Usando In Vivo e del tessuto e delle cellule Explant approcci per studiare la morfogenesi e la patogenesi dell'Aorta embrionale e perinatale
Summary
Protocolli per lo studio dell’aorta murino embrionale e perinatale, usando in vivo analisi clonale e destino mapping, espianti aortiche e muscolo liscio isolato cellule sono dettagliate qui. Questi diversi approcci l’espletamento dell’indagine della morfogenesi dell’aorta embrionale e perinatale nello sviluppo normale e la patogenesi in malattia.
Abstract
L’aorta è la più grande arteria del corpo. La parete aortica è composto da uno strato interno di cellule endoteliali, uno strato intermedio di alternanza di lamelle elastiche e cellule muscolari lisce (CML) e uno strato esterno di fibroblasti e la matrice extracellulare. In contrasto con lo studio diffuso di modelli patologici (ad es., aterosclerosi) nell’aorta adulto, molto meno è conosciuto circa l’aorta embrionale e perinatale. Qui, ci concentriamo su SMCs e fornire protocolli per l’analisi di morfogenesi e patogenesi di SMCs aortico embrionale e perinatale nello sviluppo normale e malattia. In particolare, sono i quattro protocolli inclusi: io) in vivo embrionali destino Mappatura e analisi clonale; II) espianto embrionale dell’aorta cultura; III) isolamento di SMC dall’aorta perinatale; e iv) posizionamento sottocutaneo mini pompa osmotica nei topi in gravidanza (o non gravide). Quindi, questi approcci facilitano l’indagine del finale, destino e architettura clonale di SMCs nel aorta in vivo. Essi consentono di modulazione morfogenesi embrionale dell’aorta in utero tramite l’esposizione continua agli agenti farmacologici. Inoltre, espianti di tessuto aortico isolato o SMCs aortico può essere utilizzato per approfondire il ruolo di specifici geni bersaglio durante processi fondamentali quali muscularization, la proliferazione e la migrazione. Questi esperimenti di generazione di ipotesi su SMCs isolato e l’aorta explanted quindi possono essere valutati nel contesto in vivo attraverso approcci farmacologici e genetici.
Introduction
Il sistema circolatorio del funzione di organismi multicellulari a fornire sostanze nutritive e ossigeno alle cellule che sono non a contatto con l’ambiente esterno e per rimuovere i prodotti di scarto e biossido di carbonio da queste cellule. Nei vertebrati, il sistema circolatorio primario consiste del cuore, che pompa il sangue attraverso una serie di vasi sanguigni. Le pareti dei vasi sanguigni, come arterie e vene, sono costituiti da tre strati: i) la biancheria intima, o strato interno delle cellule endoteliali; II) la media, o strato intermedio della alternando circonferenzialmente allungata in cellule muscolari lisce CML e lamelle elastiche; e iii) il adventitia, o strato esterno del tessuto connettivo e fibroblasti. La stragrande maggioranza degli studi nella biologia vascolare concentrarsi sulle cellule endoteliali, indagando la formazione di nuovi tubi alberati su cellule endoteliali attraverso l’angiogenesi. In confronto, SMCs ricevuto relativamente poca attenzione. Tuttavia, Paesi del Mediterraneo meridionale sono un tipo di cellula fondamentale nella costruzione della parete arteriosa normale e nella patologia vascolare.
L’aorta è l’arteria più grande calibro nel corpo, ricevendo il sangue arterioso dal ventricolo sinistro del cuore. È afflitto da patologie umane, tra cui l’aterosclerosi, aneurisma e dissezione. Negli organismi adulti, l’aorta ed i relativi rami principali sono intensamente studiati nei modelli della malattia vascolare. Per esempio, dieta grassa alta alimentato i topi che sono null per il gene che codifica il recettore di lipoproteina a bassa densità o dell’apolipoproteina E, sviluppano l’aterosclerosi, e recenti studi di mappatura destino indicano che pre-esistenti SMCs dar luogo a più tipi di cellule nella la placca aterosclerotica1. In aneurismi aortici, alterazioni patologiche sono SMC apoptosi e2,3di rimodellamento della matrice extracellulare.
Sostanzialmente di meno è conosciuto per quanto riguarda la morfogenesi SMC e patogenesi durante il periodo embrionale e perinatale. Qui, forniamo protocolli per studiare embrionali e perinatale aortica SMCs in vivo, in espianti di tessuto e in cellule isolate. Per esempio, la prima sezione del protocollo delinea destino Mappatura e analisi clonale in topi embrionali. Cre ricombinasi espresso sotto il controllo di un promotore di cellula-specifico facilita la marcatura di cellule specifiche e la loro progenie4,5,6; Tuttavia, il controllo temporale della cellula-specifico di etichettatura può essere impegnativo durante lo sviluppo embrionale nei topi. In questo contesto, con embrioni che esprimono il condizionale CreER sotto un promotore attivo nei paesi del Mediterraneo meridionale (e.g.,Myh11 o Acta2) e un reporter di Cre, forniamo i metodi per l’iniezione di tamoxifene o del suo metabolita attivo 4-OH-tamoxifen in dighe incinte e per analizzare le cellule con etichettate in embrioni o prole postnatale. Inoltre, in contrasto con gli studi di mappatura del destino, che prevalentemente utilizzano Cre reporter con un singolo giornalista fluoroforo1,7, analisi clonale è sostanzialmente migliorata con i giornalisti di Cre multi-colori.
Le sezioni di seconda e terza del protocollo descrivono metodi per isolare e coltura embrionale espianti aortiche e SMCs aortico da neonati, rispettivamente. Questi approcci consentono per la manipolazione delle vie di segnalazione, in particolare in espianti aortiche o paesi del Mediterraneo meridionale e per analizzare gli effetti diretti degli agenti farmacologici. Così, il ruolo di geni specifici nel tessuto di interesse può essere selezionato in modo molto più rapido rispetto attraverso manipolazioni genetiche tradizionale nei topi. Inoltre, gli studi SMC isolati facilitano l’analisi della migrazione cellulare e adesione, che sono tecnicamente limitato in vivo.
Infine, la quarta sezione di protocollo delinea il posizionamento di una mini-pompa osmotico sottocutaneo caricato con agenti farmacologici nei topi in gravidanza (o non gravide). Questo metodo facilita l’analisi dell’effetto sullo sviluppo embrionale causato da agenti che richiedono infusione continua a causa del rapido metabolismo. L’alternativa di frequenti iniezioni non è pratico per molti agenti e dovrebbe essere evitato, in quanto può causare disagio significativo nella diga incinta.
Protocol
Representative Results
Discussion
In contrasto con le vaste indagini di murino aorta ed i relativi rami principali in adulte condizioni patologiche, quali modelli di aterosclerosi, di meno è conosciuto per quanto riguarda la morfogenesi e la patogenesi dell’aorta embrionale e perinatale. Qui, ci concentriamo sull’aorta embrionale/perinatale, in particolare i paesi del Mediterraneo meridionale e fornire protocolli per studiare l’aorta attraverso in vivo, espianto di tessuto, e isolamento di SMC si avvicina. Questi approcci gratuiti forniscono l’…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Dean Li per la condivisione di protocollo del suo laboratorio per aortica SMC isolamento. Sostegno finanziario è stato fornito dal National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 e R01HL133016 a D.M.G), l’American Heart Association (sovvenzione dai 14GRNT19990019 a D.M.G) e Yale University (Brown-Coxe Fellowship di A.M. e avvio fondi per D.M.G).
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
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