Summary
이 프로토콜 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 등 어떻게 고해상도 이미징 기술을 설명 하 고 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy에 정보를 얻기 위해 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하 여 작은 설치류에 이용 될 수 있다 망막 두께 microglial 각각 유통, 셀.
Abstract
스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 및 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (SLO) 실험 안과에 광범위 하 게 사용 됩니다. 현재 프로토콜에서 마우스 표현 녹색 형광 단백질 (gfp) Cx3cr1 의 발기인에서 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) microglia 세포에서 vivo에서 망막에 이미지를 사용 했다. Microglia 상주 세포는 망막의 고 여러 망막 질환1,2,3,4,,56에 연루 되었습니다. 이 프로토콜의 망막 B-스캔, SD-10 월과 SLO에서 vivo에서,와 함께 Cx3cr1gfp/gfp 마우스 microglia 셀 배포판의 이미징 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하는 세대에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다. 프로토콜은 여러 기자 마우스 라인에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 여기에 제시 된 프로토콜 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, SLO 및 SD-10 월, 고해상도 모드에서 사용 될 때 높은 축 해상도 측면 해상도와 데이터 수집 낮습니다 (3.5 µ m와 6 µ m, 각각). 또한, SLO에 초점 및 채도 수준을 높은 매개 변수 선택 및 눈의 올바른 정렬에 의존 합니다. 또한, 인간의 눈;에 비해 쥐에서 인간 환자는 마우스 눈의 더 높은 총 광학 힘 인 도전 위해 고안 된 장치를 사용 하 여 이 또한 다른 사람의 사이에서 마우스 렌즈에 의해 확대에 따라 확대 부정확7, 측면을 발생할 수 있습니다. 그러나, 축 검사 위치에 불구 하 고 측면 배율에 따라 달라 집니다, 그리고 축 SD 10 월 측정은 정확 하 게8.
Introduction
실험적인 안과에서 망막 병 리의 검사 일반적으로 조직학 기술을 사용 하 여 평가 합니다. 그러나, 조직학 동물 euthanization를 요구 하 고 조직의 실제 속성 변경 발생할 수 있습니다. SD-10 월과 SLO 정기적으로 사용 됩니다 임상 안과에서 진단 목적을 위해 여러 망막 질환 당뇨 황 반 부 종9, 앞쪽 허 혈 성 시 신경 병10또는 망막 화11 등의 모니터링 . SD-10 월과 SLO 추가 개입 없이 넓혀 진된 눈동자를 통해 시각화 되는 망막의 고해상도 이미지를 생성 하는 비-침략 적 기술이 있습니다. SD-10 월 SLO 입체 이미지는 망막의 생산 형광 데이터를 수집 하는 동안 망막의 단면 이미지를 만들려고 backscattering 데이터를 수집 하 여 망막 구조와 망막 두께의 정보를 제공 합니다. 요즘, 모두는 점점 작은 설치류12,13,,1415 (또는 심지어 zebrafish16,17)를 사용 하 여 실험 안과에서 사용 기술과 수 있습니다. 모두 질적 및 양적 정보12,,1718,,1920,21을 제공 합니다.
Lipofuscins 같은 내 생 fluorophores의 축적 또는 망막에 드루의 형성 자동 형광 신호 SLO에 의해 구상 될 수 있다. 이 특징은 SLO 진단 및 연령 관련 황 반 변성 등 망막 화22,23망막 질병의 모니터링을 위한 귀중 한 기술. 실험적인 안과에 자동 형광 이미징 (AF) 기자 마우스 라인에서 특정 세포 유형의 탐지에 대 한 사용할 수 있습니다. 예를 들어 마우스 Cx3cr124 의 발기인에서 gfp의 표현을 위한 heterozygous microglia/대 식 세포의 수사를 위해 정상적인 망막에 microglial 세포의 생체 내에서 시각화 한 유리는 망막 질병21역학입니다. Microglia는 조직의 항상성 및 부상1,,2526시 조직 복구에 중요 한 역할을 하는 망막의 상주 대 식 세포는. Microglia 활성화는 망막에 허 혈, 망막 부상과 변성, 망막 질병2,3,,45, 에서이 세포의 역할을 제안 보고 되었습니다. 6.
현재의 프로토콜의 목적은 망막 이미징 및 SD-10 월를 사용 하 여 망막 두께의 측정에 대 한 사용 하 여 Cx3cr1gfp/gfp 마우스 망막 gfp 긍정적인 microglia 셀의 시각화를 위한 비교적 간단한 방법 설명 하는 SLO (하이델베르크 Spectralis HRA + 10 월 시스템). 이 프로토콜은 다양 한 마우스 라인에서 건강 또는 질병 망막의 이미징 및 두께 측정을 위해 활용할 수 있습니다. 또한, 형태학 분석 식별 및 정량화 microglia 숫자 및 SLO21을 사용 하 여 망막에 microglia 활성화에 대 한 수행할 수 있습니다. Microglia 세포 망막27,,2829를 포함 하 여 중앙 신경 시스템 (CNS)에 퇴행 성 질환과 연결 됩니다. 따라서, 현재 프로토콜에서 사용 하는 두 가지 방법을 조합 하 여 microglia 유통 및 망막 변성의 상관 관계 만들 수 있는 모니터링 질병의 심각도 촉진할 수 있다 또는 vivo에서접근의 치료 효과.
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Protocol
모든 절차, BALB/c 성인 남성 및 여성 쥐 Cx3cr1의 발기인에서 gfp 익스프레스 누가 사용된 24 했다. 마우스 ARVO 성명에 따르면 안과 및 비전 연구에 있는 동물의 사용에 대 한 치료 하 고 모든 절차는 동물 복지에 스위스 연방 규정에 따르면 스위스 정부에서 승인 했다. 마우스는 medetomidine 염 산 염 (0.75 mg/kg)과 케 타 민 (45 mg/kg)의 피하 주입에 의해 취 했다. 적절 한 마 취 호흡 속도 동물을 모니터링 하 여 확인 되었다 ' 꼬리 핀치에 대 한 s 반응. 실험의 끝에, 쥐와 CO 2 흡입 안락사 되었다.
참고: 이미징 각 세션 (최대 20 분) 가능한 한 빨리 수행, 백 내장 형성 이후 다음 마 취 망막 시각화 30을 방해 수 있습니다.
1. 시스템 구성
- 컴퓨터를 켭니다.
- 전원 공급 장치를 켭니다. 메시지 " 시작 수집 모듈 " 장치의 제어판 화면에 나타납니다.
- 소프트웨어를 작동 하는 소프트웨어의 바탕 화면 바로 가기를 두 번 클릭.
- 데이터베이스 보기에서 클릭는 " 환자를 추가 " 아이콘.
- 팝업 창에서 필요한 모든 정보를 삽입 (성, 이름, 제목, 생년월일, 성별, 및 환자 ID)를 클릭 하 고 " 확인 ". 팝업 창에서 2 mm 각 막 곡률을 설정 하 고 " 확인 ".
- 표준 30 ° 시 앞 78 D 표준 안과 콘택트 슬릿 램프 렌즈를 놓고 테이프로 안전 하 게 그것을 건다.
- 장치의 왼쪽에 있는 필터 레버는 표시에 위치 확인 " A " IR + 10 월 및 ( 그림 1) 이미징 어.
2. 마우스 준비
- 0.75 mg/kg와는 케 타 민 medetomidine 염 복용량을 사용 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) 마 취 솔루션 준비에 45 mg/kg의 복용량. 따라서, 20 g 마우스에 대 한 medetomidine 염 산의 15 µ L 18 µ L의 PBS에서 50 µ L의 최종 볼륨을 마 취 제와 혼합. 솔루션 4 ° C에서 최대 1 주일까지 저장.
- 아저씨에 의해 마우스를 파악 하 고 눈동자 팽창 시킴을 달성 하기 위해 각각의 눈에 한 방울 tropicamide 0.5% + phenylephrine 염 2.5% 적용.
- 구속, 마우스를 유지 하 고 30 G 바늘에 연결 된 인슐린 주사기, 피하 주사 마 취 솔루션의 50 µ L. 생리대 위에 배치 된 그것의 감 금에서 다시 마우스를 넣어. 마우스 완벽 하 게 진정 될 때까지 3-5 분을 기다립니다. 마 취 깊이 평가, 마우스의 꼬리를 꼬집어. 마우스 각 막을 면봉으로 부드럽게 터치 하 여 각 막 반사를 확인 합니다. 없는 긍정적인 반사를 관찰 하는 경우는 영상 계속.
참고: 그것은 마 취 동안 호흡 속도 모니터링 하는 것이 중요입니다. 마우스 완벽 하 게 진정 하지 고통 스러운 자극에 따라 호흡 속도 증가 합니다. - 수화물 2 %hydroxypropylmethylcellulose 응용 프로그램과 함께 마우스 각 막 각 눈에 떨어진다.
3. SD-10 월
- 소자의 턱 받침대 ( 그림 1)에 연결 된 맞춤 플랫폼에 약 32 ° C의 온난 화 패치를 배치.
- 오른쪽 눈 이미지를 플랫폼 ( 그림 1)의 왼쪽된 부분에 마우스를 놓습니다. 마우스의 오른쪽 궤도 렌즈 얼굴과 신체 거짓말 플랫폼의 왼쪽된 부분에는 경향이 확인 하십시오.
- 오른쪽 눈에 hydroxypropylmethylcellulose의 방울을 적용 하 고 신중 하 게 그것은 + 4 디 옵 터 엄밀한 가스 침투성 콘택트 렌즈 위치 (구형 전원: +25.00 디 옵 터에-25.00). 균형 잡힌된 소금 솔루션 (BSS)에 콘택트 렌즈를 저장 합니다. 렌즈를 잡아,를 사용 하 여 플라스틱 또는 실리콘 집게 손상을 방지.
- 수집 모듈 ( 그림 2A에 녹색 상자)을 시작 하는 컨트롤 패널 디스플레이의 오른쪽에 노란 상자를 누릅니다. 노란색 상자는 녹색 켜 집니다 고 컨트롤 패널 메뉴 화면 ( 그림 2A)에 표시 됩니다.
- B 검사의 인수, 컨트롤 패널 ( 그림 2A)에 IR + 10 월 옵션을 선택 합니다. 선택한 설정 컨트롤 패널에서 파란색으로 강조 표시 됩니다.
- 선택 " 망막 "에서 " 응용 프로그램 및 구조 " 소프트웨어에 이동 마우스 눈으로 렌즈에 사용 하 여는 micromanipulator 장치 ( 그림 1). 망막에 초점을 맞추고, 전에 확인 표시 " OD " 스크린의 왼쪽된 하단 부분에 선택. 소프트웨어는 자동으로 왼쪽 (OS)를 식별 하 고 오른쪽 (OD) 눈은 목표의 위치에 따라.
참고: 목표는 플랫폼의 중간에 위치 하는 경우 화면 하단에 오류 메시지가 표시 됩니다. 이 경우, 다시 마우스를 놓고 약간 때까지 올바른 눈을 인식 하는 소프트웨어. - 초점 손잡이와 초점을 망막에 큰 배는 명확 하 게 컴퓨터 화면 왼쪽에 저 이미지에서 볼 때까지. 카메라는 micromanipulator 왼쪽 또는 오른쪽, 그 방향으로 카메라를 이동 또는 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로, 최대 또는 아래로, 각각 카메라를 이동 하 여 이동.
참고: 플랫폼에서 마우스 위치를 변경 하거나 적외선 이미지에서 시 신경 머리의 선호 지역화를 달성 하기 위해 렌즈 위쪽으로 또는 아래쪽으로 이동. - 시계 반대 방향으로 줄이기 위해 또는 저 이미지의 밝기를 증가 하는 방향으로 감도 조절기를 돌립니다. 최적의 초점을 달성 하는 경우는 SD-10 월 B-스캔 화면 오른쪽에 나타납니다.
참고: B-스캔 초점을 조정 하 여 구상 될 수 없습니다, 경우 키보드 조합 Ctrl + Alt + Shift + O를 누릅니다. 팝업 창에서 값을 조정 하는 참조 팔의 B-스캔 화면에 나타날 때까지. - 화면의 오른쪽 하단에 패턴 메뉴 (한 줄 그림 2b에서)에서 단일 검색을 선택 하십시오.
- Micromanipulator 장치 ( 그림 1)의 왼쪽, 오른쪽, 앞으로, 또는 (그 방향으로 카메라를 설정)을 뒤로 돌려 B-스캔 위쪽과 아래쪽 사이 위치 되도록 모서리의 SD-스캔 창.
- 적어도 9 높은 품질의 이미지를 자동 실시간 (미술) 값 설정.
참고: 예술 여러 연속 스캔을 평균 하 여 이미지 품질을 향상 시킵니다. 높은 " 예술 " 가치, 높은 신호 대 잡음 비율 그리고 이렇게 이미지 품질. 그러나, 증가 하 여는 " 예술 "는 획득 가치 시간 또한 증가. - 보도 " 취득 " ( 그림 2) 제어판 화면에 버튼 하 고는 이미지.
- 왼쪽된 눈 이미지 및 반복 단계 3.2-3.12 마우스 위치.
- 플라스틱/실리콘 집게로 콘택트 렌즈를 제거 하 고 그것은 BSS.
- Hydroxypropylmethylcellulose의 신선한 드롭 마우스 각 막 수 화와 티슈 페이퍼와 초과 제거.
- 시계 반대 방향으로 회전 하 여 표준 30 ° 광 제거.
- 55 ° 렌즈를 탑재 하 고 각 눈에 대 한 단계 3.4-3.12 반복.
4. 형광 이미징 자동
- 플랫폼에서 마우스를 이동 하지 않고 제어판에서 IR을 선택 합니다.
- 초점 손잡이와 큰 망막 혈관에 초점.
- 컨트롤 패널에서 AF를 선택 합니다.
- 감도 노브를 시계 반대 방향으로 줄이기 위해 설정 또는 이미지의 밝기를 증가 하는 방향으로.
- 감도 손잡이 누르고 설정에 " 예술 " 67 이상의 높은 품질을 얻으려면 이미지 값.
- 때 세트 " 아트 " 값에 도달 했습니다, 눌러 " 취득 " 이미지를 얻으려면 제어판에서. 감도 노브를 다시 평균 중지를 누릅니다. 다른 망막 레이어를 시각화 하려면 초점 조정.
- 55 ° 렌즈를 제거 하 고 넓은 분야 102 ° 렌즈를 탑재. 4.1 단계 – 4.6 각 마우스의 두 눈에 대 한, 모든 마우스.
- 클릭 “ 이미지 저장 ” 창과 클릭의 왼쪽된 상단 테두리에 “ 종료 ”. 컴퓨터에 이미지를 저장 하려면 마우스 이름을 두 번 클릭 하 여 마우스 화면 오른쪽 부분에 있는 목록에서 선택 합니다. 별도로 각 이미지를 두 번 클릭 한 다음 플로피 디스크 아이콘을 클릭 합니다. .Tif,.bmp,.jpg 또는.png 원하는 폴더에로 이미지를 저장 합니다. 소프트웨어 보도 종료 하려면 “ 파일 ” 및 “ 종료 ”.
5. 마 취 반전
- 마우스 눈 hydroxypropylmethylcellulose의 한 방울을 수 화와 생리대에 마우스 반환.
- 준비 atipamezole 솔루션 medetomidine 염 산 염의 진정 효과를 2.25 mg/kg의 복용량에. 20 g 마우스에 대 한 150 µ L PBS의 최종 볼륨을 사용 하 여 atipamezol의 9 µ L을 추가 합니다. 솔루션 4 ° C에서 최대 1 주일까지 저장.
- 분 마 취 주입 (2.2 단계), atipamezole 솔루션의 150 µ L를 피하 주사 후.
- 마 취에서 회복 될 때까지 마우스를 모니터링합니다. 때 마우스는 완전히 복구 (5-10 분 atipamezole 주입 후) 다시는 새 장에 넣어. 한쪽에 누워 때 그 시체를 설정 하는 동물의 능력에 의해 복구 표시 됩니다 활동, 산책 및 환경 자극에 대 한 응답에서 반응의 회복.
6. SD-10 월 이미지에서 수동 망막 두께 측정
- OCT 검사는 동물의 이름에 더블 클릭 하 여 엽니다.
- B-스캔 30 ° 또는 55 ° 렌즈와 함께 얻은 열.
- 선택 " 두께 프로 파일 ".
- 보도 " 레이어 세그먼트 편집 " 아이콘 ( 그림 2B). 소프트웨어 자동으로 내부 제한 식별 하 고 기지 막.
- 필요한 경우는 수동으로 해결 한다 내부 제한의 위치 그리고 막 기초. 이렇게 하려면 화면 그리고 빨간색 동그라미 옵션 ( 그림 2B)의 왼쪽에서 수정할 레이어를 선택 합니다. 이동 마우스 버튼으로 원 선 수정 누르면.
- 올바르게 해당 레이어를 줄을 수정 합니다. 클릭 " 저장 하 고 닫습니다 " 창 종료.
참고: 맥락 막의 반사도, 인해 소프트웨어 식별할 수 있습니다 하지 기본 막 제대로. 따라서, 그것은 망막 두께 측정을 진행 하기 전에 그것을 수동으로 정의 하는 것이 좋습니다. - 선택 " 망막 " 아래는 " 계층 " 옵션. 망막 두께의 다이어그램 화면 하단에 표시 됩니다.
- 망막 두께 (µ m에 표시 됨) 볼 B-스캔 또는 다이어그램에서 다른 위치에 선택 된 위치에 대 한 클릭 하십시오.
- 시 신경 머리에서 원하는 거리에 망막 두께 측정 하 고 스프레드시트에 값 복사.
- 5.1-5.9 30 °와 55 ° 렌즈 각 마우스에 대 한 단계를 반복.
- 원하는 소프트웨어와 통계 분석을 수행.
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Representative Results
여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, SD-10 월 스캔 하 고 SLO 이미지 같은 이미징 세션에 Cx3cr1gfp/gfp 마우스에서 입수 했다. 그림 3 에 대표 SD-10 월 단일 검사는 30 °와 55 ° 렌즈 (그림 3A) 또는 대표 SLO 이미지 얻은 gfp 긍정적인 microglia 셀 시각화는 55 ° 또는 102 ° 렌즈와 함께 얻은 포함 되어 있습니다. 맥락 막의 높은 반사도 SD 10 월에서 관찰 검사 30 ° 55 ° 렌즈에 비해 얻은. 그러나, 망막 건축 30 °와 55 ° 이미지 (그림 3, 오른쪽 확대 이미지)에서 분명 하다. 망막 경계 수동 수정 후 (내부 제한 막 기반), 시 신경 머리 ( 에서에서 같은 거리에서 측정할 때 망막 두께 측정의 좋은 상관 관계 30 o 와 55 ° 렌즈 사이 관찰 되었다 그림 3C; 피어슨 상관 관계 0.967 p = < 0.0001). 이전 연구 조직학 망막 섹션15,31 에 따라서 SD 10 월 측정 ex vivo와 SD 10 월 검사 상관에 망막 두께 측정 비-침략 적 기법으로 사용할 수 있습니다. 대 한 망막 두께 측량. 그러나 SLO를 사용 하 여 우리가 식별할 수 있는 gfp 긍정적인 microglia 셀 자동 형광 이미지에서 hyperreflective 신호 넓은 필드 102 ° 렌즈 55 ° 렌즈에 비해 더 큰 저 영역을 커버 수 있었다. SLO는 망막 microglia 셀 배포 및 활성화 기능 fractalkine 수용 체와 기자 쥐에서의 모니터링에 대 한 또한 이용 될 수 있다 (Cx3cr1gfp / + 마우스) 정상 또는 병에 걸리는 망막12, 21,32. 같은 이미징 세션에서 SLO와 SD 10 월의 조합 microglia 배포 및 망막 변성에 활성화에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다 그리고 쥐21망막 질병을 모니터링 하기 위한 도움이 될 수 있습니다.
그림 1: 현재 연구에 사용 된 장치의 대표 이미지. 마우스의 오른쪽 눈 이미지를 마우스 오른쪽 궤도 렌즈와 플랫폼의 왼쪽된 부분에 발생 하기 쉬운 거짓말 그 시체와 함께 맞춤 플랫폼의 왼쪽된 부분에 배치 됩니다. 플랫폼의 높이 (낮은 플랫폼)을 시계 방향으로 돌려 조정 또는 시계 반대 방향으로 (하기 플랫폼) 될 수 있습니다 "턱 나머지 조정". 필터 레버 "a" IR + 10 월 및에 어 이미징 수 있도록 배치 해야 합니다. (그림에는 표시 되지 않음) 초점 손잡이로 실험 스캐너의 초점을 변경할 수 있습니다. micromanipulator 제대로 조명 하 고 높은 품질의 이미지에 대 한 망막을 정렬에 사용할 수 있습니다. 목적은 수 이동 최대, 아래로, 오른쪽, 또는 카메라 핸들 왼쪽. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 디바이스의 컨트롤 패널의 그림. (A) 수집 모드를 선택할 수 있는 컨트롤 패널 디스플레이의 왼쪽된 부분에 (적외선, IR, 자동 형광, AF 또는 indocyanine 녹색 제품은, ICGA; 결합 또는 하지 광학 일관성 단층 촬영, 10 월). 패널의 가운데 부분에 수집 설정 (IF 이미지, 섹션 또는 볼륨 검사의 강도) 선택할 수 있습니다. 보기의 필드 로드 렌즈에 의해 결정 됩니다. 감도 손잡이와 IR 또는 어 이미지의 밝기를 조정할 수 있습니다. 감도 손잡이 눌러, 소프트웨어는 높은-품질의 이미지를 제공 하는 IR 또는 AF에서 얻은 이미지를 평균 시작 됩니다. (B) 그림 수집 패턴 메뉴의. (C) 해당 아이콘으로 소프트웨어에서 사용 되는 기능의 요약입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 10 월 검사와 자동 Cx3cr1gfp/gfp 마우스 망막의 형광 이미지. (A) B-55 ° (위 패널) 또는 30 ° 렌즈 (하단 패널)으로 얻은 마우스 망막의 검사. 노란 박스의 높은 배율 오른쪽 패널에 표시 됩니다. (B) 55 °와 102 ° 렌즈 (왼쪽 및 오른쪽 패널, 각각) 얻은 Cx3cr1gfp/gfp 쥐의 망막에 gfp 긍정적인 microglia 셀의 이미지. (C) 망막 두께 측정, 시 신경 머리 30 °와 55 ° 렌즈에서 파생 된 SD 10 월 검사에서에서 같은 거리에 측정. 두 렌즈 사이 좋은 상관 관계 관찰 되었다 (피어슨 상관 관계 = 0.967). 바 규모: 200 µ m, 100 µ m에 확대 SD 10 월 이미지 (A, 오른쪽 패널). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
현재 문서에서는 망막 B-스캔의 수집과 같은 이미징 세션에서 마우스 망막에 gfp 긍정적인 microglia 분포의 이미징에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다. SD-10 월과 SLO는 점점 사용 망막 질환의 동물 모델에서10,,1417,18,21이상 망막 변경의 정보를 제공 하. 이 프로토콜, Cx3cr1gfp/gfp 또는 Cx3cr1gfp / + 마우스 망막 비 접촉 이미지 수와 망막 두께의 정보를 얻을 수 있습니다. 이것은 질병의 심각도 시간이 지남에 변경 또는 치료 치료 테스트 때 망막 질병 실험 모델에서 매우 중요 하다입니다. 또한, 프로토콜 망막에 형광 세포의 생체 내에서 영상에 대 한 기자 마우스 라인을 활용 하는 방법을 설명 합니다.
그러나, 여기에 제시 된 프로토콜에는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 인간을 위해 설계 된 장치에서 마우스 망막의 영상 확대 부정확7측면으로 이어질 수 있는 마우스 눈의 더 높은 총 광학 힘 때문 전하실 수 있습니다. 그러나, 축 SD 10 월 측정은 정확 하 게8. 또한, 소프트웨어의 "참조 설정" 옵션을 사용 하 여 마우스에 따라 시험 플랫폼에 마우스의 하지 고정된 위치 때문에 다소 어려운 이며 따라서 마우스 망막의 경도 이미징 도전적 일 수 있다. 눈의 세로 정렬 시 신경 적외선 이미지의 중심에 위치 하 고 다음 원하는 이미지를 획득 하 여 얻을 수 있습니다. 아이 회전에 대 한 수정, SD 10 월 en 얼굴 이미지의 수동 정렬 취득 후 수행할 수 있습니다과33설명 되어 있는 대로 두께 측정에 적용 있습니다. 현재 프로토콜에 사용 되는 이미징 시스템 외 다른 이미징 시스템도 개발 되었습니다 콘택트 렌즈를 사용 하지 않고 더 큰 망막 영역 이미지 수 있습니다 큰 각도 제공 하는. 예를 들어 Optos 큰 망막 표면을 커버 수 있지만 현재에 사용 되는 장치에 비해 큰 이미지 가변성 연구34. 이러한 제한에도 불구 하 고 현재 프로토콜 망막 질병의 여러 실험 모델에서 활용할 수 있습니다. 얻을 수 있는 정보는 망막 두께 변경 (붓기, 위축), 망막 분리의 탐지 또는 hyperreflective 점 및 fluorophore 표시 된 셀 및 증가의 존재 또는 그들의 숫자의 감소를 포함 합니다.
Cx3cr1 의 식 heterozygous 쥐에는 두 가지 방법의 조합 (Cx3cr1gfp / +), vivo에서 동시에 검색 하기 위해 실험을 수 있는 기능 fractalkine 수용 체 망막 질병 이나 부상 하는 동안 (예를 들어, 망막 부 종, 망막 위축) 망막 이상이 주변 실시간 및 가능한 microglia 축적에 망막 무결성의 변경. 또한, 형태학 분석을 적용 하 여 microglia 활성화 상태 소마 크기에 따라 평가 될 수 있다 그리고 복잡성 microglia의 처리21. 망막 질환, 망막 정 맥 폐색 등에서 활성화 및 망막 위축 사이트에 microglia/대 식 세포의 축적 관찰 되었습니다27. 또한, 마우스에 결함이 Nr2e3 유전자 (핵 수용 체 Subfamily 2 그룹 E 회원 3)에 대 한, recessively 상속의 마우스 모델 향상 된 S 콘 감도 증후군 (ESCS), 외부 핵 층 (rosettes) 접는 초기에 관찰 될 수 있다 출생 후 일입니다.
흥미롭게도, microglia 세포는 근 엽 내부 찾을 수 있습니다 그리고 그것은 해당 microglia 이러한 마우스35,36의 망막에서 관찰 하는 대뇌의 퇴보에 기여할 수 있습니다 제안 되었습니다. Microglia의 활성화의 과정에 연루 되어 이후 다양 한 망막 질병의 때로는 망막 건축10,,2737,38 변경 동반 , SD-10 월과 SLO의 조합 microglia 활성화 및 망막 변성 사이의 상관 관계를 밝힐 수 있다. 어떤도 전에 불구 하 고 현재 프로토콜 경도, 그러한 정보를 제공할 수 있습니다 및 따라서 그것 microglia 배포/활성화와 망막 손상의 상관 관계 및 치료 치료의 모니터링에 대 한 가치가 있을 것 이라고 효과21.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (SNSF, #320030_156019)의 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자는 하이델베르크 엔지니어링 GmBH, 독일에서에서 비재무 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
| 78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
| Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
| ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
| medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
| ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
| tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
| Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
| hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
| +4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
| balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
| silicon forceps | N/A | N/A | |
| atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |
References
- Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
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