills de klibbade trombocyterna kan ses tillräckligt bra för kvantifiering.
  3. Spela in en VWF-trombocyter sträng när tre eller fler anpassade trombocyter observeras i bilden. Räkna alla VWF-trombocyter strängar i en bild. Upprepa för alla 10 bilder och genomsnitt för experimentet.
    Obs: Den person som utför kvantifiering kan förblindas experimentella villkor. Det är inte nödvändigt att samtidig färga för VWF, eftersom detta har bekräftats av oberoende studier8,28,29.
  4. Upprepa experimentet minst tre gånger att utvärdera varje insulinsekretagog.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att direkt bedöma effekten av histoner på VWF release från endotelceller, utsätts vi konfluenta BOECs till serumfritt medium innehållande PMA (positiv kontroll), UH, HR och HK för 2 h. Vi visade att HK inducerade en 2-faldig ökning av VWF protein (VWF:Ag) i medlet av behandlade endotelceller (figur 1). Intressant, när BOECs stimuleras med UH och HR, upptäcktes det mindre VWF:Ag på medellång än i obehandlat skick. Vi hade en hypotes att eftersom Histonerna kan binda direkt till VWF30, de differentially kan störa VWF:Ag upptäckt i odlingssubstratet. Utvärdera Histon bindning till VWF, använde vi en fasta fasen bindande assay. Vi visade att UH och HR bunden starkare till VWF än HK (figur 2), stödja upptäcka störningen visat i figur 1.

Extracellulära Histonerna visat sig aktivera trombocyter i vitro19, och våra data tyder på att Histonerna medla VWF release från endotelceller. För att karakterisera effekten av histoner på VWF-trombocyter interaktioner, använde vi en modell för kammaren av flödet av VWF-trombocyter sträng bildas där märkta trombocyter var perfusion på stimuleras endotelceller. Representativa bilder var tagna efter flöde, och antalet VWF-trombocyter strängar kvantifierades.

Vi observerade att obehandlad celler efter inledandet av flödesförhållanden, hade mycket få VWF-trombocyter strängar (< 1 sträng per recension fält), medan histamin och PMA-behandlade celler hade ett genomsnitt på 2.10 och 3.10 strängar, respektive. Betydligt mer VWF-trombocyter strängar bildades när celler behandlades med HK (3.52 strängar, P = 0,019), HR (6.00 strängar, P = 0,004), och UH (5.51 strängar, P = 0,012). En grafisk representation av VWF-trombocytantalet sträng visas i figur 3 g. Realtid VWF-trombocyter sträng bildas som svar på UH jämfört med obehandlade celler visas i videor 1A och B.

Dessa studier, tillsammans med utredningar av andra grupper, visar att Histonerna28 och andra proinflammatoriska ämnen såsom histamin5 och cytokiner31 stimulera VWF-sekretion från endotelceller, medla efterföljande trombocytantal fånga in vitro. Vi visat att statiska stimulering av endothelial celler inte var tillräcklig för att belysa VWF release på grund av histoner att binda och binda VWF förmåga. Utformningen av en modell för flödet av kammaren av VWF release och blodplättar vidhäftning var således skyldig att mer fullständigt karakterisera och modell i vivo interaktioner mellan endotelet, VWF och trombocyter.

Figure 1
Figur 1: lysin-rika histoner inducerar VWF Release från odlade endotelceller. BOECs stimuleras med ofraktionerat Histon (UH), lysin-rika (HK) och arginin-rika (HR) Histon fraktioner. HK stimuleras VWF utsättning i odlingssubstratet. UH och HR behandling minskade påvisande av VWF:Ag i endotelceller medium i förhållande till kontrollgrupp (Untr). N ≥ 3 individuella experimenten utfördes. Uppgifterna presenteras som den medelvärden ± SE. *P < 0,05, **P < 0,01, och ***P < 0,001 ange betydelse i förhållande till obehandlat skick. Denna siffra har ändrats från Michels et al15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: VWF-histonglykoprotein bindande stör VWF upptäckt In Vitro. Plasmaderiverade VWF binder starkare till HR och UH på ett dosberoende sätt jämfört med lysin-rika (HK) histoner i en fasta fasen bindande-analys. Data visas som den medelvärden ± SE. N≥3 individuella experimenten utfördes. Denna siffra har ändrats från Michels et al15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: histoner medla VWF-trombocyter sträng bildandet. Endotelceller seedade på flow avdelningen bilder behandlades med ofraktionerat Histon (UH), lysin-rika (HK), eller arginin-rika (HR) Histon fraktioner eller histamin och PMA (positiva kontroller) och var perfusion vid en skjuvspänning 4.45 dyn/cm2 för 10 min med tvättade, fluorescently märkt trombocyter. Representativa bilder erhölls efter trombocyt flöde från kontrollgrupp (A) och celler behandlas med histamin (B), Phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) (C), HK (D), HR (E) och UH (F). PMA behandling resulterade i genomsnitt 3,1 strängar per synfält, jämförbar med histamin. VWF-trombocyter strängar var kvantifieras från 10 på varandra följande granskning fält och i genomsnitt för n≥3 individuella experiment (G). Uppgifterna presenteras som den medelvärden ± SE. * P < 0,05 och ** P < 0,01 ange betydelse i förhållande till obehandlat skick. Denna siffra har ändrats från Michels et al15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande videor. VWF-trombocyter sträng bildandet svar med ofraktionerat Histon (2) jämförelse med nr behandling (1): denna video har ändrats från Michels et al15. Vänligen klicka här för att ladda ner dessa videor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Medan den fysiologiska betydelsen av VWF-trombocyter strängar förblir kontroversiell på grund av deras snabb upplösning i närvaro av den VWF-klyva proteasen ADAMTS13, tjänar de som kvantifierbara in vitro- modell av trombocyter rekrytering av VWF till en webbplats på som en tromb kan bilda i närvaro av lokaliserade ökar i Histon nivåer5. Dessutom i patologier saknar ADAMTS13 aktivitet-sådan som trombotisk trombocytopen purpura (TTP) - eller i inflammatoriska mikromiljö - där ADAMTS13-aktivitet är inhiberad-VWF-trombocyter strängar kan observeras i vivo32 och kan bidra till trombocytantal microaggregation och leukocyt extravasering, länka funktionerna hemostatiska och proinflammatoriska VWF33. Slutligen, det har varit en hypotes om det VWF-trombocyter sträng bildandet kan vara en primärhändelse i venös eller arteriell trombos, bildar den nidus runt som en patologisk tromb är byggd.

VWF-trombocyter sträng bildas i flödet kammare systemet kan användas för att studera WPB exocytos, ADAMTS13 klyvning och VWF trombocyter bindande kapacitet. I området i närheten finns det flera kritiska steg för att framgångsrikt genomföra dessa experiment. Beroende på tillämpningen av modellen, kan dock ändringar göras i protokollet.

Endotelceller från specifika kärlbäddar är heterogena i deras svar på mekaniska och biokemiska signaler34. Det kan därför vara lämpligt att välja en celltyp som är lämplig för tillämpningen av denna metod. BOECs användes i den aktuella studien på grund av sin proliferativa potential. underhåll av fenotyp över flera (10 +) passager; och robust VWF uttryck, att underlätta kvantifiering av VWF exocytos. Andra utredare har använt mänskliga umbilical ven endothelial celler (HUVECs)5,8,28 och icke-endothelial celler (mänskliga embryonala 293 njurceller) transfekterade med VWF cDNAs uttrycker VWD mutationer35 . Det har visats att VWF uttryck varierar betydligt mellan vävnad och fartyget fysiologi36. Odlade endothelial celler uppkommer olika mikro- och macrovasculature har observerbara skillnader i VWF protein basal sekretion37, och det finns bevis att kalcium kanal skillnader mellan endotelceller subtyper påverka WPB exocytos svar på secretagogues38.

Histoner användes i denna studie som en roman insulinsekretagog. De jämfördes med den positiva kontrollen, histamin, en ofta beskrivs fysiologiska stimulerande av VWF release. En VWF:Ag ELISA användes för att kontrollera VWF release från endotelceller under statiska förhållanden. Det finns två intracellulära mekanismer som frisätter VWF: förhöjning av intracellulära kalcium39 eller pf cykliskt AMP nivåer40. Differentiell aktivering av dessa vägar kan vara inducerad av secretagogues såsom trombin/histamin eller epinefrin/vasopressin (eller relevanta för VWD, desmopressin), respektive, och det kan vara intressant att jämföra dessa två vägar med hjälp av detta flöde modell av VWF-trombocyter sträng bildas. I samband med thrombo-inflammatorisk sjukdom uppmuntras ytterligare klargörande av inflammatoriska biomarkörer, såsom cytokiner41 eller skada/patogen-associerade molekylära mönster (dämpar/PAMPS), och deras roller i VWF-trombocyter sträng formation.

Vätska skjuvspänningen är viktigt när klotformiga VWF utspelar sig för att exponera A1 domän bindningsstället för glykoprotein Ib på trombocyter11. Det har visats att det krävs en minsta vätska skjuvspänningen ca 0,73 dyn/cm2 för trombocyter bindning till VWF strängar42. Dessutom bildar dessa strängar på endotelceller på relativt låg skjuvspänningar (2,5 dyn/cm2) men kan rubbas på skjuvspänningar 20 dyn/cm2 eller över8. I den nuvarande undersökningen valde vi en venös skjuvspänning (4.45 dyn/cm2) som tillåts för interaktioner mellan endotelet, VWF och trombocyter samtidigt bevara perfusion bufferten för en 10 min experiment.

Använda detta flöde kammaresystem för att utvärdera ADAMTS13 klyvning av VWF-trombocyter strängar kräver en ökning av de fluidic skjuvspänningar över dem som används i detta experiment. Maximal ADAMTS13 klyvning av VWF-trombocyter strängar sker mellan 10 och 30 dyn/cm212, ett sortiment som omfattar hög venös måttlig arteriell skjuvspänningen43. Ändra den skjuvning kursen i detta system kan vara användbara för att jämföra VWF-trombocyter sträng bildande och upplösning, bidragande faktorer i utvecklingen av venös, arteriell eller mikrovaskulära trombos.

Ytterligare ändringar av denna teknik kan göras till perfusion material och flöde kammare. Secretagogues kan administreras under flödesförhållanden likna i vivo miljöer. Grundning blodplättar med agonister att utvärdera deras reaktivitet eller inklusive leukocyt populationer är förlängningar av denna teknik. Dessutom kan inklusive terapeutiska medel inriktning VWF multimer längd, trombocyter bindande kapacitet eller trombocytantal reaktivitet belysa viktiga mekanismer som reglerar inledandet av tromb utveckling. Andra utredare har används antingen in-house44 eller köpt täckglas flöde chambers45, i motsats till polymerbaserade bilderna används i denna studie, och verkar få jämförbara resultat.

En kritisk fråga i protokollet VWF-trombocyter sträng är utarbetandet av tvättade trombocyter. Det rekommenderas inte att använda helblod i detta protokoll på grund av ADAMTS13. Ombud att förhindra trombocytaktivering, såsom prostacyklin eller apyrase, bör undvikas, eftersom detta kan senare negativt påverka blodplättar vidhäftning till VWF. Säkerställa att buffertarna förs till rumstemperatur innan trombocytantal isolering och med försiktig pipett tekniker (dvs undvika bubblor och hårda skjuvspänningar) är nyckeln till att upprätthålla blodplättarna i sin inaktiva. Dessutom är märkning blodplättar med en mitokondriell fläck, såsom DIOC6 eller rodamin 6 G, att föredra framför störa extracellulära domäner som kan vara viktiga för VWF bindande. Men eftersom DIOC6 är ett membran-permeable färgämne, kan det också tas i små mängder av endotelceller under loppet av experimentet. I avsaknad av ett fluorescerande Mikroskop, har andra studier observerat VWF-trombocyter strängar med ljusa fält mikroskopi46.

Avslutningsvis kan detta flöde kammare metodik av VWF-trombocyter sträng bildas ge mekanistisk, realtid data för att stödja i vivo observationer i patogenesen av trombos. Som exponering för skeva starkt påverkar den patofysiologiska roll som VWF spelar i thrombo-inflammatorisk sjukdom, är modellen för flödet av kammaren ett viktigt undersökande verktyg för alla intresserade av att förstå endothelial cellen-trombocyter interaktioner i denna lab sammanhang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Alison Michels är mottagare av en Frederick Banting och Charles Best Kanada Graduate stipendium från den kanadensiska institut för hälsa forskning (CIHR). Laura L. Swystun är mottagaren en CIHR gemenskap. David Lillicrap är mottagare av en Kanada forskning stol i molekylär hemostas. Denna studie finansierades delvis av en CIHR löpande grant (MOP-97849).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calf-thymus unfractionated histones (UH) Worthington Biochemical HLY Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK) Sigma-Aldrich H5505 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR) Sigma-Aldrich H4830 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine Sigma-Aldrich H7125-1G Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) Invitrogen D273 Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating Antibody DAKO A0082 For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated DAKO P0026 For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates eBioscience 44-2404-21 For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates Thermo Scientific 3855 For VWF ELISA
Humate-P CSL Behring N/A Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference Plasma Precision BioLogic CCNRP-05 For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent Sigma-Aldrich P8287 Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092
Rat-tail Collagen Type 1 Corning 354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher Scientific 31985070 For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software Molecular Devices N/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive BD Biosciences 366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers) Ibidi This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized Ibidi 10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized Ibidi 10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized Ibidi 10802
Blunted 18G Needle BD Biosciences 305180
20 mL syringes BD Biosciences 302830
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope Quorum Technologies N/A
Image Processing Software ImageJ N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, aB., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Tags

Medicin fråga 126 von Willebrand-faktor trombocyter endotelceller flöde kammare histoner Weibel-Palade organ skjuvspänning trombos.
Utreda von Willebrand faktor patofysiologi använder en modell för flödet av avdelningen av von Willebrands faktor-trombocyter sträng bildandet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michels, A., Swystun, L. L.,… More

Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. J. Vis. Exp. (126), e55917, doi:10.3791/55917 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter