Summary

Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

Published: September 12, 2017
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Summary

Protocolos para o estudo da aorta murino embrionária e perinatal usando na vivo clonal análise e mapeamento de destino, explantes aórtica e isolado músculo liso, células são detalhadas aqui. Essas diversas abordagens facilitam a investigação sobre a morfogênese da aorta no normal desenvolvimento embrionária e perinatal e a patogênese na doença.

Abstract

A aorta é a maior artéria do corpo. A parede da aorta é composta por uma camada externa de fibroblastos e a matriz extracelular, uma camada média de alternância de lamelas elásticas e células musculares lisas (SMCs) e uma camada interna de células endoteliais. Em contraste com o estudo generalizado dos modelos patológicos (por exemplo, aterosclerose) na aorta adulto, muito menos é sabido sobre a aorta embrionária e perinatal. Aqui, focalizamos SMCs e fornecer protocolos para a análise da morfogênese e patogênese da SMCs aórtica embrionários e perinatais em desenvolvimento normal e a doença. Especificamente, os quatro protocolos incluídos são: eu) na vivo embrionário destino mapeamento e análise clonal; II) cultura de aorta embrionárias explante; III) isolamento de SMC da aorta perinatal; e iv) colocação de bomba mini osmótica subcutânea em ratos grávidas (ou não-grávidas). Assim, essas abordagens facilitam a investigação da origem, destino e arquitetura clonal de SMCs no aorta em vivo. Eles permitem modulação aorta embrionárias morfogênese no útero por exposição contínua a agentes farmacológicos. Além disso, tecidos aórtico isolado explants ou SMCs aórtica podem ser usadas para obter insights sobre o papel dos alvos do gene específico durante processos fundamentais, tais como muscularization, proliferação e migração. Estas experiências de geração de hipótese SMCs isolados e a aorta explantada então podem ser avaliadas no contexto na vivo através de abordagens farmacológicas e genéticas.

Introduction

Os sistemas circulatórios de função de organismos multicelulares para fornecer nutrientes e oxigênio para as células que são não em contato com o ambiente externo e para remover resíduos de produtos e de dióxido de carbono dessas células. Nos vertebrados, o sistema circulatório principal consiste no coração, que bombeia sangue através de uma série de vasos sanguíneos. As paredes dos vasos sanguíneos grandes, tais como as artérias e veias, consistem em três camadas: eu) a íntima, ou camada interna de células endoteliais; II) a mídia, ou camada média de alternância circunferencialmente alongadas células musculares lisas SMCs e lamelas elásticas; e iii) a adventícia, ou camada externa de tecido conjuntivo e fibroblastos. A grande maioria dos estudos em foco de biologia vascular em células endoteliais, investigando a formação de novos tubos de endoteliais célula-alinhado a angiogênese. Em comparação, a SMCs recebem relativamente pouca atenção. No entanto, SMCs são um tipo de célula fundamental na construção da parede arterial normal e em patologias vasculares.

A aorta é a artéria de maior calibre do corpo, recebendo o débito cardíaco do ventrículo esquerdo do coração. Ele está aflito por diversas doenças humanas, incluindo a arteriosclerose, aneurisma e dissecação. Em organismos adultos, a aorta e seus ramos principais são intensamente estudados modelos de doença vascular. Por exemplo, alta dieta gorda alimentou ratos que são nulos para o gene que codifica o receptor da lipoproteína de baixa densidade ou apolipoproteína E, desenvolver aterosclerose, e estudos de mapeamento de destino recentes indicam que SMCs pré-existentes dão origem a vários tipos de células no placa aterosclerótica1. Em aneurismas da aorta, as alterações patológicas incluem SMC apoptose e remodelação de2,3da matriz extracelular.

Substancialmente menos é conhecido sobre a morfogênese SMC e patogênese durante os períodos embrionários e perinatais. Aqui, nós fornecemos protocolos para o estudo embrionário e perinatal da aorta SMCs na vivo, em explantes de tecidos e de células isoladas. Por exemplo, a primeira seção do protocolo delineia destino mapeamento e análise clonal em camundongos embrionários. CRE recombinase expressado sob o controle de um promotor específico células facilita a marcação de células específicas e sua progênie4,5,6; no entanto, controle temporal de células específicas de rotulagem pode ser desafiador durante o desenvolvimento embrionário em camundongos. Neste contexto, com embriões expressando a CreER condicional sob um promotor ativo em SMCs (e.g.,Myh11 ou Acta2) e uma repórter de Cre, nós fornecemos métodos de injeção de tamoxifen ou seu metabólito ativo 4-OH-tamoxifeno em barragens de grávida e para analisar as pilhas etiquetadas em embriões ou prole pós-natal. Além disso, em contraste com os estudos de mapeamento de destino, que predominantemente utilizam Cre repórteres com um único repórter fluoróforo1,7, análise clonal é substancialmente reforçada com repórteres de multi cores Cre.

As segunda e terceiros seções do protocolo descrevem métodos para isolamento e cultivo embrionários explantes da aorta e da aorta SMCs de neonatos, respectivamente. Essas abordagens permitem a manipulação das vias de sinalização, especificamente em explantes aórtica ou SMCs e para analisar os efeitos diretos dos agentes farmacológicos. Assim, o papel de genes específicos no tecido de interesse pode ser projectado de forma muito mais rápida do que através de manipulações genéticas tradicionais em camundongos. Além disso, os estudos isolados de SMC facilitam a análise de migração celular e a adesão, que são tecnicamente limitado em vivo.

Finalmente, a quarta seção do protocolo delineia a colocação de uma bomba mini osmótica subcutânea carregada com agentes farmacológicos em camundongos grávidos (ou não-grávidas). Esse método facilita a análise dos efeitos sobre o desenvolvimento embrionário, causado por agentes que requerem infusão contínua por causa do metabolismo rápido. A alternativa de injeções frequentes não é prática para muitos agentes e deve ser evitada, como pode causar desconforto significativo na barragem grávida.

Protocol

todos os protocolos do mouse são aprovados pelo Comité de uso na Universidade de Yale e institucional Cuidado Animal. 1. Clonal análise e mapeamento de destino embrionário In Vivo Nota: nós usamos essas abordagens amplamente para avaliar as origens das células e sua arquitetura clonal em modelos de desenvolvimento e doença 7 , 8 , 9 , <sup cla…

Representative Results

Em uma análise clonal representativa da SMCs em mutante de embriões para o Eln (o gene que codifica a elastina de proteínas da matriz extracelular), Eln(+ /-), Acta2-CreERT2 ratos foram acoplados a Eln(+ /-) ratos também carregando o multi cor ROSA26R(Rb/Rb) repórter. Conforme descrito na etapa 1, plugues foram verificadas, grávidas barragens foram induzidas com uma injeção única tamoxifeno (1,5 mg) em E12.5…

Discussion

Em contraste com as extensas investigações de murino aorta e seus ramos principais em adultos condições patológicas, tais como modelos de aterosclerose, menos é conhecido sobre a morfogênese e a patogênese da aorta embrionária e perinatal. Aqui, nós centrar-se na aorta embrionárias/perinatal, especificamente as SMCs e fornecer protocolos para estudar a aorta através na vivo, explante de tecido, e isolamento de SMC se aproxima. Essas abordagens complementares fornecem o investigador com diversas abord…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Dean Li para a partilha de protocolo do seu laboratório para isolamento de SMC da aorta. Apoio financeiro foi fornecido pelo National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 e R01HL133016 para D.M.G), a American Heart Association (14GRNT19990019 brasileira de D.M.G.) e Universidade de Yale (Brown-Coxe Fellowship para A.M. e inicialização fundos para D.M.G.).

Materials

Tamoxifen Sigma T5648
Corn oil Sigma C-8267 Vehicle for tamoxifen
4-OH-tamoxifen Sigma H7904 Active metabolite of tamoxifen
Progesterone Sigma P8783-5G Use at half the concentration of tamoxifen
OCT compound Sakura tissue tek 4583 For making cryoblocks
Cryomolds Polysciences inc 18986
DAPI Sigma D9542 IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml
Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody Sigma A2547 IHC staining of SMA, final dilution 1:500
Anti-CD31 antibody BD Pharmingen 550274 IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A-11121 IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 Life Technologies a21244 IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 Life Technologies a11008 IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml
DMEM Thermo Fisher Scientific 10567-014 For cell culture
FBS Thermo Fisher Scientific 10437028
Anti-integrin beta3 blocking antibody BD Biosciences 553343 Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml
Collagenase Worthington Biochemical Corp 44H14977A For digesting aorta
Elastase Worthington Biochemical Corp 34K15139 For digesting aorta
Antibiotic-antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Recombinant human FGF Promega G5071
Recombinant human EGF Promega G5021
Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140122
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
Tissue culture plates Corning CLS430165
Alzet osmotic mini-pump Durect Corporation 2001
ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope Nikon
TCS SP5 Leica
Branson Sonifier 450 VWR
Myh11-CreERT2 mice The Jackson Laboratory 19079
Acta2-CreERT2 mice Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2 mice The Jackson Laboratory 8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) mice The Jackson Laboratory 026862
ROSA26R(EYFP/EYFP) mice The Jackson Laboratory 006148
ROSA26R(Confetti/Confetti) mice The Jackson Laboratory 13731
ROSA26R(Rb/Rb) mice Lab of Dr. Irv Weissman Obtained from lab of Dr. Irv Weissman

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Misra, A., Feng, Z., Zhang, J., Lou, Z., Greif, D. M. Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta. J. Vis. Exp. (127), e56039, doi:10.3791/56039 (2017).

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