Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Undersøge von Willebrands faktor Patofysiologi bruger en Flow kammer Model af von Willebrand faktor-trombocyttal streng dannelse

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/55917
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Department of Medicine, Queen's University

Summary

I dette papir, vi beskriver en metode til at vurdere endotel von Willebrands faktor frigivelse og den efterfølgende trombocyt fange under væske shear stress reaktion på inflammatoriske stimuli ved hjælp af en in vitro- flow kammer system.

Abstract

Von Willebrands faktor (VWF) er en multimeriske glycoprotein koagulationsfaktor der medierer trombocyt adhæsion og aggregation på websteder i endothelial skader og der bærer faktor VIII i omløb. VWF er syntetiseret af endothelceller og frigives enten constitutively i plasma eller er lagret i specialiserede organelles, kaldet Weibel-Palade organer (WPBs), for on demand release svar på hæmostatisk udfordring. Prokoagulant og proinflammatoriske stimuli kan hurtigt inducerer WPB exocytose og VWF frigivelse. Fleste af VWF udgivet af endothelceller cirkulerer i plasma; dog er en del af VWF forankret i endothelial celleoverfladen. Betingelser for fysiologiske shear kan endotel-forankrede VWF binde til blodplader, danner en VWF-trombocyttal streng, der kan repræsentere nidus af blodprop dannelse. En flow kammer system kan bruges til visuelt observere frigivelsen af VWF fra endotelceller og den efterfølgende trombocyt fange på en måde, der er reproducerbare og relevante for Patofysiologi af VWF-medieret blodprop dannelse. Brug denne metode, endotelceller er kulturperler i et flow kammer og er efterfølgende stimuleret med secretagogues til at fremkalde WPB exocytose. Vasket blodplader er derefter perfunderet over aktiverede endotelet. Blodpladerne er aktiveret og derefter binde til aflange VWF strygere i retning af flydende flow. Ved hjælp af ekstracellulære histoner som en prokoagulant og proinflammatoriske stimulus, observeret vi øget VWF-trombocyttal streng dannelse på Histon-behandlede endotelceller sammenlignet med ubehandlet endotelceller. Denne protokol beskriver en kvantitativ, visuelle og real-time vurdering af aktivering af VWF-trombocyttal interaktioner i modeller for trombose og hæmostase.

Introduction

Trombose er en førende årsag til dødelighed på verdensplan1 og kan udvikle sig i svar todysregulated trombocyt aktivering og thrombin generation i begge veinsand arterier. Plasmaniveauer af VWF er et centralt regulator af blodets koagulation, hvorved lave niveauer (< 50%) resultere i blødningsforstyrrelse kendt som von Willebrands sygdom (VWD)2 og høje niveauer (> 150%) er forbundet med en øget risiko for venøs3 og arteriel4 trombose.

VWF er en multimeriske glycoprotein syntetiseret af megakaryocytes og endotelceller og gemt i trombocyttal α-granulat og WPBs, henholdsvis. Ved hæmostatisk udfordring, kan VWF frigøres fra endotel WPBs hen til tether cirkulerende blodplader aktiveret endotelceller5 eller eksponerede kollagen på fartøjet væg6. Forankring af VWF i endothelial celler har vist sig at være medieret af P-selectin7 og integrin αvβ38. Den efterfølgende frigivelse af trombocyt α-granul butikker kan yderligere øge lokaliserede VWF koncentrationer for at stabilisere trombocyt-trombocyttal interaktioner for trombocyttal stikket dannelse, skafottet nødvendige for opformering af koagulationskaskaden og fibrin deposition. Trombocyt-bindende aktivitet af VWF er reguleret ved sin multimeriske struktur, med høj-Molekylær vægt multimerer besidder større hæmostatisk aktivitet9,10. I omløb fungerer VWF også som en transportør for koagulation faktor VIII.

Flydende shear stress er en væsentlig regulator af VWF fysiologi. I mangel af shear stress findes VWF i kugleformede form, skjuler bindende domæner for trombocyt glycoprotein Ib vedhæftning11. Når shear stress er til stede, er kavalergang site for en metalloprotease, en disintegrin og metalloprotease med thrombospondin motiv (ADAMTS13), udsat. ADAMTS13 kløver nøgen og trombocyttal-dekoreret VWF strygere for at regulere multimer størrelse, hvorved dens hæmostatisk aktivitet12.

VWF er en akut-fase proteiner, og mange stimuli, herunder hypoxi13, infektion14og proinflammatoriske cytokiner, har vist sig at mægle VWF frigivelse fra endotelceller. Ligner andre inflammatoriske agenter, ekstracellulære histoner har også vist sig at fremkalde systemisk VWF udgivelse i mus15,16 og aktivering af trombocytter i vitro17,18, 19. det viste sig at være afhængig af Histon subtype, som forskelle i Lysin og arginin indhold kan påvirke funktion15. Vores undersøgelse har til formål at etablere et flow kammer model for at undersøge indflydelsen af lysin-rige (HK) og argininog-rige (HR) Histon undertyper og secretagogues på endotel VWF udgivelse og real-time trombocyt fange, potentielle tidlige begivenheder i betændelse-induceret trombose.

Dette flow kammer metode sammenfatter i vivo interaktioner mellem subendothelial kollagen, endotelceller, VWF og blodplader i en in vitro- system, der er visuel, reproducerbare og kvantificerbare. Det giver mulighed for real-time vurdering af alle aspekter af den vej, der regulerer VWF-trombocyttal interaktioner, herunder WPB sekretion, trombocyt aktivering og VWF proteolyse. Undersøgelser af VWF kontrolleret shear stress betingelser har været brugt til at evaluere VWD mutationer, der forringer VWF frigivelse og trombocyttal-bindende funktion20, WPB fysiologi21, VWF spaltning af ADAMTS135. Vi bruger denne metode til at kvantificere VWF-trombocyttal streng dannelse som følge af en inflammatorisk stimulus: ekstracellulære histoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Disse undersøgelser blev godkendt af forskning etik bord på Queen's University, Canada.

1. endotel celle Stimulation

  1. Kollagen-coat en 6-godt vævskultur plade.
    1. 24 timer i forvejen, pels 6-godt vævskultur plade ved 37 ° C med 1 mL af kollagen buffer (50 µg/mL rotte hale kollagen type 1 med 0,02 M iseddike).
    2. Brøndene vaskes to gange med 2 mL af Hank's Balanced Salt løsning (HBSS).
      Bemærk: Plader kan være pakket ind i sølvpapir og opbevares i en lufttæt plasticpose ved 4 ° C.
  2. Frø i endothelial celler med en tæthed på 1 x 106 celler pr. brønd i 2 mL af vækst medium indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS). Inkuber celler i 24 timer ved 37 ° C (5% CO2).
    Bemærk: Her, blod udvækst endothelial celler (BOECs) mellem passager 5 og 15 blev brugt. BOECs blev isoleret fra raske frivillige med en vildtype VWF rækkefølge ved hjælp af en metode, der henvises til i Starke et al. 22 i en måde, der svarer til en tidligere beskrevet af JoVE23.
  3. Fjern mediet efter 24 h, og cellerne vaskes med HBSS.
  4. Der tilsættes 1 mL af serumfrit medium (minimal væsentlige vækstmediet uden FBS) indeholdende phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA; 100 nM), ufraktionerede Histon (UH), og HK eller HR (alle på 25 µg/mL) til cellerne i 2 timer ved 37 ° C (5% CO2).
    Bemærk: Denne koncentration af Histon var baseret på tidligere i vitro celletoksicitet rapporter af Xu et al. 24 og Abrams mfl. 25 , bruges 50 µg/mL.
  5. Indsamle medium efter 2 h og opbevar den ved-20 ° C indtil analyse.

2. VWF kvantificering af enzym-forbundet Immunosorbent Assay (ELISA)

  1. Coat en mikrotiterplade med 100 µL af belægning buffer (10 mM dibasiske natrium fosfat og 145 mM natriumchlorid, pH 7,2) indeholdende 10 µg/mL polyklonale anti-VWF antistof natten over ved 4 ° C.
  2. Vaske pladen tre gange med 250 µL af vaskebuffer (10 mM dibasiske natriumfosfat, 500 mM natriumchlorid og 0,1% Tween 20, pH 7,2).
  3. Fortynd de medium prøver 1:2 og 1:4 med wash buffer og bruge normal reference plasma for en standardkurve, begynder på en 1:10 fortynding.
  4. Plade 100 µL fortyndede prøver og standarder natten over ved 4 ° C.
  5. Vask pladen tre gange med 250 µL af wash buffer.
  6. Tilsæt 100 µL fortyndede anti-VWF, HRP-konjugerede detektor-antistof (1,1 µg/µL i wash buffer) til pladen og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
  7. Vaske pladen og inkuberes i 10 min med O-phenylendiamin dihydrochlorid (OPD) reagens, ifølge producentens anvisninger.
  8. Stop reaktion med 100 µL 1 M H2så4 og Læs plade ved 492 nm.

3. fast-fase Histon-VWF bindende Assay

  1. Coat en mikrotiterplade med histoner fortyndet i 0,5% natrium deoxycholate 50 mM karbonat buffer (pH 9,6) til 10 µg/mL natten over ved 4 ° C.
  2. Vaske pladen tre gange med 250 µL af PBS suppleret med 0,1% Tween 20, inkubere i 10 min. mellem vasker.
  3. Blokere pladen med 200 µL af PBS suppleret med 0,1% Tween 20 og 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time ved stuetemperatur.
  4. Gentag trin 3.2.
  5. Seriefremstillede fortyndes plasmaafledte menneskelige VWF/faktor VIII komplekse fra 200 mU/mL 25 mU/ml i saltvand buffer (10 mM dibasiske natrium fosfat, 500 mM natriumchlorid og 0,1% Tween 20, pH 7,2). Tilsæt 100 µL til pladen i 2 timer ved stuetemperatur.
  6. Gentag trin 3.2.
  7. Opdage bindingen af VWF til immobiliseret Histon bruger 100 µL af en oploesning indeholdende PBS-0.1% Tween 20 og 1:1,000 kanin polyklonale anti-VWF antistof konjugeret med HRP i 1 time ved stuetemperatur.
  8. Gentag trin 3.2.
  9. Inkuber pladen i 30 min med 100 µL OPD reagens og stoppe reaktion med 100 µL 1 M H2så4. Måle det optiske densitet ved 492 nm.

4. såning endotelceller på Flow kamre

  1. Indlæse 0,5 mL af kollagen-coatingbuffer (beskrevet i trin 2.1) i en Luer-lock 1-mL sprøjte.
  2. Twist Luer-lock slutningen af sprøjten på reservoir af et flow kammer dias.
  3. Tryk på stemplet langsomt, indtil den hele lane er belagt og hver reservoir er fuld. Gentag for hver lane og Inkuber i salen ved 37 ° C i 24 timer.
  4. Opsug den kollagen coatingbuffer med 200 μl pipette. Indlæse en anden sprøjte med 1 mL HBSS og tryk stemplet langsomt til at vaske hver lane flow kammer. Opsug vask med en 200 μl pipette modsatrettede ultimo flow kammer. Gentag to gange.
  5. Med pipette udtages cirka 100 µL af en 3 x 106 celler/mL endothelial celler (BOEC) løsning i vækstmediet med 10% FBS i lane et flow kammer.
    Bemærk: Seeding tætheden i endothelial celler overstiger kapaciteten af salen. Dette er for at sikre maksimal kanal dækning; ikke-tilhænger celler er fjernet i den efterfølgende vask trin.
  6. Inkuber i salen ved 37 ° C i 24 h. ændring medium hver 8-12 h bruger Luer-lock sprøjter (som i trin 4.4). Sikre, at der er ingen synlige bobler i banerne.

5. isolering af trombocytter fra humant fuldblod

  1. I en biologisk sikkerhed kabinet med en 30 G kanyle, tilføje 300 µL af citrat syre dextrose buffer (85 mM Trinatriumcitrat, 111 mM D-glucose og 71 mM citronsyre, pH 4.5) til et tilsætningsstof-fri 3 mL blod samling vacutainer.
  2. Indsamle fuldblod fra raske frivillige (gratis fra anti-trombocyttal og non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler for syv dage) af venepunktur (tre rør af 3 mL hver), efter en protokol, der er lig den, udgivet af Bernardo mfl26.
  3. Kassér den første rør, som den oprindelige vævsskader forbundet med venepunktur kan forårsage spontan trombocyt aktivering.
  4. Forsigtigt vendes i vacutainere tre gange for at blande blod med antikoagulans.
  5. Der centrifugeres vacutainere ved 150 x g i 15 min. ved 24 ° C (stuetemperatur).
  6. Langsomt fjerne trombocyt-rich plasma (supernatanten) med en pipette i en biologisk sikkerhed kabinet og omhyggeligt overføre det til en 15 mL konisk slange. Overføre trombocyt-rige volumen af hver vacutainer til en enkelt koniske rør til at undgå potentielle cross-aktivering.
    Bemærk: Trombocyt isolation bør udføres i en biologisk sikkerhed kabinet at forhindre bakteriel forurening og potentielle kunstige trombocyttal og/eller endotel aktivering.
  7. Der centrifugeres de koniske rør ved 900 x g i 10 min. ved 24 ° C (stuetemperatur) til pellet blodpladerne.
  8. Der afpipetteres og supernatanten trombocyt-fattige.
  9. Vask pellet omhyggeligt med 1 mL af citrat-glucose-natrium (CGS) buffer (13 mM natriumcitrat, 30 mM D-glucose og 120 mM natriumchlorid, pH 7,0).
    Bemærk: Blodpladerne vises i wisp-lignende formationer, når CGS buffer er tilføjet og pellet er forsigtigt genopslemmes. I prøver forurenes af trombocyt aktivering, trombocytterne vil ikke let resuspend og vises clumpy.
  10. Når fuldt genopslemmes, centrifugeres prøver ved 900 x g i 10 min. ved 24 ° C (stuetemperatur).
  11. Fjerne CGS wash buffer og resuspenderes i 3 mL af Tyrode's buffer (138 mM natriumchlorid, 5,5 mM D-glucose, 12 mM natriumbikarbonat, 2,9 mM kaliumchlorid og 0,36 mM dibasiske natriumfosfat, pH 7,4). Sikre fuldstændig ophvirvling af trombocytterne og hvis sammenlægninger er observeret, kassere prøven.
  12. Tilføj 1,5 µL fra en 20 mM DiOC6 stamopløsning (opløses 57.25 mg i 5 mL methanol) til hver 3 mL konisk slange af vasket blodplader til en endelig koncentration på 1 µM.
    Bemærk: DIOC6 er en grøn fluorescerende mitokondrie farvestof anvendes i dette eksperiment at etiketten blodplader.
  13. Alikvot 1 mL af vasket trombocyt løsningen til tre 1,5 mL microcentrifuge rør.
    Bemærk: Trombocyt volumen kræves for dette eksperiment er beregnes baseret på størrelsen af flow kammer, den ønskede shear stress og længden af eksperiment (skridt 6,5). Denne protokol kan justeres som forholdene ændrer for at sikre, at der er nok volumen for flydende flow.
  14. Bruge de vasket blodplader i 2 h af isolation.

6. flow apparater forsamling

  1. Vedhæfte en 70 cm stykke sterilt silikone slanger (indvendig diameter på 1,6 mm) til en mandlig albue Luer connecter i den ene ende og en kvindelig Luer lock adapter på den anden.
  2. Tilslut den kvindelige Luer lock adapter knyttet til slangen til en 20 mL sprøjte.
  3. Gentag trin 6.1 og 6.2 to gange for at generere tre identiske sprøjte-slange-forbindelser.
  4. Bruge en sprøjte pumpe til at generere væske flow. De følgende indstillinger i sprøjten pumpe: indvendige diameter af den sprøjte og flow hastighed.
    Bemærk: En 20-mL sprøjte har en indvendig diameter på 19.55 mm. Strømningshastigheden er beregnes baseret på ønskede shear rate/shear stress og dimensioner af flow kammer. For flow salen bruges i den aktuelle undersøgelse, for at opnå 1 dyn/cm2 (observerede i lav venøs shear), kræves en gennemstrømningshastighed på 9.37 µL/min. På grund af beviser, der forbinder histoner til venøs trombose, vælges en moderat venøs shear 4.45 dyn/cm2 . Dette er også baseret på den antagelse, at bufferen har en lignende viskositet vand. Strømningshastigheden svarer derefter til 41.7 µL/min. ligninger bruges til at beregne strømningshastigheden for forskellige flow kammer dimensioner kan findes på:
    1. Indstil pumpen til at trække væske ved hjælp af indstillingen knap på sprøjten pumpe.
  5. Indlæs tre sprøjter knyttet til slanger på sprøjten pumpe og sikre stramt kantede parenteser omkring sprøjter og udstikkere.
  6. Vedhæfte en mandlig albue Luer til begge ender af en anden 20 cm stykke sterilt silikoneslanger.
  7. Tilsluttes en afrundede 18-gauge kanyle én albue Luer.
  8. Gentag to gange, at skabe tre identiske indtag systemer for de tre baner af flow kammer.
    Bemærk: Silikone slanger og Luers kan vaskes med 10% blegemiddel efterfulgt af destilleret vand før genbrug. Det anbefales ikke at genbruge flow kamre.

7. mikroskop indstillinger

  1. Bruge en roterende disk mikroskop udstyret med en fuldt automatiseret fase. Udføre belysning med en laser lancering, der giver 405, 458, 491, 543 og 633 nm laser linjer. Fange alle billeder med en 20 X mål. Justere alle parametre med analyse software (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
  2. Vælg indstillingerne for kanal (emission filter: 520/35), med excitation på 491 nm, for erhvervelse. Indstil elektron at multiplicere charge - sammen enhed til en elektron-multiplikation gevinst på 150, med en eksponeringstid på 200 ms, for at få den fulde dynamiske dataområde.
    Bemærk: Blodplader er mærket med et grønt fluorescerende farvestof, DiOC6, med bølgelængde maxima (excitation, 482 nm; emission, 504 nm).
  3. Justere de 491 nm laser power til 20%.
  4. Markere centrum af alle tre baner og vælg 1 μm for z rækkevidde og 0,5 μm til trin størrelse. Vælg antallet tid point (dvs. varighed) og tiden mellem billeder (dvs. interval) til at fange et billede hver 10 s; Vælg "60 tid point" pr dias. Sæt mikroskop til at fange billeder fra de tre baner og gemme dem til en mappe, udpegede eksperiment.
    Bemærk: Fordi flow kammer har tre baner, skal mikroskop til at skifte mellem tre holdninger til at fange billederne.

8. VWF-trombocyttal streng dannelse

  1. Fjerne næringssubstratet fra flow kammer (fra trin 4) ved hjælp af samme teknik som i trin 4.4.
  2. Tilsæt 100 µL af enten histamin (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK eller HR (alle på 25 µg/mL) fortyndet i serumfrit medium (som i trin 1.4) for at stimulere BOEC éncellelag i 15 min. ved stuetemperatur og omgivende O2/CO2.
    Bemærk: Selvom ikke nødvendigt for VWF frigivelse, udfører denne stimulation ved 37 ° C vil forbedre VWF exocytose27.
  3. Sikre, at en af tre separate baner af flow kammer forblive ubehandlet som en eksperimentel kontrol.
  4. Fjern mediet ved hjælp af en 1 mL sprøjte og erstatte det med 100-200 µL af PBS til at vaske secretagogues af i endothelial éncellelag.
  5. Montere flow salen på dias stilling ved hjælp af vaskulære clips til at sikre kammer på plads.
  6. Vedhæfte den tilgængelige mandlige Luer stik for enden af 70 cm slange (tilsluttet sprøjten) til reservoir af flow kammer. Gentag for de to andre flow kammer baner.
  7. Start sprøjten pumpe for at fjerne PBS vask. Pipette yderligere PBS i den modsatte flow kammer reservoir til at sikre, at banerne ikke køre tør.
  8. Observere flow system for tilsvarende flow på tværs af alle tre baner og så pause sprøjten pumpe.
  9. Vælg et område at fange billeder i omkring midten af hver lane, i nogenlunde samme område mellem eksperimenter.
    Bemærk: Den person, der driver mikroskopet kan være blændet at de eksperimentelle betingelser. Dette trin sikrer, at mikroskopet er fokuseret inden trombocyt flow (Se trin 7).
  10. Vedhæfte en kvindelig luer kobling en 5 mL sprøjte og derefter gratis mandlige luer stik (trin 6.8) og dykke afrundede nålen i 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende vasket trombocyt løsning (trin 5.13). Langsomt trække trombocyt løsning gennem slangen til at sikre, at ingen luftbobler i systemet.
  11. Fjern 5 mL sprøjte og vedhæfte den mandlige Luer til den åbne reservoir af flow kammer. Gentag for de tre baner.
  12. Genstart sprøjten pumpe og fange billeder under trombocyt flow ved hjælp af indstillingerne mikroskop og protokollen fra trin 7 for 10 min. i mørke.
  13. Efter 10 min, afbryde Luer fra indtag slangen på flow kammer reservoir og fylde beholderen med PBS opretholde strømmen over i endothelial éncellelag.

9. VWF-trombocyttal streng kvantificering

Bemærk: En kontinuerlig strøm af PBS er forpligtet til at opretholde VWF-trombocyttal streng brudforlængelse til billedanalyse. Ophør af flow vil resultere i VWF bliver kugleformede og vil forringe VWF-trombocyttal streng kvantificering. Det er vigtigt at top op hver reservoir med PBS under billedoptagelse. HBSS kan erstatte PBS, hvis cellen faldende eller udstationering er iagttaget under dette trin.

  1. Begyndende med den første lane, fange 10 billeder pr. dias uden overlapning ved hjælp af en 20 X mål linse omkring midten af diaset. Gentag dette for hver lane.
    Bemærk: Områderne omkring reservoirer bør undgås på grund af turbulente shear stress.
  2. Ved hjælp af billedbehandlingsprogram, justere lysstyrken ved at klikke på "Billede," "Justering" og "Lysstyrke/kontrast." Træk rullepanelet, indtil de overholdt blodplader kan ses godt nok for kvantificering.
  3. Optage en VWF-trombocyttal strengen, når tre eller flere justerede blodplader er observeret i billedet. Tælle alle VWF-trombocyttal strengene i et billede. Gentag for alle 10 billeder og i gennemsnit for eksperimentet.
    Bemærk: Den person, der udfører kvantificering kan være blændet at de eksperimentelle betingelser. Det er ikke nødvendigt at co pletten for VWF, som dette er blevet bekræftet af uafhængige undersøgelser8,28,29.
  4. Gentage forsøget minimum tre gange til at evaluere hvert secretagogue.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at direkte vurdere effekten af histonerne på VWF frigivelse fra endotelceller, udsættes vi sammenflydende BOECs til serumfrit medium indeholdende PMA (positiv kontrol), UH, HR og HK for 2 h. Vi viste, at HK induceret en 2-fold stigning i VWF protein (VWF:Ag) i medium af behandlede endotelceller (figur 1). Interessant, da BOECs blev stimuleret med UH og HR, blev der mindre VWF:Ag registreret i medium end i ubehandlet tilstand. Vi antager, at fordi histonerne kan binde direkte til VWF30, de varierende kan forstyrre VWF:Ag påvisning i dyrkningsmediet. For at evaluere Histon binding til VWF, brugte vi en solid-fase bindende assay. Vi viste, at UH og HR bundet mere kraftigt til VWF end HK (figur 2), støtte påvisning indgreb vist i figur 1.

Ekstracellulære histoner har vist sig at aktivere blodplader in vitro-19, og vores data tyder på, at histoner mægle VWF frigivelse fra endotelceller. For at karakterisere effekten af histonerne på VWF-trombocyttal interaktioner, brugte vi et flow kammer model af VWF-trombocyttal streng dannelse, hvor mærket blodplader var perfunderet på stimuleret endotelceller. Repræsentative billeder blev fanget efter flow, og antallet af VWF-trombocyttal strenge var kvantificeres.

Vi observeret, at efter indledningen af strømningsforhold ubehandlede celler havde meget få VWF-trombocyttal strygere (< 1 streng pr. anmeldelse område), mens histamin og PMA-behandlede celler havde et gennemsnit af 2,10 og 3.10 strygere, henholdsvis. Betydeligt flere VWF-trombocyttal strenge blev dannet da celler blev behandlet med HK (3,52 strygere, P = 0.019), HR (6,00 strygere, P = 0,004), og UH (5.51 strygere, P = 0,012). En grafisk repræsentation af streng VWF-trombocyttallet er vist i figur 3 g. Real-time VWF-trombocyttal streng dannelse som svar på UH i forhold til ubehandlede celler er vist i videoer 1A og B.

Disse undersøgelser, sammen med undersøgelser af andre grupper, viser, at histoner28 og andre proinflammatoriske stoffer som histamin5 og cytokiner31 stimulere VWF sekretion fra endotelceller, mægle efterfølgende trombocyttal fange in vitro. Vi viste, at den statiske stimulation i endothelial celler ikke var tilstrækkelige til at belyse VWF udgivelse på grund af kapacitet af histonerne at binde og udskille VWF. Design af et flow kammer model af VWF frigivelse og trombocyttal friktion var derfor forpligtet til at mere fuldstændigt karakterisere og model i vivo -interaktioner mellem endothelium, VWF og blodplader.

Figure 1
Figur 1: lysin-rige histoner inducerer VWF frigivelse fra kulturperler endotelceller. BOECs blev stimuleret med ufraktionerede Histon (UH), lysin-rige (HK) og argininog-rige (HR) Histon fraktioner. HK stimuleret VWF overgang til næringssubstratet. UH og HR behandling faldt påvisning af VWF:Ag i endothelial celle medium i forhold til kontrolelementet ubehandlet (Untr). N ≥3 individuelle eksperimenter blev udført. Tallene vises som middelværdier ± SE. *P < 0,05, **P < 0,01, og ***P < 0.001 angiver betydning i forhold til den ubehandlet tilstand. Dette tal er blevet ændret fra Michels al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: VWF-Histon bindende interfererer med VWF påvisning In Vitro. Plasmaafledte VWF binder sig kraftigere til HR og UH i en dosisafhængig måde i forhold til lysin-rige (HK) histoner i en solid-fase bindende assay. Tallene vises som middelværdier ± SE. N≥3 individuelle eksperimenter blev udført. Dette tal er blevet ændret fra Michels al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: histoner mægle VWF-trombocyttal streng dannelse. Endotelceller seedede på flow kammer dias blev behandlet med ufraktionerede Histon (UH), lysin-rige (HK), eller arginin-rige (HR) Histon brøker eller histamin/PMA (positiv kontrol) og var perfunderet på en shear stress af 4.45 dyn/cm2 for 10 min med vasket, fluorescently mærket blodplader. Repræsentative billeder blev opnået efter trombocyt flow fra ubehandlet kontrol (A) og celler behandles med histamin (B), Phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) (C), HK (D), HR (E) og UH (F). PMA behandling resulterede i et gennemsnit på 3,1 strenge per synsfelt, sammenlignes med histamin. VWF-trombocyttal strenge var kvantificeres fra 10 på hinanden følgende anmeldelse felter og i gennemsnit for n≥3 enkelte eksperimenter (G). Tallene vises som middelværdier ± SE. * P < 0,05 og ** P < 0,01 angive betydning i forhold til den ubehandlet tilstand. Dette tal er blevet ændret fra Michels al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende videoer. VWF-trombocyttal streng dannelse som svar på ufraktionerede Histon (2) i forhold til ingen behandling (1): denne video er blevet ændret fra Michels al.15. Venligst klik her for at hente disse videoer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens den fysiologiske relevansen af VWF-trombocyttal strygere er fortsat kontroversielt på grund af deres hurtige opløsning i overværelse af VWF holde protease ADAMTS13, tjener de som en kvantificerbar in vitro- model af trombocyt rekruttering af VWF til et websted på som en blodprop kan danne i lokaliseret stigninger i Histon niveau5. Derudover i patologier mangler ADAMTS13 aktivitet-sådan som trombotisk thrombocytopenisk purpura (TTP) - eller i inflammatorisk microenvironments - hvor ADAMTS13 aktivitet er hæmmede-VWF-trombocyttal strings kan observeres i vivo32 og kan bidrage til trombocyttal microaggregation og leukocyt ekstravasation, sammenkædning af VWF33hæmostatisk og proinflammatoriske funktioner. Endelig, det har været en hypotese at VWF-trombocyttal streng dannelse kunne være en igangsættende begivenhed i venøse og/eller arteriel trombose, danner nidus rundt som en patologisk blodprop er bygget.

VWF-trombocyttal streng dannelse i flow kammer system kan bruges til at studere WPB exocytose, ADAMTS13 kavalergang og trombocyttal bindende kapacitet af VWF. Der er flere kritiske trin til korrekt udførelse af disse eksperimenter. Dog afhængig af anvendelse af modellen, kan foretages ændringer i protokollen.

Endotelceller fra bestemt vaskulære senge er heterogene i deres svar til mekaniske og biokemiske signaler34. Det kan derfor være nyttigt at vælge en celletype egnet for anvendelsen af denne metode. BOECs blev brugt i den nuværende undersøgelse på grund af deres proliferativ potentiale; vedligeholdelse af fænotype på tværs af flere (10 +) passager; og robust VWF udtryk, lette kvantificering af VWF exocytose. Andre efterforskere har brugt menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVECs)5,8,28 og ikke-endotelceller (menneskelige embryonale 293 nyreceller) transfekteret med VWF cDNAs udtrykker VWD mutationer35 . Det er blevet påvist, at VWF udtryk varierer betydeligt mellem væv og fartøj fysiologi36. Kulturperler endothelceller forbindelse med fra forskellige mikro- og macrovasculature har observerbare forskelle i VWF protein basal sekretion37, og der er beviser for at calcium kanal forskelle i endothelial celle undertyper påvirke WPB exocytose svar på secretagogues38.

Histoner anvendtes i denne undersøgelse som en roman secretagogue. De blev sammenlignet med den positive kontrol, histamin, en ofte beskrevet fysiologiske stimulans af VWF frigivelse. En VWF:Ag ELISA blev brugt til at kontrollere VWF frigivelse fra endotelceller under statiske betingelser. Der er to intracellulære mekanismer, der udløser frigivelsen af VWF: udvidelse af intracellulære calcium39 eller pf cyklisk AMP niveauer40. Differential aktivering af disse veje kan være induceret af secretagogues såsom thrombin/histamin eller adrenalin/vasopressin (eller relevante for VWD, desmopressin), henholdsvis, og det kan være interessant at sammenligne disse to veje ved hjælp af salen flow model af VWF-trombocyttal streng dannelse. I forbindelse med thrombo-inflammatorisk sygdom, er yderligere udredning af inflammatoriske markører, såsom cytokiner41 eller skader/patogen-associeret molekylære mønstre (DAMPS/PAMPS), og deres roller i VWF-trombocyttal streng dannelse opmuntret.

Flydende shear stress er vigtigt når kugleformede VWF udfolder sig for at afsløre A1 domæne bindingssted for glycoprotein Ib på blodplader11. Det er blevet påvist, at et minimum væske shear stress af ca 0,73 dyn/cm2 er påkrævet for trombocyt binding til VWF strygere42. Desuden, disse strenge form på endotelceller ved relativt lav shear understreger (2,5 dyn/cm2) men kan forrykke sig på shear understreger 20 dyn/cm2 eller over8. I den aktuelle undersøgelse, har vi valgt en venøs shear stress (4.45 dyn/cm2), der er tilladt for interaktioner mellem endothelium, VWF og blodplader samtidig bevare perfusion buffer for en 10 min eksperiment.

Ved hjælp af dette flow kammer system til at vurdere ADAMTS13 spaltning af VWF-trombocyttal strenge kræver en forøgelse af de fluidic shear understreger over dem, der anvendes i dette eksperiment. Maksimal ADAMTS13 spaltning af VWF-trombocyttal strenge opstår mellem 10 og 30 dyn/cm212, et område, der omfatter høj venøs til moderat arteriel shear stress43. Ændre shear rate i dette system kan være nyttig til sammenligning VWF-trombocyttal streng dannelse og opløsning, medvirkende faktorer i udviklingen af venøse, arteriel eller mikrovaskulære trombose.

Kan foretages yderligere ændringer af denne teknik perfusion materiale og flow kammer. Secretagogues kan indgives under strømningsforhold ligner i vivo miljøer. Priming blodplader med agonister til at evaluere deres reaktivitet eller herunder leukocyt populationer er udvidelser af denne teknik. Desuden, herunder terapeutiske agenter målretning VWF multimer længde, trombocyttal bindende kapacitet eller trombocyt reaktivitet kan belyse vigtige mekanismer, der regulerer indledningen af Trombe udvikling. Andre efterforskere har brugt enten in-house44 eller købt glas coverslip flow kamre45, i modsætning til de polymer-baserede dias anvendes i denne undersøgelse, og synes at opnå sammenlignelige resultater.

En kritisk overvejelse i VWF-trombocyttal streng protokol er forberedelsen af vasket blodplader. Det anbefales ikke at bruge fuldblod i denne protokol på grund af tilstedeværelsen af ADAMTS13. Agenter forhindrer trombocyt aktivering, såsom prostacyclin eller apyrase, bør undgås, da dette kan senere negativt påvirke trombocyt vedhæftning til VWF. At sikre, at bufferne er bragt til stuetemperatur før trombocyt isolation og hjælp omhyggelig pipette teknikker (dvs., at undgå bobler og barske shear understreger) er nøglen til at opretholde blodplader i inaktiv tilstand. Desuden foretrækkes mærkning blodplader med en mitokondrie pletten, såsom DIOC6 eller rodamin 6 G, frem for at blande sig med ekstracellulære domæner, der kan være vigtige for VWF bindende. Men da DIOC6 er en membran-gennemtrængelige farvestof, det kan også tages op i små mængder i endothelial celler i løbet af eksperimentet. I mangel af en fluorescerende mikroskop, har andre undersøgelser observeret VWF-trombocyttal strenge ved hjælp af-lysfelt mikroskopi46.

Afslutningsvis, kan dette flow kammer metode af VWF-trombocyttal streng dannelse give mekanistisk, real-time data for at støtte i vivo observationer i patogenesen af trombose. Som eksponering for shear kraftigt påvirker den patofysiologiske rolle VWF spiller i thrombo-inflammatorisk sygdom, er flow kammer model en vital efterforskningsredskab for enhver interesseret i at forstå endotel celle-trombocyttal interaktioner i dette lab sammenhæng.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Alison Michels er en modtager af en Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate stipendium fra canadiske institutter for sundhed Research (CIHR). Laura L. Swystun er modtageren en CIHR fellowship. David Lillicrap er modtageren af en Canada forskning stol i molekylær hæmostase. Denne undersøgelse var delvis finansieret af en CIHR drift tilskud (MOP-97849).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calf-thymus unfractionated histones (UH) Worthington Biochemical HLY Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK) Sigma-Aldrich H5505 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR) Sigma-Aldrich H4830 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine Sigma-Aldrich H7125-1G Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) Invitrogen D273 Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating Antibody DAKO A0082 For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated DAKO P0026 For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates eBioscience 44-2404-21 For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates Thermo Scientific 3855 For VWF ELISA
Humate-P CSL Behring N/A Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference Plasma Precision BioLogic CCNRP-05 For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent Sigma-Aldrich P8287 Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092
Rat-tail Collagen Type 1 Corning 354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher Scientific 31985070 For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software Molecular Devices N/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive BD Biosciences 366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers) Ibidi This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized Ibidi 10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized Ibidi 10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized Ibidi 10802
Blunted 18G Needle BD Biosciences 305180
20 mL syringes BD Biosciences 302830
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope Quorum Technologies N/A
Image Processing Software ImageJ N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, aB., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Tags

Medicin sag 126 von Willebrands faktor blodplader endotelceller flow kammer histoner Weibel-Palade organer shear stress trombose.
Undersøge von Willebrands faktor Patofysiologi bruger en Flow kammer Model af von Willebrand faktor-trombocyttal streng dannelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michels, A., Swystun, L. L.,… More

Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. J. Vis. Exp. (126), e55917, doi:10.3791/55917 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter