Summary
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung der endothelialen von Willebrand Faktor Release und das anschließende Plättchen erfassen unter Fluid Schubspannung in Reaktion auf entzündliche Reize mit einer in-Vitro -Fluss-Kammer-System.
Abstract
Von-Willebrand-Faktor (VWF) ist ein Multimeric Glykoprotein Gerinnungsfaktor vermittelt, die Plättchen Adhäsion und Aggregation an Standorten von Endothelschäden und Faktor VIII in der Zirkulation führt. VWF ist durch endothelial Zellen synthetisiert und wird entweder konstitutiv in das Plasma abgegeben oder in speziellen Organellen, Weibel-Palade Körper (WPBs), genannt für bedarfsgesteuerte Freigabe in Erwiderung auf blutstillende Herausforderung gespeichert. Gerinnungsfördernden und proinflammatorischen Reize können schnell WPB Exozytose und VWF Freisetzung auslösen. Die Mehrheit der VWF veröffentlicht von Endothelzellen zirkuliert im Plasma; jedoch ist ein Teil der VWF an der Oberfläche der Endothelzellen verankert. Unter Bedingungen der physiologischen Scherung kann Endothelzellen verankert VWF binden an Thrombozyten, bilden eine VWF-Thrombozyten-Zeichenfolge, die die Nidus Thrombusbildung darstellen kann. Ein Flow-Kammer-System kann verwendet werden, um visuell zu beobachten, die Freisetzung von VWF aus Endothelzellen und das anschließende Plättchen in einer Art und Weise zu erfassen, die reproduzierbar und relevant für die Pathophysiologie der VWF-vermittelten Thrombusbildung. Mit dieser Methodik, Endothelzellen sind kultiviert in einem Strömungsraum und anschließend mit Secretagogues induzieren WPB Exozytose stimuliert. Gewaschene Thrombozyten sind dann über die aktivierte Endothel durchblutet. Die Plättchen werden aktiviert und anschließend binden an länglichen VWF-Zeichenfolgen in die Richtung der Flüssigkeitsströmung. Verwendung von extrazellulären Histone als gerinnungsfördernden und proinflammatorischen Anregung, beobachteten wir erhöhten VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Bildung auf Histon-behandelten endothelial Zellen im Vergleich zu unbehandelten Endothelzellen. Dieses Protokoll beschreibt eine quantitative, visuelle und Echtzeit-Bewertung der Aktivierung von VWF-Thrombozyten-Interaktionen in den Modellen der Thrombose und Hämostase.
Introduction
Thrombose ist eine führende Ursache von Sterblichkeit weltweit1 und Antwort Todysregulated Thrombozyten Aktivierung und Thrombin Generation in beiden Veinsand Arterien entwickeln kann. Plasmaspiegel von VWF sind ein wichtiger Regulator der Blutgerinnung, wobei niedrige Konzentrationen (< 50 %) führen, die Störung der Blutgerinnung bekannt als von Willebrand Krankheit (VWD)2 und ein hohes Maß (> 150 %) sind verbunden mit einem erhöhten Risiko von venösen3 und arterielle4 Thrombose.
VWF ist ein Multimeric Glykoprotein von Megakaryozyten und Endothelzellen synthetisiert und gespeichert in Thrombozyten α-Granula und WPBs, beziehungsweise. Bei blutstillende Herausforderung kann VWF von endothelialen WPBs, zirkulierende Thrombozyten aktiviert Endothelzellen5 oder freiliegende Kollagen auf dem Schiff Wand6Leine freigegeben werden. Verankerung der VWF an Endothelzellen nachweislich durch P-Selektin7 und Integrin αvβ38vermittelt werden. Die anschließende Freisetzung von Thrombozyten α-Granulat Geschäften kann lokalisierte VWF-Konzentrationen zur Stabilisierung der Thrombozyten-Thrombozyten Interaktionen für Thrombozyten Stecker Bildung, das Gerüst für die Ausbreitung der Koagulation Kaskade und Fibrin benötigt weiter erhöhen. Ablagerung. Die Thrombozyten-Bindung-Aktivität des VWF ist durch seine Multimeric Struktur mit hochmolekularen Gewicht Multimere besitzen größere blutstillende Aktivität9,10geregelt. Im Umlauf fungiert VVS auch als Träger für die Gerinnung Faktor VIII.
Fluid Scherspannung ist ein wesentlicher Regulator der VWF-Physiologie. In Ermangelung der Schubspannung existiert VWF in eine kugelige Form verbergen Bindung Domains für Thrombozyten-Glykoprotein Ib Adhäsion11. Wenn Schubspannung vorhanden ist, ist die Spaltstelle für eine Metalloprotease, ein Disintegrin und Metalloprotease mit Thrombospondin-Motiv (ADAMTS13) ausgesetzt. ADAMTS13 spaltet nackte und Thrombozyten eingerichtet VWF Zeichenfolgen zur Regulierung der Multimer Größe, wodurch seine blutstillende Aktivität12.
VWF ist ein akute-Phase-Protein, und zahlreiche Reize, einschließlich Hypoxie13, Infektion14und proinflammatorischen Zytokinen, haben gezeigt, dass VWF Freisetzung aus Endothelzellen zu vermitteln. Ähnlich wie andere entzündliche Agenten, extrazelluläre Histone haben auch gezeigt, dass systemische VWF Freisetzung in Mäusen15,16 und die Aktivierung von Thrombozyten in-vitro-17,18, induzieren 19. dies gezeigt wurde abhängig von Histon-Subtyp, da Unterschiede im Lysin und Arginin Inhalt Funktion15beeinflussen kann. Unsere Studie zielt darauf ab, eine Strömungsraum etablieren zu modellieren, um den Einfluss von Lysin-Rich (HK) zu untersuchen und reich an Arginin (HR) Histon Untertypen und Secretagogues auf endothelialer VWF Freisetzung und Echtzeit-Plättchen erfassen, mögliche frühe Ereignisse in Entzündung-induzierte Thrombose.
Dieser Fluss Kammer Methodik rekapituliert in Vivo Interaktionen zwischen Subendothelial Kollagen, Endothelzellen, VWF und Thrombozyten in eine in-vitro- System, das visuelle, reproduzierbare und quantifizierbar ist. Es ermöglicht die Echtzeit-Bewertung aller Aspekte des Pfades, der VWF-Thrombozyten Interaktionen, darunter WPB-Sekretion, Thrombozyten Aktivierung und VWF Proteolyse reguliert. Studien von VWF unter kontrollierten Schubspannung Bedingungen wurden zur VWD Mutationen zu bewerten, die VWF Freisetzung und Thrombozyten-bindende Funktion20, WPB Physiologie21und VWF Spaltung beeinträchtigen von ADAMTS135. Wir verwenden diese Methode, um VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Bildung als Folge einer Entzündungsreiz zu quantifizieren: extrazelluläre Histone.
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Protocol
Diese Studien wurden von der Research Ethics Board der Königin University, Kanada genehmigt.
(1) Endothelzellen Stimulation
-
Kollagen-Mantel einer Gewebekultur 6-Well-Platte.
- 24 Stunden im Voraus, Mantel einer Gewebekultur 6-Well Platte bei 37 ° C mit 1 mL Kollagen Puffer (50 µg/mL Ratte Schweif Kollagen Typ 1 mit 0,02 M Eisessig).
- Waschen Sie die Brunnen zweimal mit 2 mL von Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS).
Hinweis: Platten können in Alufolie gewickelt und in einer luftdichten Plastiktüte bei 4 ° c gelagert
- Samen der Endothelzellen bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen pro Bohrloch in 2 mL Wachstum mittelfristig mit 10 % fötalen Rinderserum (FBS). Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 ° C (5 % CO2).
Hinweis: Hier wurden Blut Auswuchs endothelial Zellen (BOECs) zwischen 5 und 15 Passagen eingesetzt. BOECs wurden isoliert von gesunden Probanden mit einem Wildtyp VWF-Sequenz mit einer Methode, die in Starke Et Al. verwiesen wird 22 in gewissem Sinne ähnlich wie eine zuvor von Jupiter23beschrieben. - Entfernen Sie das Medium nach 24 h und waschen Sie die Zellen mit HBSS.
- Fügen Sie 1 mL serumfreien Medium (minimale wesentliche Wachstumsmedium ohne FBS) enthaltenden Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA; 100 nM), fraktioniertem Histon (UH) und HK oder HR (alle bei 25 µg/mL) auf die Zellen für 2 h bei 37 ° C (5 % CO2).
Hinweis: Diese Konzentration von Histon basierte auf früheren in-vitro- Zytotoxizität berichten von Xu Et al. 24 und Abrams Et Al. 25 , die 50 µg/mL verwendet. - Sammeln Sie das Medium nach 2 h und bis zur Analyse bei-20 ° C lagern.
(2) VWF Quantifizierung von Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)
- Mantel einer Mikrotestplatte mit 100 µL Puffer (10 mM Diabas-Natriumphosphat und 145 mM Natrium-Chlorid, pH 7,2) mit 10 µg/mL polyklonale Anti-VWF Antikörper über Nacht bei 4 ° c zu beschichten
- Waschen Sie die Platte dreimal mit 250 µL Waschpuffer (10 mM Diabas-Natriumphosphat, Natriumchlorid 500 mM und 0,1 % Tween 20, pH 7,2).
- Die mittlere Proben 1:2 und 1:4 mit Waschpuffer verdünnt und normalen Referenz Plasma für eine Standardkurve, beginnend bei einer 01:10 Verdünnung.
- Platte 100 µL der verdünnten Proben und Standards über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Platte dreimal mit 250 µL Waschpuffer.
- Fügen Sie 100 µL verdünnter Anti-VWF, HRP-konjugierten Detektionsantikörper (1,1 µg/µL Waschpuffer) auf die Platte und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie die Platte und inkubieren Sie für 10 min mit O-Phenylendiamin Dihydrochloride (OPD) Reagenz, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Stoppen Sie die Reaktion mit 100 µL 1 M H2SO4 und lesen Sie die Platte bei 492 nm.
3. Festphasen-Histon-VWF-Bindung-Assay
- Mantel einer Mikrotestplatte mit Histonen verdünnt in 0,5 % Natrium Deoxycholate 50 mM Carbonat Puffer (pH 9,6) bis 10 µg/mL über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Platte dreimal mit 250 µL PBS ergänzt mit 0,1 % Tween 20, Inkubation für 10 min zwischen den Waschgängen.
- Blockieren Sie die Platte mit 200 µL PBS ergänzt mit 0,1 % Tween 20 und 1 % Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei Raumtemperatur.
- Wiederholen Sie Schritt 3.2.
- Plasma-abgeleitete menschliche VWF/Faktor VIII Komplex von 200 mU/mL bis 25 mU/mL Kochsalzlösung Puffer seriell zu verdünnen (10 mM Diabas-Natriumphosphat,, 500 mM Natriumchlorid und 0,1 % Tween 20, pH 7,2). Die Platte für 2 h bei Raumtemperatur 100 µL hinzufügen.
- Wiederholen Sie Schritt 3.2.
- Erkennen Sie die Bindung von VWF an immobilisierte Histon mit 100 µL einer Lösung mit PBS-0.1% Tween 20 und 1:1,000 Kaninchen polyklonale Anti-VWF Antikörper konjugiert, HRP für 1 h bei Raumtemperatur.
- Wiederholen Sie Schritt 3.2.
- Brüten die Platte für 30 min mit 100 µL OPD Reagenz und stoppen die Reaktion mit 100 µL 1 M H2SO4. Messung die optische Dichte bei 492 nm.
4. Aussaat Endothelzellen auf Flow-Kammern
- Laden Sie 0,5 mL Kollagen-Beschichtung Puffer (in Schritt 2.1 beschrieben) in einer 1-mL-Spritze Luer-Lock.
- Drehen Sie das Luer-Lock-Ende der Spritze auf das Reservoir einer Flow-Kammer-Folie.
- Drücken Sie den Kolben langsam, bis die gesamte Spur beschichtet ist und jeder Behälter ist voll. Wiederholen Sie für jede Spur und inkubieren Sie die Kammer bei 37 ° C für 24 h.
- Den Kollagen-Beschichtung-Puffer mit einer 200 μl Pipette abzusaugen. Laden Sie eine weitere Spritze mit 1 mL HBSS und drücken Sie den Kolben langsam, jede Spur von den Strömungsraum zu waschen. Aspirieren Sie das Waschen mit einer 200 μl Pipette am entgegengesetzten Ende des den Strömungsraum. Zweimal wiederholen.
- Pipette ca. 100 µL einer 3 x 106 Zellen/mL Endothelzellen (BOEC) Lösung im Wachstumsmedium mit 10 % FBS in die Spur einer Kammer fließen.
Hinweis: Die Aussaatdichte von Endothelzellen übersteigt die Kapazität der Kammer. Das heißt, maximal Kanal Abdeckung zu gewährleisten. nicht-anhaftende Zellen sind in der nachfolgenden Waschschritt entfernt. - Inkubieren Sie der Kammer bei 37 ° C für 24 h Änderung des Mediums alle 8-12 h mit Luer-Lock Spritzen (wie in Schritt 4.4). Sicherzustellen Sie, dass es keine sichtbaren Luftblasen in den Gassen.
(5) isolieren Thrombozyten aus menschlichen Vollblut
- Fügen Sie in einer biologischen Sicherheitsschrank mit einer 30 G-Nadel 300 µL Puffer Acid Citrat Dextrose (85 mM Trinatrium Citrat, 111 mM D-Glucose und Zitronensäure 71 mM, pH 4,5 hinzu) ein Zusatzstoff-freie 3 mL Blut Sammlung Vacutainer.
- Sammeln Sie Vollblut von gesunden Probanden (frei von Anti-Thrombozyten und nicht-steroidale Antirheumatika für sieben Tage) durch Venenpunktion (drei Rohre von 3 mL), im Anschluss an ein Protokoll ähnlich dem von Bernardo Et Al26veröffentlicht.
- Das erste Rohr zu verwerfen, da die ursprüngliche Gewebeschäden im Zusammenhang mit der Venenpunktion spontane Thrombozyten Aktivierung führen kann.
- Invertieren Sie sanft die Vacutainer dreimal um das Blut mit Antigerinnungsmittel mischen.
- Zentrifugieren Sie die Vacutainer 150 X g für 15 min bei 24 ° C (Raumtemperatur).
- Entfernen Sie langsam das Platelet-Rich Plasma (überstand) mit einer Pipette in einem biologischen Sicherheitsschrank und übertragen Sie sorgfältig auf eine 15 mL konische Rohr. Übertragen Sie Platelet-Rich-Volumen von jedem Vacutainer zu einem einzigen konische Schlauch zu potenziellen Kreuz-Aktivierung zu umgehen.
Hinweis: Thrombozyten Isolierung sollte in einem biologischen Sicherheitsschrank gegen bakterielle Kontamination und mögliche künstliche Thrombozyten bzw. endotheliale Aktivierung durchgeführt werden. - Zentrifugieren Sie die konische Rohre bei 900 X g für 10 min bei 24 ° C (Raumtemperatur), pellet-Plättchen.
- Pipette und entsorgen des Thrombozyten-Armen Überstands.
- Waschen Sie das Pellet vorsichtig mit 1 mL Natrium-Citrat-Glukose (CGS) Puffer (Natriumcitrat 13 mM, 30 mM D-Glukose und 120 mM Natrium-Chlorid, pH 7,0).
Hinweis: Die Thrombozyten erscheint in Wisp-ähnliche Formationen wenn der CGS-Puffer hinzugefügt wird und die Pellets sanft Nukleinsäuretablette. In Proben kontaminiert durch Aktivierung der Thrombozyten die Blutplättchen werden nicht leicht Aufschwemmen und klobigen erscheint. - Einmal vollständig durch Zentrifugieren Sie die Proben bei 900 X g für 10 min bei 24 ° C (Raumtemperatur).
- Entfernen Sie die CGS Waschpuffer und Aufschwemmen der Pellets in 3 mL Tyrode Puffer (138 mM Natrium-Chlorid, 5,5 mM D-Glucose, 12 mM Sodium Bicarbonat, 2,9 mM Kaliumchlorid und 0,36 mM Diabas-Natriumphosphat, pH 7.4). Gewährleisten Sie komplette Wiederfreisetzung der Plättchen zu und Aggregationen eingehalten, verwerfen Sie die Probe.
- Jeweils 3 mL konische Rohr der gewaschenen Thrombozyten für eine Endkonzentration von 1 µM 1,5 µL aus einer 20 mM DiOC6-Stammlösung (57,25 mg in 5 mL Methanol auflösen) hinzufügen.
Hinweis: DIOC6 ist eine grüne mitochondriale Fluoreszenzfarbstoff verwendet in diesem Experiment zu Label Thrombozyten. - Aliquoten 1 mL der Lösung gewaschen Thrombozyten zu drei 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
Hinweis: Die Thrombozyten Lautstärke erforderlich für dieses Experiment ist auf die Größe der Strömungsraum, die gewünschte Schubspannung und die Länge des Experiments (Schritt 6.5) berechnet. Dieses Protokoll kann eingestellt werden, wie Bedingungen zu ändern, um sicherzustellen, dass es genügend Volumen für Strömung. - Verwenden Sie die gewaschenen Thrombozyten innerhalb 2 h der Isolation.
6. Vorrichtung Fließmontage
- Bringen Sie ein 70 cm Stück sterilen Silikon Schläuche (Innendurchmesser von 1,6 mm) auf eine männliche Ellenbogen Luer-Anschluss-Stecker an einem Ende und einem weiblichen Luer Lock Adapter am anderen.
- Schließen Sie den weiblichen Luer Lock Adapter auf das Rohr auf einer 20 mL Spritze befestigt.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.1 und 6.2 zweimal um drei identische Spritze Schlauchverbindungen zu generieren.
-
Verwenden Sie eine Spritzenpumpe Strömung erzeugen. Geben Sie die folgenden Einstellungen in die Spritzenpumpe: Innendurchmesser der Spritze und Flow Rate.
Hinweis: Eine 20-mL-Spritze hat einen Innendurchmesser von 19,55 mm. Der Volumenstrom errechnet sich die gewünschte Rate/Scherung Schubspannung und die Abmessungen der Kammer fließen. Für den Strömungsraum verwendet in der aktuellen Studie 1 dyn/cm2 (bei niedrigen venösen Scherung), zu erreichen ist eine Durchflussmenge von 9.37 µL/min erforderlich. Wegen nachgewiesener Venenthrombose Histone verlinken ist eine moderate venöse Scherung von 4,45 dyn/cm2 ausgewählt. Dies ist auch die Annahme zugrunde, dass der Puffer eine ähnliche Viskosität zu Wasser hat. Die Fließgeschwindigkeit ist dann gleich 41,7 µL/min. Gleichungen zur Berechnung der Durchfluss für verschiedene Fluss Kammer Abmessungen finden Sie unter:- Legen Sie die Pumpe Flüssigkeit über die Schaltfläche "Option auf der Spritzenpumpe zurückzuziehen.
- Laden Sie die drei Spritzen mit Schlauch an der Spritzenpumpe verbunden und sichern Sie Klammern um die Spritzen und Kolben fest zu.
- Legen Sie eine männliche Ellenbogen Luer an beiden Enden ein zweites 20 cm Stück sterile Silikonschlauch.
- Verbinden Sie einen Ellbogen Luer-Anschluss mit einer abgestumpften 18-Gauge-Nadel.
- Wiederholen Sie zweimal, drei identische Ansaugsysteme für die drei Fahrspuren der Fluss Kammer zu schaffen.
Hinweis: Die Silikon-Schläuche und Luers kann mit 10 % Bleichmittel gefolgt von destilliertem Wasser vor der Wiederverwendung gewaschen werden. Es wird nicht empfohlen, die Fluss Kammern wiederzuverwenden.
(7) Mikroskop Einstellungen
- Ausgestattet mit einer voll automatisierten Bühne drehenden Scheibe Mikroskop verwenden. Durchführen Sie Beleuchtung mit einem Laser-Start, der 405, 458, 491, 543 und 633 nm Laser-Linien bietet. Alle Bilder mit einem 20 X Objektiv zu erfassen. Passen Sie alle Parameter mit der Analysesoftware (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
- Wählen Sie die Kanaleinstellungen (Emission Filter: 520/35), mit Erregung bei 491 nm, für den Erwerb. Legen Sie das Elektron Multiplikation – Coupled Ladegerät Elektron-Multiplikation Gewinn von 150, mit einer Belichtungszeit von 200 ms, um den gesamten dynamischen Datenbereich zu erhalten.
Hinweis: Thrombozyten sind gekennzeichnet mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff, DiOC6, mit Wellenlängen Maxima (Erregung, 482 nm, Emission, 504 nm). - Passen Sie die 491 nm Laserleistung auf 20 %.
- Markieren Sie die Mitte der alle drei Fahrspuren und wählen Sie 1 μm für Z-Palette und 0,5 μm für Schrittgröße aus. Wählen Sie die Anzahl der Zeitpunkte (d. h. Dauer) und die Zeit zwischen den Bildern (z. B. Intervall) zum Erfassen eines Abbilds alle 10 s; Wählen Sie "60 Mal Punkte" pro Folie. Legen Sie das Mikroskop Aufnahmen von den drei Fahrspuren und in einem dafür vorgesehenen Experiment-Ordner speichern.
Hinweis: Da die Strömungsraum drei Fahrspuren aufweist, müssen das Mikroskop Umschalten zwischen drei Positionen, die Bilder zu erfassen.
(8) VWF-Thrombozyten String Bildung
- Entfernen Sie das Kulturmedium von Strömungsraum (von Schritt 4) mit der gleichen Technik wie in Schritt 4.4.
- Hinzufügen von 100 µL der beiden Histamin (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK oder HR (alle bei 25 µg/mL) verdünnt in serumfreien Medium (wie in Schritt 1.4) um die BOEC Monolage für 15 min bei Raumtemperatur und ambient O2Co2zu stimulieren.
Hinweis: Obwohl für VWF Freisetzung nicht erforderlich ist, wird diese Stimulation bei 37 ° C durchführen VWF Exozytose27verbessern. - Stellen Sie sicher, dass einer der drei getrennte Fahrspuren der Fluss Kammer bleiben als experimentelle Kontrolle unbehandelt.
- Entfernen Sie das Medium mit einer 1 mL Spritze und ersetzen Sie es mit 100-200 µL PBS, die Secretagogues aus der endothelialen Monolage zu waschen.
- Montieren Sie den Strömungsraum auf eine Folie mit vaskulären Clips um die Kammer im Ort zu sichern.
- Das Reservoir an den Strömungsraum zuordnen Sie verfügbaren Luer-Anschluss-Stecker am Ende der 70 cm Schlauch (verbunden mit der Spritze). Wiederholen Sie für die andere Strömung Kammer zweispurig.
- Starten Sie die Spritzenpumpe um die PBS waschen zu entfernen. Pipette zusätzliche PBS in den gegenüberliegenden Fluss Kammer Tank um sicherzustellen, dass die Bahnen nicht trocken laufen.
- Die Flow-System für gleichwertige fließen über alle drei Fahrspuren zu beobachten und dann pause die Spritzenpumpe.
- Wählen Sie einen Bereich um die Bilder in etwa in der Mitte jeder Bahn, in etwa der gleichen Gegend zwischen Experimente zu erfassen.
Hinweis: Die Person, die das Mikroskop kann zu den Versuchsbedingungen Blenden zu lassen. Diese Schritt wird sichergestellt, dass das Mikroskop vor Thrombozyten Strömung ausgerichtet ist (siehe Schritt 7). - Befestigen Sie einen weiblichen Luer-Koppler einer 5 mL Spritze und dann mit dem freien männlichen Luer-Anschluss (Schritt 6,8) und tauchen die abgestumpften Nadel im 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit der gewaschenen Thrombozyten-Lösung (Schritt 5.13). Ziehen Sie langsam die Thrombozyten-Lösung durch den Schlauch, keine Luftblasen innerhalb des Systems zu gewährleisten.
- 5 mL Spritze entfernen und das offene Reservoir an den Strömungsraum männlichen Luer beimessen. Wiederholen Sie für die drei Fahrspuren.
- Starten Sie die Spritzenpumpe und Aufnahmen Sie während der Thrombozyten-Fluss mit Mikroskop und Protokoll-Einstellungen aus Schritt 7 für 10 min in der Dunkelheit.
- Nach 10 min die Aufnahme Schläuche auf dem Fluss-Kammer-Stausee trennen Sie die Luer-Anschluss und füllen Sie den Tank mit PBS fließen über die endotheliale Monolage aufrecht zu erhalten.
9. VWF-Thrombozyten String Quantifizierung
Hinweis: Der kontinuierliche Fluss von PBS ist verpflichtet die VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Dehnung für die Bildanalyse zu pflegen. Einstellung der Fluss führt die VWF zu kugelförmig und wird VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Quantifizierung beeinträchtigen. Unbedingt nach oben bis jeder Behälter mit PBS während der Bildaufnahme. HBSS können PBS ersetzen, wenn Zelle schrumpft oder Ablösung während dieses Schritts beobachtet wird.
- Beginnend mit der ersten Spur, 10 Aufnahmen Sie pro Folie ohne Überlappung mit einem 20 X Objektiv um Mitte der Folie. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Fahrspur.
Hinweis: Die Bereiche rund um die Stauseen sollte aufgrund der turbulenten Schubspannung vermieden werden. - Bildverarbeitungs-Software verwenden, passen Sie die Helligkeit durch Klicken auf "Bild", "Anpassen" und "Helligkeit/Kontrast." Ziehen Sie die Bildlaufleiste, bis die haften Plättchen gut genug für die Quantifizierung angezeigt werden können.
- Aufzeichnen einer VWF-Thrombozyten-Zeichenfolge, wenn drei oder mehr ausgerichteten Thrombozyten werden im Bild beobachtet. Zählen Sie die VWF-Thrombozyten-Saiten in einem Bild. Wiederholen Sie für alle 10 Bilder und durchschnittlich für das Experiment.
Hinweis: Die Person, die die Quantifizierung kann zu den Versuchsbedingungen Blenden zu lassen. Es ist nicht notwendig, für VWF, Co zu beflecken, wie dies durch unabhängige Studien8,28,29. - Wiederhole das Experiment mindestens drei Mal, jeder Sekretagog zu bewerten.
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Representative Results
Um die Wirkung der Histone auf VWF Freisetzung aus Endothelzellen direkt zu beurteilen, wir konfluierende BOECs serumfreien Medium mit PMA (Positivkontrolle), UH, HR und HK für 2 h ausgesetzt. Wir haben gezeigt, dass HK eine 2-fache Erhöhung im VWF-Protein (VWF:Ag) in das Medium der behandelten Endothelzellen (Abbildung 1 induziert). Interessant ist, wenn Sie BOECs mit UH und HR angeregt wurden, war es weniger VWF:Ag im Medium als im unbehandelten Zustand erkannt. Wir stellten die Hypothese, dass da direkt an VWF30Histone binden können, differentiell mit VWF:Ag Detektion in das Kulturmedium stören können. Um Histon Bindung an VWF zu bewerten, haben wir einen Festphasen-Bindung-Assay verwendet. Wir haben gezeigt, dass UH und HR stärker verpflichtet VWF als HK (Abbildung 2), unterstützt die Erkennung Einmischung in Abbildung 1gezeigt.
Extrazelluläre Histone haben gezeigt, dass Thrombozyten in-vitro-19zu aktivieren, und unsere Daten deuten darauf hin, dass Histone VWF Freisetzung aus Endothelzellen vermitteln. Um die Wirkung der Histone VWF-Thrombozyten-Interaktionen zu charakterisieren, haben wir einen Fluss Kammer Modell der VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Bildung in dem markierte Thrombozyten auf stimuliert Endothelzellen durchblutet waren. Repräsentative Bilder waren erfasste nach dem Fluss, und die Anzahl der VWF-Thrombozyten Saiten wurden quantifiziert.
Wir beobachtet, dass nach der Einleitung der Strömungsverhältnisse, unbehandelte Zellen sehr wenige VWF-Thrombozyten Saiten hatten (< 1 Saite pro Überprüfung im Feld), während Histamin und PMA-behandelten Zellen bzw. durchschnittlich 2.10 und 3.10 Saiten hatte. Deutlich mehr VWF-Thrombozyten-Strings entstanden, als Zellen mit HK behandelt wurden (3,52 Streicher, P = 0,019), HR (6,00 Streicher, P = 0,004), und UH (5,51 Streicher, P = 0,012). Eine grafische Darstellung der Zeichenfolge VWF-Thrombozytenzahl ist in Abbildung 3dargestellt. Echtzeit-VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Bildung als Reaktion auf UH im Vergleich zu unbehandelten Zellen zeigt Videos 1A und B.
Diese Untersuchungen sowie Untersuchungen von anderen Gruppen zeigen, dass die Histone28 und anderen proinflammatorischen Substanzen wie Histamin5 und Zytokine31 VWF-Sekretion von endothelial Zellen stimulieren Vermittlung nachfolgende Thrombozyten in Vitrozu erfassen. Wir bewiesen, dass die statische Stimulation von Endothelzellen nicht genügte, um VWF Freisetzung durch die Fähigkeit der Histone zu binden und sequester VWF zu erhellen. Das Design einer Flow-Kammer-Modell der VWF Freisetzung und Plättchen Adhäsion musste daher vollständig zu charakterisieren und modellieren die in Vivo -Interaktionen zwischen Endothel, VWF und Thrombozyten.
Abbildung 1: reich an Lysin Histone VWF Freisetzung aus kultivierten Endothelzellen induziert. BOECs wurden angeregt mit fraktioniertem Histon (UH), reich an Lysin (HK) und reich an Arginin (HR) Histon Brüche. HK angeregt VWF Freisetzung in das Kulturmedium. UH und HR Behandlung verringert die Erkennung von VWF:Ag in den Endothelzellen Medium im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolle (unbehandelten). N ≥3 einzelne Experimente wurden durchgeführt. Die Daten werden dargestellt als Mittelwerte ± SE. *P < 0,05, **P < 0,01, und ***P < 0,001 zeigen die Bedeutung im Vergleich zu den unbehandelten Zustand. Diese Zahl wurde von Michels Et al.15geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: VWF-Histon Bindung stört VWF-Erkennung In-vitro-. Plasma-abgeleitete VWF bindet stärker an HR und UH auf dosisabhängige Weise im Vergleich zu reich an Lysin (HK) Histone in einem Festphasen-Bindung-Assay. Die Daten sind, die einzelnen Experimente durchgeführt wurden als Mittelwerte ± SE N≥3 gezeigt. Diese Zahl wurde von Michels Et al.15geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Histone vermitteln VWF-Thrombozyten String Bildung. Endothelial Zellen ausgesät auf Strömungsraum Folien mit fraktioniertem Histon (UH), reich an Lysin behandelt wurden (HK) oder Arginin-Reich (HR) Histon Brüche oder Histamin/PMA (Positivkontrolle) und wurden auf eine Scherspannung von 4,45 dyn/cm2 für 10 min durchblutet mit gewaschenen, Eindringmittel beschrifteten Thrombozyten. Repräsentative Bilder stammen aus der unbehandelten Kontrolle (A) und Zellen behandelt mit Histamin (B) Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) (C), HK (D), Post-Thrombozyten Fluss HR (E) und UH (F). PMA Behandlung führte zu einem Durchschnitt von 3,1 Strings pro Gesichtsfeld, vergleichbar mit Histamin. VWF-Thrombozyten Saiten wurden von 10 aufeinander folgenden Beitrag Felder quantifiziert und gemittelt für n≥3 einzelne Experimente (G). Die Daten werden dargestellt als Mittelwerte ± SE. * P < 0,05 und ** P < 0,01 geben Bedeutung im Vergleich zu den unbehandelten Zustand. Diese Zahl wurde von Michels Et al.15geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Videos. VWF-Thrombozyten String Bildung als Reaktion auf fraktioniertem Histon (2) im Vergleich zu No-Behandlung (1): dieses Video wurde von Michels Et al.15. geändert Bitte klicken Sie hier, um diese Videos herunterladen.
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Discussion
Während die physiologische Bedeutung der VWF-Thrombozyten aufgrund ihrer schnellen Auflösung im Beisein der VWF-Spaltung Protease ADAMTS13 umstritten bleibt Streicher, dienen sie als quantifizierbare in Vitro Modell der Thrombozyten Rekrutierung von VWF an einen Standort am bilden ein Thrombus kann in Gegenwart von lokalisiert Anstieg Histon Level5. Zudem fehlen ADAMTS13 Aktivität-solch als thrombotische thrombozytopenische Purpura (TTP) - oder entzündliche Mikroumgebungen - Pathologien wo ADAMTS13 Aktivität gehemmt-VWF-Thrombozyten Zeichenfolgen in Vivo32 beobachtet werden und kann Thrombozyten Mikroaggregation und Leukozyte Extravasation, verknüpfen die Hämostatikum und proinflammatorischen Funktionen des VWF33beitragen. Zu guter Letzt hat es vermutet wurde, dass VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Bildung möglicherweise einem auslösenden Ereignis in venöse oder arterielle Thrombose, die Nidus ein pathologischer Thrombus herum bilden.
VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Bildung in der Flow-Kammer-System kann verwendet werden, WPB Exozytose ADAMTS13 Spaltung und die Thrombozyten-Bindungskapazität von VWF zu studieren. Es gibt mehrere wichtige Schritte erfolgreich ausführen dieser Experimente. Abhängig von der Anwendung des Modells können jedoch Änderungen des Protokolls vorgenommen werden.
Endothelzellen aus bestimmten vaskulären Betten sind heterogen in ihrer Antwort auf mechanischen und biochemischen Signale34. Es kann daher zu einen Zelltyp geeignet für die Anwendung dieser Methode wählen nützlich. BOECs wurden in der aktuellen Studie wegen der proliferativen Möglichkeiten verwendet; Wartung des Phänotyps in mehreren Durchgängen (10 +); und robuste VWF Ausdruck, die Quantifizierung der VWF Exozytose zu erleichtern. Andere Forscher haben menschliche Nabelschnur verwendet Vein endothelial Zellen (Mediumwechsel)5,8,28 und nicht endothelial Zellen (menschliche embryonale Nieren 293) transfiziert mit VWF cDNAs auszudrücken VWD Mutationen35 . Es wurde nachgewiesen, dass VWF Ausdruck erheblich zwischen Gewebe und Schiff Physiologie36 variiert. Kultivierte Endothelzellen aus verschiedenen Mikro- und Macrovasculature haben beobachtbaren Unterschiede im VWF Protein basale Sekretion37, und es gibt Beweise dafür, dass Kalzium-Kanal-Unterschiede zwischen den Endothelzellen Subtypen WPB beeinflussen Exozytose als Reaktion auf Secretagogues38.
Histone wurden in dieser Studie als eine neuartige Sekretagog verwendet. Sie waren im Vergleich zu der Positivkontrolle, Histamin, häufig beschriebenen physiologischen Stimulans der VWF Freisetzung. Ein VWF:Ag ELISA wurde zur VWF Freisetzung aus Endothelzellen unter statischen Bedingungen zu überprüfen. Es gibt zwei intrazelluläre Mechanismen, die die Freisetzung von VWF auslösen: die Höhe des intrazellulären Calcium-39 oder Pf zyklisches AMP Level40. Differentielle Aktivierung dieser Wege kann durch Secretagogues wie Thrombin/Histamin oder Epinephrin/Vasopressin induzierte (oder, für VWD, Desmopressin relevant), bzw., und es kann interessant sein, diese beiden Wege mit diesem Strömungsraum vergleichen Modell der VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Bildung. Im Rahmen von Thromboembolien entzündliche Erkrankung ist weiter Aufklärung der entzündlichen Biomarker wie Zytokine41 oder Schäden/Pathogen-assoziierte molekulare Muster (DAMPS/PAMPS), und ihre Rolle im VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Bildung gefördert.
Fluid Scherspannung ist wichtig, wenn kugelige VWF entfaltet, um die A1-Domäne-Bindungsstelle für Glykoprotein Ib auf Thrombozyten11verfügbar zu machen. Es hat sich gezeigt, dass eine minimale Fluid Schubspannung von rund 0,73 dyn/cm2 für Thrombozyten binden an VWF Saiten42erforderlich. Darüber hinaus bilden diese Zeichenfolgen auf Endothelzellen bei relativ niedrig Schubspannungen (2,5 dyn/cm2), aber bei Scherspannungen von 20 dyn/cm2 oder über8verdrängt werden können. In der aktuellen Untersuchung wählten wir eine venöse Scherspannung (4,45 dyn/cm2), die für Interaktionen zwischen Endothel, VWF und Thrombozyten zulässig unter Schonung des Perfusion Puffers für ein 10 min-Experiment.
Mit diesem Fluss-Kammer-System auszuwertende ADAMTS13 Spaltung von VWF-Thrombozyten Saiten erfordert eine Erhöhung der fluidische Schubspannungen über die in diesem Experiment verwendet. Maximale ADAMTS13 Spaltung von VWF-Thrombozyten Zeichenfolgen tritt zwischen 10 und 30 dyn/cm212, ein Sortiment, das hohe umfasst venösen zu moderaten arteriellen Schubspannung43. Ändern der Schergeschwindigkeit in diesem System möglicherweise nützlich für den Vergleich von VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Gründung und Auflösung, beitragende Faktoren bei der Entwicklung von mikrovaskulären venöse oder arterielle Thrombose.
Zusätzliche Änderungen dieser Technik können auf das Material der Perfusion und der Strömungsraum erfolgen. Secretagogues können unter Strömungsbedingungen in Vivo Umgebungen ähneln verabreicht werden. Grundieren von Blutplättchen mit Agonisten, ihre Reaktivität zu bewerten oder einschließlich Leukozyten Bevölkerungsgruppen sind Erweiterungen dieser Technik. Einschließlich therapeutischer Wirkstoffe gezielt VWF Multimer Länge, Thrombozyten-Bindungskapazität oder Thrombozyten Reaktivität kann darüber hinaus wichtige Mechanismen aufzuklären, die die Einleitung der Thrombus Entwicklung zu regulieren. Andere Forscher haben verwendet entweder Inhouse44 oder gekauften Glas Deckglas Fluss Kammern45, im Gegensatz zu den Polymer-basierten Folien in dieser Studie verwendet und scheinen, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten.
Eine kritische Betrachtung im VWF-Thrombozyten-Zeichenfolge-Protokoll ist die Vorbereitung der gewaschenen Thrombozyten. Es wird nicht empfohlen, Vollblut in diesem Protokoll aufgrund des Vorhandenseins von ADAMTS13 zu verwenden. Agenten, die Verhinderung von Thrombozyten Aktivierung, wie z. B. Prostazyklin oder Apyrase, sollten vermieden werden, da das Plättchen Adhäsion an VWF später negativ beeinflussen kann. Sicherzustellen, dass die Puffer auf Raumtemperatur vor Thrombozyten Isolation gebracht werden und mit sorgfältiger Pipette Techniken (z. B. Vermeidung von Luftblasen und rauen Schubspannungen) sind der Schlüssel zur Erhaltung der Blutplättchen im inaktiven Zustand. Darüber hinaus ist Kennzeichnung Plättchen mit einer mitochondrialen Fleck, wie DIOC6 oder Rhodamin 6G vorzuziehen extrazellulären Domänen, die möglicherweise wichtig für VWF-Bindung zu stören. Jedoch da DIOC6 eine Membran durchlässig Farbstoff ist, kann es auch in kleinen Mengen von den endothelialen Zellen im Laufe des Experiments aufgegriffen werden. In Ermangelung eines fluoreszierenden Mikroskops haben andere Studien VWF-Thrombozyten Zeichenketten mit Hellfeld Mikroskopie46beobachtet.
Zusammenfassend bieten diese Strömung Kammer Methodik der VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Formation mechanistische, Echtzeit-Daten, um in Vivo Beobachtungen in der Pathogenese der Thrombose zu unterstützen. Exposition gegenüber stark verbiegen die pathophysiologische Rolle beeinflusst, die VWF in Thromboembolien entzündliche Erkrankung spielt, ist der Flow-Kammer-Modell eine lebenswichtige Ermittlungswerkzeug für jedes Labor interessiert endothelial Zelle-Thrombozyten-Interaktionen in diesem Verständnis Kontext.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Alison Michels ist ein Empfänger eines Frederick Banting und Charles Best Kanada Graduate Stipendium von Canadian Institute der Gesundheit Forschung (CIHR). Laura L. Swystun ist der Empfänger ein CIHR Stipendium. David Lillicrap ist der Empfänger ein Canada Research Chair in molekularen Blutstillung. Diese Studie wurde zum Teil durch eine CIHR Zuschuss (MOP-97849) Betrieb finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calf-thymus unfractionated histones (UH) | Worthington Biochemical | HLY | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus lysine-rich histones (HK) | Sigma-Aldrich | H5505 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus arginine-rich histones (HR) | Sigma-Aldrich | H4830 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | Reconstituted in DMSO (20 mM) |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125-1G | Reconstituted in water (50 mg/mL) |
| 3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) | Invitrogen | D273 | Reconstituted in methanol (20 mM) |
| Rabbit Anti-VWF Coating Antibody | DAKO | A0082 | For VWF ELISA |
| Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated | DAKO | P0026 | For VWF ELISA and histone-VWF binding assay |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates | eBioscience | 44-2404-21 | For histone-VWF binding assay |
| Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | For VWF ELISA |
| Humate-P | CSL Behring | N/A | Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex |
| Normal Reference Plasma | Precision BioLogic | CCNRP-05 | For VWF ELISA standard curve |
| O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent | Sigma-Aldrich | P8287 | Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006) |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | For culturing and initial seeding of BOEC |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Rat-tail Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher Scientific | 31985070 | For endothelial cell stimulations |
| METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software | Molecular Devices | N/A | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive | BD Biosciences | 366703 | |
| µ-Slide III 0.1 (flow chambers) | Ibidi | This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2 | |
| Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized | Ibidi | 10842 | |
| Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10825 | |
| Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10802 | |
| Blunted 18G Needle | BD Biosciences | 305180 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM | N/A | |
| Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Image Processing Software | ImageJ | N/A |
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