Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal
Summary
Protocolos para o estudo da aorta murino embrionária e perinatal usando na vivo clonal análise e mapeamento de destino, explantes aórtica e isolado músculo liso, células são detalhadas aqui. Essas diversas abordagens facilitam a investigação sobre a morfogênese da aorta no normal desenvolvimento embrionária e perinatal e a patogênese na doença.
Abstract
A aorta é a maior artéria do corpo. A parede da aorta é composta por uma camada externa de fibroblastos e a matriz extracelular, uma camada média de alternância de lamelas elásticas e células musculares lisas (SMCs) e uma camada interna de células endoteliais. Em contraste com o estudo generalizado dos modelos patológicos (por exemplo, aterosclerose) na aorta adulto, muito menos é sabido sobre a aorta embrionária e perinatal. Aqui, focalizamos SMCs e fornecer protocolos para a análise da morfogênese e patogênese da SMCs aórtica embrionários e perinatais em desenvolvimento normal e a doença. Especificamente, os quatro protocolos incluídos são: eu) na vivo embrionário destino mapeamento e análise clonal; II) cultura de aorta embrionárias explante; III) isolamento de SMC da aorta perinatal; e iv) colocação de bomba mini osmótica subcutânea em ratos grávidas (ou não-grávidas). Assim, essas abordagens facilitam a investigação da origem, destino e arquitetura clonal de SMCs no aorta em vivo. Eles permitem modulação aorta embrionárias morfogênese no útero por exposição contínua a agentes farmacológicos. Além disso, tecidos aórtico isolado explants ou SMCs aórtica podem ser usadas para obter insights sobre o papel dos alvos do gene específico durante processos fundamentais, tais como muscularization, proliferação e migração. Estas experiências de geração de hipótese SMCs isolados e a aorta explantada então podem ser avaliadas no contexto na vivo através de abordagens farmacológicas e genéticas.
Introduction
Os sistemas circulatórios de função de organismos multicelulares para fornecer nutrientes e oxigênio para as células que são não em contato com o ambiente externo e para remover resíduos de produtos e de dióxido de carbono dessas células. Nos vertebrados, o sistema circulatório principal consiste no coração, que bombeia sangue através de uma série de vasos sanguíneos. As paredes dos vasos sanguíneos grandes, tais como as artérias e veias, consistem em três camadas: eu) a íntima, ou camada interna de células endoteliais; II) a mídia, ou camada média de alternância circunferencialmente alongadas células musculares lisas SMCs e lamelas elásticas; e iii) a adventícia, ou camada externa de tecido conjuntivo e fibroblastos. A grande maioria dos estudos em foco de biologia vascular em células endoteliais, investigando a formação de novos tubos de endoteliais célula-alinhado a angiogênese. Em comparação, a SMCs recebem relativamente pouca atenção. No entanto, SMCs são um tipo de célula fundamental na construção da parede arterial normal e em patologias vasculares.
A aorta é a artéria de maior calibre do corpo, recebendo o débito cardíaco do ventrículo esquerdo do coração. Ele está aflito por diversas doenças humanas, incluindo a arteriosclerose, aneurisma e dissecação. Em organismos adultos, a aorta e seus ramos principais são intensamente estudados modelos de doença vascular. Por exemplo, alta dieta gorda alimentou ratos que são nulos para o gene que codifica o receptor da lipoproteína de baixa densidade ou apolipoproteína E, desenvolver aterosclerose, e estudos de mapeamento de destino recentes indicam que SMCs pré-existentes dão origem a vários tipos de células no placa aterosclerótica1. Em aneurismas da aorta, as alterações patológicas incluem SMC apoptose e remodelação de2,3da matriz extracelular.
Substancialmente menos é conhecido sobre a morfogênese SMC e patogênese durante os períodos embrionários e perinatais. Aqui, nós fornecemos protocolos para o estudo embrionário e perinatal da aorta SMCs na vivo, em explantes de tecidos e de células isoladas. Por exemplo, a primeira seção do protocolo delineia destino mapeamento e análise clonal em camundongos embrionários. CRE recombinase expressado sob o controle de um promotor específico células facilita a marcação de células específicas e sua progênie4,5,6; no entanto, controle temporal de células específicas de rotulagem pode ser desafiador durante o desenvolvimento embrionário em camundongos. Neste contexto, com embriões expressando a CreER condicional sob um promotor ativo em SMCs (e.g.,Myh11 ou Acta2) e uma repórter de Cre, nós fornecemos métodos de injeção de tamoxifen ou seu metabólito ativo 4-OH-tamoxifeno em barragens de grávida e para analisar as pilhas etiquetadas em embriões ou prole pós-natal. Além disso, em contraste com os estudos de mapeamento de destino, que predominantemente utilizam Cre repórteres com um único repórter fluoróforo1,7, análise clonal é substancialmente reforçada com repórteres de multi cores Cre.
As segunda e terceiros seções do protocolo descrevem métodos para isolamento e cultivo embrionários explantes da aorta e da aorta SMCs de neonatos, respectivamente. Essas abordagens permitem a manipulação das vias de sinalização, especificamente em explantes aórtica ou SMCs e para analisar os efeitos diretos dos agentes farmacológicos. Assim, o papel de genes específicos no tecido de interesse pode ser projectado de forma muito mais rápida do que através de manipulações genéticas tradicionais em camundongos. Além disso, os estudos isolados de SMC facilitam a análise de migração celular e a adesão, que são tecnicamente limitado em vivo.
Finalmente, a quarta seção do protocolo delineia a colocação de uma bomba mini osmótica subcutânea carregada com agentes farmacológicos em camundongos grávidos (ou não-grávidas). Esse método facilita a análise dos efeitos sobre o desenvolvimento embrionário, causado por agentes que requerem infusão contínua por causa do metabolismo rápido. A alternativa de injeções frequentes não é prática para muitos agentes e deve ser evitada, como pode causar desconforto significativo na barragem grávida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em contraste com as extensas investigações de murino aorta e seus ramos principais em adultos condições patológicas, tais como modelos de aterosclerose, menos é conhecido sobre a morfogênese e a patogênese da aorta embrionária e perinatal. Aqui, nós centrar-se na aorta embrionárias/perinatal, especificamente as SMCs e fornecer protocolos para estudar a aorta através na vivo, explante de tecido, e isolamento de SMC se aproxima. Essas abordagens complementares fornecem o investigador com diversas abord…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dean Li para a partilha de protocolo do seu laboratório para isolamento de SMC da aorta. Apoio financeiro foi fornecido pelo National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 e R01HL133016 para D.M.G), a American Heart Association (14GRNT19990019 brasileira de D.M.G.) e Universidade de Yale (Brown-Coxe Fellowship para A.M. e inicialização fundos para D.M.G.).
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
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